Bài giảng Công nghệ sinh học động vật

Bài giảng TH CNSHĐV 1 Bài 1 NHẬN DIỆN KHÁNG NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP OUTERLONY I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1. Các khái niệm cần nhớ Miễn dịch là khả năng của cơ thể nhận ra và loại bỏ các vật lạ (kháng nguyên - Ag: Antigen). Từ cổ xưa, người ta đã biết ứng dụng miễn dịch trong việc phòng trừ một số bệnh nhiễm khuẩn, vì thế khái niệm về miễn dịch học đã xuất hiện từ rất sớm. Tuy nhiên, cho tới cuối thế kỷ thứ XIX, miễn dịch học mới trở thành một môn khoa học riêng biệt. Trong lịch sử phát triển của môn miễn dịch học, quan niệm về đáp ứng miễn dịch thay đổi theo tiến bộ của khoa học kỹ thuật và đồng thời nó cũng có mối liên hệ mật thiết với một số ngành khoa học khác như Sinh học phân tử, Y sinh học, Dược học, Thú y, Vi sinh học… Trong cơ thể động vật bậc cao (trong đó có người), đáp ứng miễn dịch có thể tạm chia ra thành hai loại: đáp ứng miễn dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch thu được. Tuy nhiên hai khái niệm này có mối quan hệ mật thiết với nhau. Nói chung, khi có một yếu tố lạ có hại- có thể gây các hiệu ứng sinh hóa (kháng nguyên) xâm nhập vào cơ thể, hệ thống miễn dịch có nhiệm vụ nhận biết và sau đó có những hoạt động có hiệu quả tiếp theo để loại bỏ. Đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch tế bào là hai phương thức mà hệ thống miễn dịch sử dụng để chống lại kháng nguyên. Đối với miễn dịch dịch thể thì kháng thể hòa tan, chính xác hơn là globulin miễn dịch đảm đương chức năng này. Các globulin miễn dịch này được sản xuất từ các tế bào plasma (tương bào), biệt hóa từ lympho bào B. Theo nghĩa rộng thì tất cả các chất nội dịch đều có thể giúp sinh vật chống đỡ lại yếu tố kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể. Tuy nhiên, kháng thể dịch thể được hiểu ở đây là thành phần globulin miễn dịch có trong huyết thanh miễn dịch (thành phần này có khoảng 20% trong huyết thanh). Bài giảng TH CNSHĐV 2 Hình 45 :Sơ đồ cấu trúc phân tử Ig. Về phân loại, người ta chia Ig thành các lớp phân tử sau: + Globulin miễn dịch G (IgG): chiếm khoảng 70-75% tổng số Ig của huyết thanh người. Đây là lớp kháng thể chủ yếu trong đáp ứng miễn dịch và cũng là phân tử độc quyền kháng độc tố. Lớp IgG có vai trò quan trọng nhất trong cơ chế đáp ứng miễn dịch. + Globulin miễn dịch A (IgA): chiếm khoảng 15-20% tổng số Ig trong huyết thanh. Chúng có hai loại là IgA nội dịch huyết thanh và IgA tiết ra ngoài niêm mạc. IgA là phương tiện bảo vệ tại chỗ rất hữu hiệu của cơ thể, ngăn cản sự xâm nhập của kháng nguyên (virus, vi khuẩn, tế bào lạ, các phân tử sinh hóa…) + Globulin miễn dịch M (IgM): chiếm khoảng 10% tổng lượng IgG huyết thanh, chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong những trường hợp nhiễm khuẩn sớm. + Globulin miễn dịch D (IgD): chiếm 1% tổng lượng Ig huyết thanh. Cho tới hiện nay thì chức năng chính của IgD vẫn chưa được xác định rõ ràng, nhưng người ta thường thấy nồng độ của chúng tăng chậm trong những trường hợp nhiễm khuẩn mãn tính nhưng không đặc hiệu cho loại nhiễm khuẩn nào. + Globulin miễn dịch E (IgE): rất ít, chúng chỉ chiếm khoảng 0,004% tổng lượng Ig huyết thanh. Vai trò của IgE là khởi động việc giải phóng các sản phẩm từ tế bào bạch cầu ưa kiềm. Bài giảng TH CNSHĐV 3 2. Phản ứng kháng nguyên- kháng thể IgG trong hệ thống miễn dịch có nhiệm vụ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên. Đây là một trong những chức năng