Điều hòa hoạt động gen vi khuẩn

1Mục tiêu - Tóm lược các phương thức điều hòa hoạt động gen ở nhân nguyên thủy - Mô tả sự điều hòa cơ chế tế bào của vi khuẩn để đáp ứng với các thay đổi trong môi trường sống - Giải thích được cách thức tương tác giữa các protein và các trình tự ADN đặc biệt và các phân tử khác trong quá trình điều hòa hoạt động gen TS. Nguyễn trọng Hiệp 2
Điều khiển tốc độ của các quá trình sinh hóa bằng cách thay đổi thuận nghịch lượng các enzym xúc tác (chất có bản chất protein) tham gia vào các quá trình điều hòa sinh tổng hợp protein nói chung và enym nói riêng Mở đầu
Hoặc là điều hòa hoạt tính của chúng trong qúa trình thực hiện chức năng tăng hoặc giảm họat tính. Thường gặp nhất ở TB nhân nguyên thủy (Prokaryote) ví dụ vi khuẩn Ở Tế bào nhân thật (Eukaryote) gồm thực vật, động vật gồm cả 2 hướng trên • Điều hòa hoạt động gen: biểu hiện bằng sự điều hòa trao đổi chất bao gồm 2 hướng: 3Enzym và họat hĩa enzym Trong đa số các quá trình sinh hóa, các enzym là những chất xúc tác các quá trình sinh học Quá trình vận chuyển chủ động qua màng sinh học được thực hiện bởi protein nhưng chúng đóng vai trò "nhận biết" sự vận chuyển (translocation) cơ chất như permease (di, tri, oligopeptid). 4 ATP Màng ngoài Periplasma Màng tế bào chất oppB oppC Tế bào chất oppD oppF ADP oppA oppA Opp A,B,C,D: oligopeptid permease Mở đầu 5Điều hòa quá trình sao chép Ở TB nhân nguyên thủy cĩ các enzym DNA polymerase I, II, III, ligase chịu trách nhiệm sao chép DNA Ở TB nhân thật cĩ 5 loại DNA polymerase được biết là α, β, γ, δ, và ε Ngồi ra, để lơi xoắn và tháo xoắn cĩ enzym helicase và topoisomerase I, phục hồi dạng siêu xoắn cĩ topoisomerase II (DNA-gyrase) Nhĩm gen Dna mã hĩa cho 1 protein cần thiết cho sao chép (ví dụ DnaA, DnaC ngịai ra cịn cĩ thể kể đến DnaB, DnaI, DnaP)các gen này chịu sự kiểm sĩat Dương và Âm của các protein điều hịa 6Kiểm soát dương: là sự tích lũy chất hoạt hóa cho đến ngưỡng đủ để khởi động một chu trình sao chép mới, cần thiết cho sự cân bằng với việc nhân đôi của sinh khối tế bào. Kiểm soát âm: khi chất kiềm hãm cần được tổng hợp một cách giới hạn tiếp ngay khi bắt đầu chu trình sao chép trước (vì có thể là sản phẩm của gen điều hòa nằm gần vị trí bắt đầu sao chépphiên mã theo sự sao chép) Điều hòa quá trình sao chép 7Khái niệm điều hòa quá trình phiên mã Cơ chế kiểm sóat dương (positive control): kích thích sự phiên mã gene trong Operon Cơ chế kiểm sóat âm (negative control): ức chế sự phiên mã gene trong Operon Protein activator Kiểm sóat cảm ứng, âm Kiểm sóat cảm ứng, dương Kiểm sóat ức chế, âm Kiểm sóat ức chế, dương Protein repressor 8Điều hòa quá trình phiên mã Operon là đơn vị phiên mã bao gồm tối thiểu là vùng khởi động (promoter) và các gen mã hóa mARN cho một hay một vài chuỗi polypeptid và terminator Prokaryote Eukaryote Một operon có thể chứa một hay nhiều vị trí điều hòa (operator) hơn so với số promoter. 