Công nghệ lên men - Nguyễn Minh Hiền

4/20/2011 1 Công nghệ lên men CDGD: Bùi Hồng Quân Biên soạn: Nguyễn Minh Hiền Tài liệu tham khảo Công nghệ vi sinh vật tập 2, 3. PGS-TS Nguyễn Đức Lượng Công nghệ vi sinh ứng dụng, PGS-TS Trần Minh Tâm Công nghệ lên men ứng dụng trong CNTP, Bùi Ái Công nghệ sản xuất malt và bia, Hoàng Đình Hòa Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, PGS – TS Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thị Thanh Hằng Enzyme vi sinh vật, PGS – TS Lê Ngọc Tú Food microbiology, William C.Frazier Applications of biotechnology to traditional fermented foods ( ………………….. 4/20/2011 2 Tài liệu tham khảo (tt) • Bamforth C.W. Food, Fermentation and Micro-organisms, Blackwell Publishing, USA, 2005. • Hutkins R.W. Microbiology and Technology of Fermented Foods, Blackwell Publishing, USA, 2006. • Elmer H. Marth, Applied dairy microbiology, Second edition • Springer, Wine microbiology practical and procedures, 2007 • Springer, Modern techniques in the microbial ecology of fermented foods, 2008 • Elsevier, Handbook of culture media for food microbiology, 2003 • The microbiology of safe food, Blackwell Publishing, USA, 2000 • Practical food microbiology, 3rd edition, Blackwell Publishing, USA, 2003 ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ HỌC TẬP CỦA SV 1. ĐIỂM QUÁ TRÌNH (30%) 1.1. KIỂM TRA 15 PHÚT (15%) 1.2. BÁO CÁO SEMINAR (15%): chọn 1 trong 3 phương án sau 1.2.1. Chọn 1 bài báo tiếng Anh, dịch sách liên quan tới môn học để đọc hiểu và thuyết trình power point (4sv/nhóm) 1.2.2. Chọn 1 bài báo tiếng Việt liên quan tới môn học để đọc hiểu và thuyết trình power point (2sv/nhóm) 1.2.3. Chọn 1 đề tài đã được thực hiện liên quan tới môn học để đọc hiểu và thuyết trình power point (4sv/nhóm). 2. ĐIỂM THI KÊT THÚC MÔN HỌC (70%) Thi viết tự luận 4/20/2011 3 NỘI DUNG CHI TIẾT HỌC PHẦN 2 Phần 1. Mở đầu Phần 2. Kỹ thuật lên men Phần 3: Công nghệ lên men ứng dụng 3.1. Lên men ethanol và các ứng dụng 3.2. Công nghệ sản xuất acid hữu cơ thực phẩm 3.3. Công nghệ sản xuất acid amin 3.4. Công nghệ sản xuất sinh khối vi sinh vật 3.5. Công nghệ sản xuất polysaccharide từVSV 3.6. Công nghệ enzyme 3.7. Công nghệ sx các sp lên men truyền thống www.gbd.edu.vn PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. CÔNG NGHỆ LÊN MEN 1.1.1. Khái niệm về lên men (fermentation) 1.1.2. Khái niệm về CNLM (fermentation technology) 1.2. PHÂN LOẠI CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN www.gbd.edu.vn 4/20/2011 4 (From latin “fervere”) 1.1.1. Khái niệm về lên men (fermentation) www.gbd.edu.vn Quan điểm của nhà hóa sinh học: lên men là quá trình sản sinh năng lượng. Các hợp chất hữu cơ hoạt động với vai trò vừa là chất cho, vừa là chất nhận điện tử. Lên men là quá trình yếm khí, năng lượng được sản xuất không cần có oxy hoặc các chất nhận điện tử vô cơ khác. Quan điểm của Pasteur: 1857, Ông công bố quá trình lên men không phải “công trình của sự chết” như những nhà hóa học nghĩ mà là “công trình của sự sống”. Ông đưa ra khái niệm tính kỵ khí và ái khí của VSV và sự lên men là hệ quả của “cuộc sống không có không khí” Theo nghĩa mở rộng: lên men là quá trình nuôi cấy VSV (có oxy hoặc không có oxy) để thu nhận sinh khối, các sản phẩm trao đổi chất, thực hiện sự chuyển hóa cơ chất. 1.1.1. Khái niệm về lên men (tt) 4/20/2011 5 First Fermentation concept, or Pasteur concept in 1857, “Fermentation is the transformation process of the sugar to alcohol in presence of "la vie sans l'air" (means life without air). Louis Pasteur (27.12.1822 – 28.9.1895) the father of the Microbiology 1.1.1. Khái niệm về lên men (tt) www.gbd.edu.vn Conclusions of Pasteur from its study of wines: The alcoholic fermentation of grape juice occur only in presence of yeasts. The wine acidification occur in presence of bacteria. When the grape juice is heated the fermentation do not take place. When the wine (the sugar) is heated the acidification do not occur. Fermentation is the change of the substrate (sugars) by the action of the ferments 1.1.1. Khái niệm về lên men (tt) 4/20/2011 6 The fermentation technology is the combined application of the knowledge of process engineering, biochemistry and microbiology for designing or evaluation a fermentation process. 