quan trọng nhất bên cạnh các chức năng khác như hoạt hóa bạch cầu, bổ thể, hoạt hóa cơ chế vận chuyển qua màng tế bào… Khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên có được là do cấu trúc đặc biệt của phân tử globulin miễn dịch . Hình 46:Hình cấu trúc không gian của protein kháng thể và cách bắt Ag. Phản ứng in-vitro diễn ra giữa kháng nguyên kháng thể hay còn được gọi là các phương pháp huyết học (serological assays) đã và đang được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh. Sự kết hợp giữa kháng nguyên - kháng thể chính là kết quả của hàng loạt các phản ứng tủa, phản ứng ngưng kết, phản ứng cố định bổ thể và phản ứng miễn dịch đánh dấu. Sản phẩm hóa lý của sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể mà cụ thể là kết quả của phản ứng trung hòa kháng nguyên có ý nghĩa rất lớn và được Bài giảng TH CNSHĐV 4 II. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ - Lame 9 x 8,5cm. - Bộ dụng cụ đục lỗ thạch. - Bình tam giác. - Ống tiêm 1ml. - Buồng ẩm. - Agarose tinh khiết. - Nước muối sinh lý. - Dung dịch đệm PBS. - Dung dịch nhuộm màu Commassive brilliant blue. - Dung dịch tẩy màu. - Vaccine DPT. - Huyết thanh kháng độc tố bạch hầu. - Huyết thanh chuẩn (đã biết trước nồng độ). - Giải độc tố bạch hầu. III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM (Phương pháp khuyếch tán hai chiều do Outerlony đề xuất) - Giải hấp phụ vaccine DPT: dùng vaccine DPT để giải hấp phụ độc tố bạch hầu ra khỏi gel aluminum bằng dung dịch Na Citrat nồng độ 2% trong 24 giờ. - Tiến hành phản ứng nhận diện: dùng phản ứng khuyếch tán kép (double diffusion) do Outerlony đề xuất (được gọi tắt là phản ứng Outerlony). - Các bước tiến hành như sau: + Chưng thạch: Agarose tinh khiết 1% pha trong dung dịch đệm PBS có pH= 7,2. + Đổ thạch lên lame: dùng lame nhỏ hoặc film 2,5x8cm, khoảng 3ml thạch/ lame. + Đục lỗ thạch. Bài giảng TH CNSHĐV 5 Hình 47 : Cách bố trí các lỗ thạch trên lame. Tiến hành phản ứng Outerlony trong buồng ẩm, thực hiện nhuộm và ép tiêu bản. GỒM CÁC BƯỚC SAU:  Ngâm tiêu bản vào dung dịch sinh lý trong 12- 18 để loại bỏ các yếu tố kết hợp không đặc hiệu.  Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm commassive brilliant blue trong 10 phút.  Rửa sạch thuốc nhuộm bằng cách ngâm tiêu bản vào dung dịch tẩy màu (chú ý trong quá trình ngâm phiến phải thay dung dịch tẩy màu thường xuyên). Cẩn thận tránh làm biến dạng phiến thạch hoặc bong agarose.  Ép khô tiêu bản. IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý Không để hóa chất dây vào tay, quần áo Làm thí nghiệm, sinh viên phải mang găng tay V. YÊU CẦU - Nộp lại cho cán bộ hướng dẫn mẫu kết quả Huyết thanh kháng độc tố bạch hầu 50 Iu/ml Vaccine DPT đã giải hấp phụ được pha loãng ở các nồng độ khác nhau Lame Bài giảng TH CNSHĐV 6 Bài 2 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN HUYẾT THANH TỪ MÁU NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT a. Định nghĩa Huyết thanh là huyết tương không có fibrinogen và một số yếu tố đông máu khác. b. Vai trò của huyết thanh trong Công nghệ Sinh học động vật Là thành phần quan trọng, không thể thiếu đối với môi trường nuôi cấy mô và tế bào động vật. Huyết thanh có các đặc điểm: (1) Cung cấp các chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng… (2) Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào phân chia. (3) Chứa các protein có khả năng làm bất hoạt trypsin (một enzyme được sử dụng để tách tế bào động vật) tránh hiện tượng