9TTGACA TTTTACCTCTGGCGGT TATAAT GGTTGC ATGTA 5’3' Vùng-35 Vùng-10 Promoter (hộp Pribnow) Operator Vị trí khởi đầu tổng hợp mARN mARN operator của λ - phage phủ lên một vùng của promoter 6.3. Điều hòa quá trình phiên mã Promoter Operator Gene 1 Gene 2 Gene 3 5' 3' ARN polymerase Re p r ess or ARN polymerase Repressor: protein ức chế 10 6.3.1. Kiểm soát cảm ứng, âm Lac Operon Gồm promoter, operator, gen cấu trúc, terminator. Gen cấu trúc gồm: lacZ, lacY, và lacA. •lacZ: gen mã hĩa enzym β-galactosidase, một enzym nội bào chức năng chính là thủy phân disaccharide lactose  glucose+ galactose. Chức năng phụ là biến lactoseallolactose. •lacY: gen mã hĩa β-galactoside permease, một protein chuyên chở đĩng vai trị bơm lactose qua màng tế bào. •lacA: gen mã hĩa β-galactoside transacetylase, một enzym gắn nhĩm acetyl từ acetyl-CoA vào β-galactosides. Chỉ lacZ và lacY cĩ vai trị cần thiết cho việc chuyển hĩa lactose. 11 Gắn vào Allolactose P i i lac z lac y lac a G enes m RNA s Proteins Lactose ope ron Locu s đ ie àu h o øa cu ûa lac o pe ron Vị trí g ắn CAP -c AM P Vị trí g ắn RNA po lyme rase Operator lo cu s (lac O) Gene s ca áu tru ùc Lac prom oter (lac p ) Tran s- ace ty lase Pe rme ase β - g a l a c t o s i d a s e ? Màng te á ba øo 6.3.1. Kiểm soát cảm ứng, âm Các yếu tố chính kiểm sĩat Lac Operon Lactose Glucose và Galactose Allolactose (chất cảm ứng) Gắn vào lac O Khơng cĩ chất cảm ứng Repressor Inactive repressor Lactose cấu trúc là galactose-(β1->4)- glucose, dễ chuyển thành Allolactose là galactose- (β1->6)-glucose. Quá cảm ứng được kích ứng dây chuyền 12 Promoter Operator Gene 1 Gene 2 Gene 3 5'3' ARN polymerase Repressor Sự phiên mã bị phong bế Quá trình cảm ứng enzym trong Kiểm soát cảm ứng, âm Promoter Operator Gene 1 Gene 2 Gene 3 5' 3' mARN mARN mARN Repressor I nd uc e ARN polymerase Sự phiên mã tiến-hành 13 Cảm ứng sự tổng hợp enzym trên Lac operon Allolactose 14 Những chất cảm ứng mạnh Lac operon • Chủ yếu là cĩ cấu trúc tương đồng với Lactose (Lactose analogues)  Allolactose: isomer của lactose, cảm ứng Lac operon. Lactose cấu trúc là galactose-(β1->4)-glucose, trong khi đĩ allolactose là galactose-(β1->6)-glucose. Lactose cĩ thể được đổi sang allolactose dưới tác động của β- galactosidase.  IPTG:Isopropyl-β-D-thio-galactoside gắn vào repressor và bất họat chất này nhưng IPTG khơng phải là cơ chất của β-galactosidase.  X-gal: (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) là cơ chất của β-galactosidase nhưng khơng bất họat repressor và sẽ chuyển màu xanh Hỗn hợp 2 chất trên cảm ứng mạnh Lac operon hàng ngàn lần và khĩm vi khuẩn sản xuất β-galactosidase sẽ cĩ màu xanh. 15 Cấu trúc những chất cảm ứng mạnh Lac operon 16 6.3.2. Kiểm soát ức chế, âm: Tryp Operon điều hịa sinh tổng hợp acid amin Tryptophan Tryptophan Aporepressor Ức chế gốc Repressor Regulator genes Các gene 5 4 1 g5 g4 g1 → g3 Các chất chuyển hóa gồm 5 bước Các enzyme e5 e4 e1e3 Dư thừa Trở nên chất đồng ức chế (corepressor) X X X 17 6.3.2. Minh họa kiểm soát ức chế, âm: Tryp Operon Thiếu Tryptophan Dư thừa Tryptophan = Co-repressor 18 Kiểm sóat ức chế âm tương tự (Vd ứÙc chế sự tổng hợp acid amin arginine) Arginine dư thừa 19 6.3.3. Điều hòa suy giảm Leader sequence Gen1 Gen2 Gen3 Gen4 Gen5 3' 5' ADN Promoter Operator Đoạn che phủ Sự phân bố gen của tryptophan operon Vùng dẫn 20 6.3.2. Điều hòa suy giảm Sắp xếp các vùng nucleotid trong trình tự dẫn XX Tryp operon Code for ribosome binding site Transcription pause site A B C D Attenuator 3' Terminator sequence Leader sequence 2 codon mã hóa cho Tryptophan (UGG-UGG) Phần mã hóa 7-uracyl trình tự dẫn 21 6.3.2. Điều hòa suy giảm Sắp xếp các vùng nucleotid trong trình tự dẫn 2 codon mã hóa cho Tryptophan (UGG-UGG) Vùng C Vùng A Vùng B Vùng D UGA (codon