1.1.2. Khái niệm về CNLM (fermentation technology) Sản phẩm Sản lượng (tấn/năm) Acid foods (citric, lactic) 100,000 Alcohol 1,000,000 Amino acids 10 – 100,000 Antibiotics 10 – 30,000 Enzymes 0.1 – 3,000 Pharmaceutical proteins 0.001 - 3 SCIENTIFIC KNOWLEDGE Biochemistry Microbiology Molecular Biology Process engineering Informatics Statistic Immunology Physiology TOOLS / TECHNICAL ADVANCES Biosensors Bioinformatics Bioprocess Protein engineering Experimental design Process analysis ENVIRONMENT Bioremediation Environmental monitoring Pollution control Useful Applications FARMINGYield Animal health Feed stocks PHARMACY Diagnostics Vaccines Therapeutics FOOD 4/20/2011 7 What I should do to do fermentation? Media preparation Fermenter preparation Sterilization Adjusting parameters Inoculation Cultivation Taking samples D ev el o pm en t t he pr o du ce r st ra in Harvest Medium design Physiology Kinetics Agitation/Aeration Scale-up conservation Optimization Fermenter types Operation modes
CÁC SP TRAO ĐỔI CHẤT SP TĐC BẬC 1: acid amin, vitamin, acid citric … SP TĐC BẬC 2: enzyme VSV, kháng sinh… SP lên men: rượu, acid lactic… (lên men kỵ khí) Cơ chất Tế bào (biomass) 1.2. PHÂN LOẠI CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN TỪ VSV
SINH KHỐI VSV (biomass): protein đơn bào (SPC), men bánh mì, giống khởi động (starter) Cơ chất Sản phẩm + Tế bào (SP TĐC) 4/20/2011 8 Phân loại sản phẩm lên men theo quan điểm kinh tế Bio-products High value – Low product volume (Mostly depends on the substrate price) Medium value – High product volume (The process is relatively expensive and some complexity) Low value – High product volume (Most of the production correspond to purification process) • Antibiotics • Vitamins • Enzymes • Vaccines • Steroids • Hormones • Other pharmaceutics • Amino acids • Organic acids • Biopolymers • Baker yeast • Microbial polysaccharides • Ethanol • Biomass • Methane • Acetone • Butane • Fructose syrups • Feeding products Cost distribution High volume and Low value product Low volume and High value product High investment cost (phí đầu tư cao) High investment cost High raw material cost (phí nguyên liệu cao) Cost are distributed in all production stages High conversion efficiency (hiệu quả chuyển đổi thấp) High recovery of the product in the fermentation stage Low recovery cost (Phí quay vòng thấp) High purification cost Low margin profit (lợi nhuận thấp) High margin profit Only few regulatory problems (phải theo quy định pháp luật) Too much regulatory and legyslation restrictions, and high plant hygiene Required not much R&D expenditures (không tốn nhiều tiền cho RD Required too much R&D Cost Low qualification of the labor force is acceptable (Người lao động có thể ko cần trình độ chuyên môn cao) Very high qualification of the labor force is nedeed 4/20/2011 9 PHẦN 2. KỸ THUẬT LÊN MEN 2.1. VSV TRONG CÔNG NGHỆ LÊN MEN TP 2.2. ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN 2.3. PHƯƠNG PHÁP & THIẾT BỊ LÊN MEN 2.4. CẢI TiẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN www.gbd.edu.vn 2.1. VSV TRONG CÔNG NGHỆ LÊN MEN TP 2.1.1. CÁC YÊU CẦU VỀ GIỐNG VSV 2.1.2. KỸ THUẬT TẠO GIỐNG 2.1.3. KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÀ SX GIỐNG 2.1.4. KỸ THUẬT KIỂM TRA GIỐNG VSV 2.1.5. KỸ THUẬT NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG GIỐNG 2.1.6. KỸ THUẬT BẢO QUẢN GIỐNG 4/20/2011 10 VSV TRONG CÔNG NGHỆ LÊN MEN TP TP lên men với sự tham gia của VSV trong tự nhiên (TP lên men truyền thống) TP lên men với sự tham gia của VSV thuần khiết (TP lên men công nghiệp)
Sx thủ công, quy mô nhỏ, năng suất không cao
Không kiểm soát được quá trình, chất lượng chưa ổn định và chưa đồng đều.