enzyme gây tổn thương tế bào. (4) Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng. (5) Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ. (6) Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy mạnh và ức chế độc tính của oxy. Huyết thanh còn là nguyên liệu hàng đầu trong điều chế vaccin và công nghiệp dược phẩm nói chung. c. Nguyên tắc thu nhận huyết thanh Máu tươi vừa được lấy ra trực tiếp từ cơ thể động vật thường được để yên trong vài giờ, trong suốt thời gian này fibrinogen chuyển thành fibrin gel (cục máu đông). Cục máu đông này co dần lại và làm chừa ra phần dịch lỏng hay huyết thanh của máu. Người ta thu nhận lấy phần dịch lỏng này trong điều kiện vô trùng. Bài giảng TH CNSHĐV 7 Các bước thiết yếu trong việc thu nhận huyết thanh bao gồm: - Thu nhận máu từ cơ thể. - Tạo cục máu đông trong bình chứa. - Tách huyết thanh khỏi cục máu đông bằng lọc và ly tâm. - Tinh sạch, bảo quản. II. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ 1. Hóa chất - Hóa chất bảo quản: merthiolate cần được sử dụng với nồng độ sao cho việc bổ sung chúng vào huyết thanh sẽ không làm loãng huyết thanh. - Mẫu máu (thu nhận từ thỏ). 2. Dụng cụ - thiết bị a. Dùng cho việc thu máu  Thỏ 2,5kg hoặc nặng hơn (không cho ăn trong 12 giờ trước đó để huyết thanh thu được ít lipid nhất).  Bàn cột thỏ, 4 đoạn dây cột.  Dao cạo mới.  Kéo, pince y tế.  Bông gòn + cồn 70o.  Bộ dụng cụ lấy máu: + Kim tiêm vô trùng, 18G, 2in. + Ống dẫn nhựa hoặc cao su. + Ống nghiệm vô trùng có sẵn nắp đậy.  Đèn bóng tròn 15W (đặt bên dưới tai thỏ, làm nóng để máu không đông nhanh trong quá trình lấy máu).  Băng keo y tế.  Chai đựng máu có nắp đậy (đã hấp khử trùng).  10.Giá để ống nghiệm.  11.Găng tay, khẩu trang và quần áo bảo hộ.  12.Đồ cấp cứu cá nhân. b. Dùng cho việc thu nhận huyết thanh  Tủ lạnh.  Que gỗ vô trùng. Bài giảng TH CNSHĐV 8  Micropipette 100-1000l + tip.  Máy li tâm ống nghiệm.  Chai thủy tinh có nắp vặn để chứa huyết thanh (vô trùng).  Phễu lọc + giấy lọc (vô trùng).  Milipore filter (màng lọc) 0,22-0,45m.  Thiết bị làm lạnh sâu (-800C  -200C).  Giấy hoặc khăn lau sạch. III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1. Phương pháp thu máu a. Cố định thỏ nằm úp trên bàn thao tác b. Cạo lông trên tai thỏ để có thể nhìn thấy rõ tĩnh mạch tai. c. Để lấy máu dễ dàng, cần làm giãn nở mạch bằng cách dùng đèn bóng tròn 15W làm ấm mặt trong của tai thỏ. d. Sát trùng nơi định lấy máu trên tai thỏ. e. Ghim kim tiêm vào tĩnh vạch theo chiều hướng vào gốc tai thỏ (ngược với chiều chảy của máu). f. Giữ thỏ nằm yên và thu máu vào ống nghiệm vô trùng gắn với kim tiêm qua ống dẫn. g. Phương pháp này có thể thu được đến 20ml máu thỏ (một con, một lần). Nếu máu ngưng chảy, búng nhẹ vào tĩnh mạch tai để có thể tiếp tục thu máu. h. Sau khi thu đủ thể tích máu cần dùng, đặt gòn hoặc gạc lên vết cắt, dùng ngón cái và ngón trỏ để ép chặt vết thương lại. i. Dùng băng keo để giữ miếng gạc đúng vị trí. j. Thu huyết thanh theo quy trình bên trên. k. Xử lý và bảo quản. 2. Thu nhận huyết thanh a. Để yên mẫu máu trong 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng nhằm tạo cục máu đông. Cẩn thận tách cục máu đông khỏi thành ống nghiệm bằng thìa thép hoặc que gỗ. Giữ ống nghiệm đựng máu trong tủ lạnh trong vòng 12-24 giờ để cục máu đông co lại. b. Gạn lấy phần huyết thanh vào các ống nghiệm sạch và li tâm với tốc độ 1000xg trong 30 phút ở 4 o C (khoảng 2500 vòng đối với Bài giảng TH CNSHĐV 9 rotor có bán kính 14cm). Cẩn