stop 22 6.3.3. Cơ chế điều hòa suy giảm Sự chuyển dịch của ribosom trên mARN ARN polymerase ADN có nghĩa Trp. operon Ribosome Peptid m A R N 5’ 3’ 5’ 23 Thiếu Tryptophan: tiếp tục phiên mã 6.3.3. Cơ chế điều hòa suy giảm Mô hình phiên mã suy giảm của operon tryptophan E. coli A B mARN Phiên mã ngừng D C 5’ 7u ARN polymerase 5’ 3’ A D N (a) A mARN Trình tự dẫn 5’ G ene cấu trúc tryptophan 5’ 3’ A D N D C B Hướng dịch mã H ướng phiên m ã (b) Dư Tryptophan: ngưng phiên mã Peptid dẫn ngăn vùng B nối với vùng CC bắt cặp với D Khi gặp codon stop cuối vùng A, ribosom tách ra 24 Điều hòa suy giảm Thiếu Tryptophan: tiếp tục phiên mã Dư Tryptophan: ngưng phiên mã 25 Vùng dẫn của cơ chế điều hịa suy giảm trên quá trình sinh tổng hợp một số acid amin 26 cAMP-CAP araB araA araDaraC O Initiator mARN Kinase Isomerase Epimerase O cAMP-CAP araC araB araA araD P P Initiator Crep: Protein điều hòa (regulator) Cảm ứng phiên mãKiểm sóat dương 6.3.4. Kiểm soát cảm ứng dương araC P araB araA araD Ara Operon: vừa kiểm sĩat cảm ứng, dương và âm C rep Có arabinose và không có glucose C rep ARN polymerase C rep B A D C I O Ngưng phiên mãKiểm sóat âm ARN polymerase Thiếu arabinose thì Crep gắn vào Operator dạng loop 27 Các sản phẩm chuyển hĩa của Ara Operon 28 Ara Operon Substrate Protein(s) Function Reversible Product L-arabinose AraA isomerase yes L-ribulose L-ribulose AraB ribulokinase no L-ribulose-phosphate L-ribulose- phosphate AraD epimerase yes D-xylulose- phosphate 29 Kiểm soát cảm ứng dương trong chuyển hóa đường Maltose RNA polymerase và activator protein ở trạng thái tự do Kích họatù sự phiên mã Không có sự phiên mã RNA polymerase và activator protein ở trạng thái kết hợp dưới tác dụng chất cảm ứng 30 Vai trị chung của cảm ứng sự tổng hợp enzym 31 3.5. Đa kiểm soát Khi cĩ mặt glucose thì vi khuẩn E. coli khơng cần thiết phải phân giải một loại đường nào khác, và các gen mã hĩa cho các enzym phân giải các đường ấy cũng đĩng lại. Hiệu ứng glucose (glucose effect): khơng cĩ glucose nhưng cĩ lactose  lac operon được cảm ứng. Nếu cĩ glucose thì sự cảm ứng của lac operon sẽ khơng xảy ra (tương tự như ở ara operon). Hiện tượng này là ức chế dị hĩa (catabolite repression) 2500lactose 50glucose + lactose 1glucose Relative Amount of β- galactosidase Sugar(s) in Growth Medium 32 Pi i lac z lac y lac a Genes mRNAs Proteins Lactose operon Locus điều hòa của lac operon Vị trí gắn CAP-cAMP Vị trí gắn RNA polymerase Operator locus (lac O) Genes cấu trúc Lac promoter (lac p) Trans- acetylase Permease β - g a l a c t o s i d a s e Repressor Inactive repressor ? Màng tế bào Không có chất cảm ứng Phức hợp cAMP-Catabolite Activator Protein hỗ trợ việc gắn RNA polymerase Khi có Glucose sẽ ít có cAMP ít phức hợp cAMP-CAP 3.5. Đa kiểm soát CAP gắn vào Lac promoter RNA polymerase không gắn được nhiều Lac operon sẽ ít được họat hóa 33 Minh họa họat động của Lac operon dưới tác động Lactose và Glucose Xem D:\regulation\Lac-Operon.avi 34 Isoleucin gắn vào vị trí điều hịa của e1thay đổi cấu trúc bậc 3, bậc 4bất họat vị trí xúc tác 1 = threonin 2 = α-ketobutyrate e1 = threonin deaminase 4 5 3 e3 e4 e5 g5 g4 g3 g2 g1 e2 Tế bào sử dụng 6.4. Kiểm soát sau dịch mã Sơ đồ kìm hãm ngược vịêc tổng hợp Isoleucine ở E. coli Sự dư thừa gây kiềm hãm ngược isoleucine X 35 Kìm hãm ngược vịêc tổng hợp Isoleucine ở E. coli