Mang bản sắc ẩm thực, kinh nghiệm, văn hóa của mỗi dân tộc
Sx quy mô lớn, năng suất cao
Chủ động cấy 1 lượng VSV vào nguyên liệu
Kiểm soát được quá trình lên men, chất lượng ổn định & đồng đều
Phải có tốc độ sinh trưởng và phát triển mạnh, thuần
Phải tạo ra sản phẩm có năng suất sinh tổng hợp cao, chất lượng tốt
Phải có tính thích nghi nhanh trong điều kiện sx CN
Phải có khả năng chống chịu lại VSV tạp nhiễm
Phải có kích thước đủ lớn, thuận tiện cho quá trình lắng, lọc, tinh chế sau này. Sản phẩm sinh khối dễ tách ra khỏi môi trường nuôi cấy
Chủng VSV được bảo quản dễ dàng, tồn tại các đặc tính trong suốt thời gian sử dụng
Có khả năng thay đổi các đặc tính bằng kỹ thuật di truyền để cải thiện, nâng cao năng suất
Không hoặc ít tạo thành sản phẩm không mong muốn 2.1.1. Yêu cầu giống VSV trong CNLM 4/20/2011 11 2.1.2. Kỹ thuật tạo giống Phân lập trong tự nhiên PL trong đk sx công nghiệp Tạo giống VSV mới (áp dụng kỹ thuật di truyền) PP Nguyên tắc Ưu điểm Nhược PL trong tự nhiên có cơ chất, có VSV phân giải cơ chất nguồn VSV phong phú đa dạng Tốn thời gian, hoạt lực VSV còn thấp PL trong sx CN Tính thích nghi cao Hiệu quả cao, VSV đã quen với điều kiện sx công nghiệp / Tạo VSV = KTDT Tiếp hợp, tái tổ hợp Tạo được giống VSV có đặc tính mong muốn Yêu cầu trình độ cao, thiết bị hiện đại Các trung tâm lưu trữ giống trên thế giới và Việt Nam ABBOTT: Abbott Lab, North Chicago, III.60064, USA ATCC: America Type Culture Collector, 12301, Parklaw Drive Rockvill Md20852, USA HIR: Food and Fermentation Divisio, Hokkatdo Profectural Industrial Research Institute Saporo, Japan FERM: Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology Ministry of Industrial Trade and Industry, Chiba, Japan VTCC, IMBT, National University, HaNoi, VietNam vtcc@vnu.edu.vn; www.biotechvnu.edu.vn (Ngân hàng giống quốc gia, HN) Bảo tàng giống: www.bacteriummuseum.org 4/20/2011 12 2.1.3. Kỹ thuật nhân giống Nhân giống trong PTN Nhân giống trong quy mô sx lớn PPnhân giống khởi động truyền thống và hiện đại Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống Thành phần các chất trong MT nhân giống (không chứa chất kháng sinh, chất ức chế). Penicillin, chloramphenycol … ức chế sinh trưởng của VK lactic. Nồng độ các chất trong MT nhân giống. Nồng độ đường hoặc muối cao tăng p thẩm thấu ức chế VSV pH: chọn pH của MT nhân giống = pHop của VSV. pH ảnh hưởng trực tiếp lên bề mặt tế bào tích điện khác nhau làm cho hoạt độ các loại enzyme VSV thay đổi. pH ảnh hưởng đến sự phân ly của các chất dinh dưỡng có trong MT  Nhiệt độ: chọn To nhân giống = Toop của VSV 4/20/2011 13 Quan sát đại thể  Quan sát vi thể Kiểm tra hoạt lực giống VSV (thoái hóa) Giống VSV bị tạp nhiễm, thoái hóa phải phân lập lại hoặc thay giống khác 2.1. 4. Kỹ thuật kiểm tra chất lượng của giống VSV Kiểm tra độ thuần của giống thường xuyên (bị nhiễm từ ống gốc) Khử trùng MT dinh dưỡng; với các MT có bào tử cần khử trùng triệt để hơn. Ví dụ diệt bào tử Bac. subtilis 1800C/60’ - 90’ (Bị nhiễm trong qt nhân giống) Giống VSV bị thoái hóa: do tác động của môi trường bên trong và tác động của những sản phẩm TĐC do chính VSV tiết ra 2.1.5.1. Huấn luyện thích nghi giống vi sinh vật
Mọi VSV đều có khả năng thích nghi rất cao với môi trường. Những tác động môi trường được lặp đi lặp lại nhiều lần tạo nên tính thích nghi bền vững.