thận lấy huyết thanh ra bằng cách gạn lấy phần dịch trong bên trên hoặc dùng pipette hút ra c. Thường thì huyết thanh thu được ở lần li tâm đầu tiên chứa một ít bạch cầu, để loại những tế bào này, cần li tâm lặp lại các sản phẩm đã thu ở lần ly tâm thứ nhất như mô tả trên. e. Khử trùng huyết thanh thu được bằng phương pháp lọc f. Thêm chất bảo quản, sau đó bảo quản lạnh để giữ được huyết thanh trong nhiều ngày. g. Để thuận lợi cho việc lưu giữ huyết thanh và do mỗi khi sử dụng chỉ cần một lượng nhỏ, huyết thanh cần được chia vào nhiều chai đựng có kích thước nhỏ. Đây là điều bắt buộc khi thực hiện lưu trữ huyết thanh ở trạng thái đông lạnh. IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý  Trong quá trình làm cần thật nhẹ nhàng, tránh gây lắc mạnh ống đựng máu khiến vỡ tế bào hồng cầu.  Sau khi lấy máu (không quá 10ml) thì phải khử trùng vết thương trên tai thỏ ngay và băng lại.  Khử trùng toàn bộ dụng cụ.  Trước khi li tâm phải cân đối trọng cho đều các ống nghiệm V. YÊU CẦU - Huyết thanh có màu vàng nhạt đều, trong suốt, ít có hồng cầu vỡ. - Không có lớp mỡ váng bên trên. - Không có lớp cặn dưới đáy chai đựng. - Không có bọt khí hoặc vật lạ hoặc các sợi huyết lơ lửng. - Huyết thanh thu được đảm bảo vô trùng. + Dịch nuôi cấy đục so với ban đầu: có sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu huyết thanh. + Dịch nuôi cấy không đổi so với ban đầu: không có sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu huyết thanh. - Cũng có thể kiểm tra vi sinh vật bằng cách cấy mẫu để theo dõi sự phát triển của các khuẩn lạc Bài giảng TH CNSHĐV 10 Để lạnh 4 o C, 12-24h Lặp lại 2-3 lần Ly tâm 4 o C, 50.000g, 20 phút Gạn lấy phần huyết thanh cho vào chai đựng Ly tâm 1000g, 30 phút, t o =40 o C Hút dịch trong ra BẢO QUẢN Ở –20OC Chia thành các mẫu nhỏ Lọc vô trùng Lọc qua giấy lọc nhám QUY TRÌNH THU NHẬN HUYẾT THANH. Thu máu Để yên 1-2h, t o phòng Tách cục máu đông khỏi thành chai đựng Bài giảng TH CNSHĐV 11 Bài 3 TÁCH TẾ BÀO TỪ MÔ ĐỘNG VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRYPSIN I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1. Nuôi cấy sơ cấp (primary culture) Nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào vừa được tách ra từ mô hay cơ quan. Các tế bào thu được trong lần nuôi sơ cấp này được gọi là tế bào sơ cấp (primary cell). Các tế bào sơ cấp thường không thuần nhất vì là hậu duệ của nhiều tế bào ban đầu khác nhau. Để thực hiện quá trình nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật, bước đầu tiên là tách chúng thành các tế bào riêng rẽ từ những mảnh mô và cho chúng bám vào giá thể phù hợp. Việc tách tế bào có thể thực hiện bằng biện pháp cơ học hay bằng enzym để tạo thành một dịch huyền phù tế bào. Hầu hết các loại tế bào động vật bình thường (trừ tế bào máu) đều cần bám vào một giá thể để sống và phát triển với hiệu quả cao nhất. Tuy nhiên, những tế bào ung thư có thể phát triển ở trạng thái lơ lửng trong môi trường. Có nhiều loại enzym được sử dụng để tách tế bào như collagenase, elastase, hyaluronidase, pronase…nhưng trypsin được dùng phổ biến nhất vì hiệu quả tách tế bào cao và giá rẻ. Trypsin có thể tách hoàn toàn tế bào từ mô bằng cách thủy phân các protein liên kết các tế bào với nhau. Tuy nhiên trypsin cũng có thể làm tổn thương màng tế bào trong quá trình tách, do đó cần phải xác định nồng độ enzym và thời gian tách tối ưu. Các nhà khoa học thường mong muốn có thể tiến hành nghiên cứu một chức năng nhất định của một mô