Khi tạo được tính thích nghi của VSV phải luôn duy trì tác động ở mức độ đã tạo ra tính thích nghi. Đặc điểm này không bền. Yêu cầu: người thực hiện phải có tính kiên trì. 2.1.5. Kỹ thuật nâng cao chất lượng giống Khuẩn lạc nấm men trên Hansen Agar có hàm lượng đường 26, 28% (phương pháp huấn luyện giống) 4/20/2011 14 2.1.5.2. Đột biến VSV Đột biến bằng tác nhân vật lý ( tia U.V): Tia U.V được sử dụng rộng rãi trong công nghệ chọn giống VSV. Tia U.V có khả năng tạo ra các đột biến có chất lượng cao hơn chủng loại ban đầu hàng trăm lần. Tia U.V ở λ=260nm thường gây ra những đột biến điểm cao nhất. Đây là loại bức xạ không ion hóa và gây ra những biến đổi base chứa nitơ trong gen. Đột biến bằng tác nhân hóa học (kháng kháng sinh): Dùng môi trường có kháng sinh để tìm các dạng đột biến bền vững (kháng kháng sinh). Trên môi trường này, các tế bào mẫn cảm với kháng sinh sẽ bị giết chết, chỉ còn các tế bào đột biến đối kháng là tồn tại Số lượng khuẩn lạc/ nồng độ kháng sinh trong MT nuôi cấy Nhóm 10-7 (không bổ sung kháng sinh) 0,01mg/ml 0,1mg/ml 0,5mg/ml 1 34 8 2 Không xuất hiện khuẩn lạc 2 58 5 3 3 107 7 5 4 Nhiễm Nhiễm 5 TN tiến hành với vk E.coli. Nuôi cấy E.coli ở nồng độ pha loãng 10 -1 trong các môi trường bổ sung kháng sinh 4/20/2011 15 2.1.5.3. Lai giống nấm men Nguyên tắc: Từ 2 giống nấm men giống nhau ta có thể tạo ra được giống nấm men mới có những đặc tính của cả 2 loài ban đầu bằng cách cho chúng tiếp xúc với nhau trong điều kiện thí nghiệm. Nhược điểm: •Tỷ lệ thành công không cao. •Sự pha trộn đặc tính di truyền chỉ trong một lòai nhất định. •Các giống VSV khác nhau thì không thể tiến hành quá trình lai giống được. Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện Cách thực hiện lai giống nấm men 1. Cấy 2 giống men vào môi trường đầy đủ M1(môi trường lỏng). Ủ 24h. 2. Cấy giống hỗn hợp vào môi trường thạch tối thiểu M2 và M1 (thạch bằng). Ủ ít nhất 5 ngày 3. Hai giống nấm men đã lai với nhau nếu trên M2 xuất hiện khuẩn lạc 4. Kiểm tra giống thu nhận có phải là lưỡng bội thể bằng cách: Cấy khuẩn lạc trên môi trường M2 vào môi trường Thạch acetat (M3). Ủ 48h 5. Làm tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi, nếu thấy nang chứa 4 bào tử (tế bào lưỡng bội thể) chứng tỏ lai thành công. 6. Kiểm tra tính trạng cần quan tâm. 4/20/2011 16 2.1.5.4 Sử dụng kỹ thuật di truyền hiện đại Kỹ thuật biến đổi gen để tạo ra các sinh vật có tính trạng đích theo ý muốn Súng bắn gen 4/20/2011 17 Mục đích: đảm bảo được tính chất của giống (duy trì gần như nguyên vẹn đặc tính ban đầu của giống VSV trước lúc cất giữ) đủ tiêu chuẩn cho quá trình sản xuất. Nguyên tắc: làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất ở VSV, đồng thời ngăn cản sự sinh sản của chúng. Phương pháp: Bước 1: Tiền bảo quản (thuần hóa giống). Chọn chủng VSV ở điều kiện và giai đoạn tối ưu cho bảo quản. Bước 2: Chọn phương pháp thích hợp cho bảo quản. 2.1.6. Kỹ thuật bảo quản giống VSV 2.1.6.1 Bảo quản giống trong thạch nghiêng (cấy truyền định kỳ) Nguyên tắc: luôn đổi mới tế bào, không gây ra bất thường. Biện pháp: môi trường tối thiểu, nếu môi trường giàu dinh dưỡng, VSV phát triển nhanh sẽ thoái hóa nhanh. Ưu: đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém, thích hợp ở quy mô nhỏ Nhược điểm: tốn thời gian, thời gian BQ ngắn (1- 2 tháng) Vô tình đã huấn luyện VSV sống ở điều kiện lạnh, làm biến đổi giống VSV ban đầu. 2.1.6.2. Bảo quản giống trong lớp dầu khoáng Nguyên tắc: ức chế quá trình hô hấp ở VSV trong cả VSV yếm khí và hiếu khí, hạn chế tiếp xúc với oxy, ngăn hiện tượng mất nước của môi trường và VSV. Biện pháp: đổ 1 lớp dầu khoáng hoặc parafin lỏng Ưu điểm: đơn giản, hiệu quả cao, thời gian BQ dài (1 năm) Nhược điểm: Có lẫn dầu 4/20/2011 18 2.1.6.3. Bảo quản giống trong cát, đất sấy khô Nguyên tắc: Sử dụng đất, cát như những giá thể mang. Khi độ ẩm môi trường giảm tối thiểu, VSV không phát triển nữa. (Đất và cát là môi trường tối thiểu) Cách thực hiện: Xử lý đất, cát (rây đều, ngâm trong HCl hoặc H2SO4 đậm đặc 8-12h. Rửa dưới vòi nước cho đến pH trung tính, sấy đất, cát > 1000C. BQ ở điều kiện vô trùng. VSV được nuôi ở môi trường thạch. Đổ cát, đất đã vô trùng vào ống nghiệm, lắc đều, sau đó rót qua ống nghiệm khác. Hàn kín miệng ống Ưu điểm: thích hợp để BQ các giống VSV trong xử lý môi trường, trong nông nghiệp (phân bón) không đòi hỏi mức độ tinh khiết cao. Sử dụng bảo quản giống VSV tạo bào tử. Thời gian bảo quản dài (2 năm) Nhược điểm: không dùng trong sản xuất công nghệ thực phẩm 2.1.6.4 Bảo quản giống trong các hạt ngũ cốc Nguyên tắc: sử dụng hạt ngũ cốc như giá thể mang Thường sử dụng BQ các nấm sợi và VSV trong thực phẩm Mục đích: giữ VSV ở trạng thái tiềm sinh. Cách thực hiện: Hạt ngũ cốc rời, hấp chín, nuôi nấm mốc trực tiếp (3 – 5 ngày), sấy ở t0 < 500C đạt độ ẩm W <15%. Nhiệt độ bảo quản: 15 – 200C Thời gian bảo quản: 2 năm (châu Âu), 1 năm (Việt nam) 4/20/2011 19 2.1.6.5 Bảo quản giống trong giấy lọc Nguyên tắc: áp dụng với VSV có bào tử. Ngoài giấy lọc, có thể sử dụng B.C (bacterium cellulose) Cách thực hiện: 1. Chuẩn bị giấy lọc vô trùng:Cắt giấy lọc 1 – 3 cm. Cho giấy lọc đã cắt vào ống nghiệm, đậy nút bông, sấy 1600 C/ 2h hoặc khử trùng 1210 C/30’. 2. Nuôi VSV trong môi trường lỏng đến khi tạo thành bào tử 3. Dùng pi pet vô trùng hút 1 giọt Vi khuẩn vào giấy lọc. Sấy ở 400 C dến khi thấy miếng giấy lọc khô thì chuyển giấy lọc vào ống nghiệm. Thời gian BQ: 5 năm 2.1.6.6 Bảo quản giống trong gelantine Cách thực hiện: 1. Chuẩn bị môi trường: Môi trường N.B bổ sung 10% gelantin và 5% acid ascorbic. Khử trùng 1210C/ 15’ 2. Chuẩn bị giống VSV: nuôi giống VSV 3. Trộn VSV với môi trường. 