hay một tế bào trong một hệ thống đơn giản. Để thực hiện điều này, người ta tìm cách tách tế bào ra khỏi mô nội quan của cơ thể và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện nhân tạo. Đây là kỹ thuật cơ bản trong nuôi cấy tế bào động vật. Bằng kỹ thuật tách tế bào động vật, chúng ta có thể làm chủ được những dòng tế bào tạm thời hay liên tục, từ đó có những ứng dụng quan trọng về sau. Bài giảng TH CNSHĐV 12 Tế bào sơ cấp là các tế bào được tách ra lần đầu tiên và chưa hề qua nuôi cấy. Các tế bào này có thể tạo lớp đơn. Người ta có thể dùng các tế bào lớp đơn để thực hiện các test vi sinh vật và miễn dịch. Mỗi lớp đơn của các tế bào sơ cấp thường rất nhiều chủng loại, có thể tìm kiếm được các tế bào mầm trong lớp đơn khi phân lập và đem cấy chuyền nhiều lần. Việc tách tế bào theo phương pháp sử dụng enzyme cho phép có thể thu được một lượng lớn tế bào rời trong thời gian ngắn. Nhờ đó, việc nuôi cấy sơ cấp có nhiều thuận lợi và tiết kiệm được thời gian, do có sự tăng cường khả năng tiếp xúc giữa các tế bào với môi trường. Tuy nhiên, điều quan trọng cần chú ý là phải làm giảm đến mức thấp nhất sự tiếp xúc giữa tế bào với trypsin hoạt động, nhằm giữ cho tỷ lệ sống của tế bào càng cao càng tốt. + Do đó trong quá trình tách tế bào bằng trypsin ở 36,5 o C thì các tế bào rời cần được thu mỗi 30 phút. Trypsin được loại ra bằng cách ly tâm và hoạt tính bị ức chế do huyết thanh hiện diện trong môi trường. + Quy trình tách tế bào bằng cách ngâm mô trong trypsin ở 4 o C, 6- 18 giờ sẽ cho phép trypsin thấm vào khối mô với hoạt tính trypsin thấp nhất và quá trình phân giải có thể tiến hành tiếp theo đó với thời gian ngắn hơn nhiều (20-30 phút), ở 37 o C. Mặc dù phương pháp sử dụng trypsin lạnh cho phép thu được nhiều tế bào sống và tế bào cũng ít bị ảnh hưởng của trypsin hơn, nhưng phương pháp sử dụng trypsin ấm vẫn được sử dụng một cách rộng rãi do ít tốn thời gian và ít phức tạp hơn. Bài giảng TH CNSHĐV 13 II. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ 1.Vật liệu: Gan bò Bài giảng TH CNSHĐV 14 2. Hóa chất -Dung dịch PBS. -Dung dịch trypsin 1%. -Môi trường nuôi cấy (E'MEM-10% huyết thanh). 3. Dụng cụ- thiết bị -Erlen 50ml vô trùng. -Pipetman 200 -1000l. -Pipetman 10 -100l. -Đầu tip vô trùng. -Máy lắc. -Kéo nhïn vô trùng. -Đĩa petri vô trùng. -Becher 250ml. -Pipette 1ml, 2ml, 5ml vô trùng. -Bóp cao su (loại nhỏ). -Bóp cao su (các loại). -Kính hiển vi. -Buồng đếm tế bào. -Máy Vortex. -Máy sấy. -Lamelle. III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1. Tách tế bào a) Cân 3 mẫu mô gan, mỗi mẫu 5g. Rửa mẫu trong đĩa Petri vô trùng bằng dung dịch PBS 3 lần, hút bỏ dịch rửa. b) Cho 3 mẫu gan vào 3 erlen vô trùng, cắt nhuyễn mô gan bằng kéo vô trùng. c) Cho vào mỗi erlen (đánh số 1, 2, 3). -Erlen 1: 18ml PBS + 2ml trypsin 1%. -Erlen 2: 15ml PBS + 5ml trypsin 1%. -Erlen 3: 12ml PBS + 8ml trypsin 1%. Như vậy, ta được 3 dung dịch trypsin có nồng độ 0,1; 0,25; 0,4% tương ứng với erlen 1, 2, 3. d) Lắc các erlen mẫu trên máy lắc. Bài giảng TH CNSHĐV 15 e) Sau 60, 90, 120 phút, lấy mẫu ở mỗi erlen và xác định mật độ tế bào gan trong dung dịch bằng buồng đếm. Lưu ý phân biệt tế bào gan và tế bào hồng cầu. Hình : Tế bào động vật trong phòng đếm. IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Thời gian phải chính xác trong suốt quá trình lắc và đếm mật độ tế bào. - Rửa sạch máu để tránh đếm nhầm tế bào máu trong buồng đếm. V. YÊU CẦU Xác định nồng độ trypsin và thời gian tối ưu đe