4. Dùng ống nhỏ giọt vô trùng tạo thành từng giọt gelantine nhỏ. Sấy khô trong tủ hút chân không 4/20/2011 20 2.1.6.7 Bảo quản giống bằng phương pháp lạnh đông Nguyên tắc: Sự phát triển của VSV sẽ bị ức chế ở nhiệt độ lạnh sâu. Cần sử dụng chất bảo vệ VSV (glycerin 15%, saccharose 10% + gelantin 10%... Giúp VSV không bị chết ở nhiệt độ lạnh sâu Thời gian BQ: ở -300 C: 9 tháng ở - 400 C: 1 năm ở - 700 C: 10 năm 2.1.6.8 BQ giống bằng pp đông khô (được sử dụng trong các ngân hàng giống, cơ quan nghiên cứu lớn) Nguyên tắc: sấy ở nhiệt độ thấp trong điều kiện chân không, không ảnh hưởng đến chất lượng giống và có thể tạo ra các ống giống theo quy mô công nghiệp. Cách thực hiện: giống, nhân giống trong môi trường lỏng, kiểm tra giống (đặc điểm sinh hóa, sinh lý), nếu đạt tiêu chuẩn, máy đông khô 24h, hàn nắp lại. Thời gian bảo quản: 20 năm Ưu điểm: chất lượng giống không đổi, bảo quản ở nhiệt độ thường, thời gian bảo quản dài Nhược điểm: chi phí lớn 4/20/2011 21 2.2. ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN (the kinetics of the fermentation processes) 2.2.1. PHƯƠNG TRÌNH MONOD 2.2.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU SUẤT LM Mục đích nghiên cứu động học •Thiết kế 1 quá trình lên men mới •Đánh giá hiệu quả của qt lên men đang thực hiện •Cải tiến quá trình (chất lượng, năng suất, giảm chi phí) •Nâng cấp hoặc giảm quy mô sx cells biomass CO2 H2O Products nutrients ¿How to describe a fermentation process? Conversion process of nutrients to products of the microbial metabolism CHmOl + aNH3 + bO2 → cCHpOnNq + dCHrOsNt + eCO2 + fH2O (1) (source of N& O2) (biomass) Metabolic by products or Interest product Substrate Rest of the nutrients Yield – is an indicator of the efficiency of the process. From “chemical engineering”: the Yield is stoichiometry of the reaction. YX/S: biomass-substrate yield = c· Mr(Biomass) / Mr(Substrate) YP/S: product-substrate yield, is calculated through “d” YP/X: product-biomass yield, is calculated through “d/c” 4/20/2011 22 Carbon & Energy source + O2 Nitrogen source + Other required nutrients + Cells Products+ + CO2 Heat+ H2O+ Monitor the consumption of the carbon source: • Chemical analysis • Chromatography Determine O2 consumption: Paramagnetic O2 analyzer Mass spectrometer Dissolved O2 Monitor the consumption of the nitrogen source: Chemical analysis NH3 electrode pH-stat Nitrate electrode Monitor the consumption of essential nutrients: Chemical analysis Ion selective electrodes Measure cell components: Protein DNA and RNA Carbohydrates & Lipids Enzymes Monitor product formation: Chemical analyses Mass spectrometer pH and viscosity Chromatography (gas and HPLC) Enzyme electrode Monitor CO2 production: IR analysis Mass spectrometer Energy balance Heat evolution Direct estimation of cell mass: • Cell dry or wet weight • Optical