Bài giảng Các vector và quá trình tạo dòng tách gen

Khi nghiên cứu một gen mục tiêu nào của sinh vật nhân thật chúng ta thường gặp phải một số khó khăn như bộ gen của sinh vật nhân thật thường rất lớn, gen mục tiêu chỉ là một đoạn rất nhỏ trong toàn bộ bộ genom rất lớn đó. Do vậy để tách được nó ra quả là rất khó khăn. Sau khi tách rồi muốn tinh sạch và nhân nó lên để có một lượng lớn thì chúng ta buộc phải tạo nhân dòng cho gen đó. Công việc tạo dòng về cơ bản là việc gắn được trình tự gen (DNA) cần nhân vào một vector. Vector là một phân tử DNA thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó phải có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn kí chủ và sử dụng bộ máy tổng hợp của tế bào kí chủ vi khuẩn để tạo ra nhiều bản sao khác giống hệt với vector ban đầu.

doc15 trang | Chia sẻ: haohao89 | Ngày: 22/07/2013 | Lượt xem: 1547 | Lượt tải: 0download
Tóm tắt tài liệu Bài giảng Các vector và quá trình tạo dòng tách gen, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Chương XIV Các vector và quá trình tạo dòng tách gen I. Vector nh©n dßng 1. Khái niệm về vector Khi nghiên cứu một gen mục tiêu nào của sinh vật nhân thật chúng ta thường gặp phải một số khó khăn như bộ gen của sinh vật nhân thật thường rất lớn, gen mục tiêu chỉ là một đoạn rất nhỏ trong toàn bộ bộ genom rất lớn đó. Do vậy để tách được nó ra quả là rất khó khăn. Sau khi tách rồi muốn tinh sạch và nhân nó lên để có một lượng lớn thì chúng ta buộc phải tạo nhân dòng cho gen đó. Công việc tạo dòng về cơ bản là việc gắn được trình tự gen (DNA) cần nhân vào một vector. Vector là một phân tử DNA thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó phải có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn kí chủ và sử dụng bộ máy tổng hợp của tế bào kí chủ vi khuẩn để tạo ra nhiều bản sao khác giống hệt với vector ban đầu. 2. Các đặc tính của vector Plasmid vi khuẩn là mét vÐct¬ ®iÓn h×nh chøa mét phân tử DNA vòng, tự tái bản, nằm ngoài và độc lập với nhiễm sắc thể tế bào vi khuẩn ký chñ. Trong tự nhiên tồn tại rất nhiều loại plasmid khác nhau. Chủng E.coli tự nhiên thường chứa những plasmid chống lại kháng sinh, kim loại nặng, mẫn cảm với tác nhân gây đột biến, mẫn cảm hoặc chống lại sự xâm nhiễm của thực khuẩn thể v× có khả năng tạo ra được enzym giới hạn, tạo ra được những axit amin hiếm hoặc tổng hợp được những phân tử hữu cơ phức. Quá trình tái bản của plasmid có thể cần hoặc không cần enzym của chính nó tạo ra, tái bản có thể xảy ra đồng thời hoặc không đồng thời với chu kỳ của tế bào chủ. Một số plasmid chuyển tự do DNA của mình vào những loài vi khuẩn E.coli khác, một số khác thì lại không có khả năng chuyển cho bất kể loài vi khuẩn nào. Vào những năm 1970 rất nhiều các loại plasmid được tạo ra trong phòng thí nghiệm có chứa những đoạn DNA của những loại plasmid tự nhiên. Những plasmid nhân tạo này và thế hệ mới của chúng được sử dụng phổ biến trong tái tổ hợp DNA. Tất cả các plasmid dùng làm vector nhân dòng đều có cấu tạo gồm 3 thành phần gen chính, ví dụ Plasmide pGEM-T Easy là vectơ hiện đang được sử dụng rộng rãi trong kĩ nghệ nhân gen có cấu tạo như hình 1.14 và 2.14. Cấu tạo tổng quát 1 vectơ gồm: Vùng gen tự tái bản (replicator) Vùng chứa gen đánh dấu chọn lọc (selectable marker) Vị trí nhân dòng Vùng tự tái bản là một đoạn DNA chứa vị trí DNA bắt đầu tái bản (ori) đồng thời bao gồm những gen mã hóa tạo các RNA của plasmid và những protein cần thiết cho quá trình tái bản. Vùng chứa gen chọn lọc thường là trội, là gen chống kháng sinh. Hình 1.14. Sơ đồ cấu tạo vectơ nhân dòng pGEM-T Easy Hình 2.14. Trình tự multi cloning sites của vectơ nhân dòng pGEM-T Easy Vị trí nhân dòng (nhân gen ngoại) gồm các vị trí cắt bởi enzym giới hạn tại đây các đoạn gen ngoại sẽ được gắn xen vào mà không làm ảnh hưởng đến khả năng của plasmid tái bản hoặc dấu hiệu chọn lọc trong tế bào chủ. Một trong những cách để phân biệt các plasmid là khả năng tái bản hay số lượng bản copy trong một tế bào vi khuẩn nuôi trong một điều kiện môi trường nhất định. Đôi khi người ta còn xác định số lượng copy trên một nhiễm sắc thể vi khuẩn vì nếu nuôi vi khuẩn trong môi trường giàu dinh dưỡng thì một tế bào vi khuẩn có thể có 3-4 nhiễm sắc thể. Trong khi đó nếu nuôi trong môi trường bình thường thì chỉ có 1,1 nhiễm sắc thể/ 1 tế bào. Trong nghiên cứu sinh học phân tử người ta thường sử dụng những plasmid có số copy cao > 20/ 1 tế bào sinh trưởng trong môi trường LB. Một số khác muốn tăng bản copy thì cần phải có những điều kiện kiểm tra khá khắt khe như cần phải có một số protein của tế bào ký chủ, loại khác thì lại không cần và do vậy nó rất thuận lợi cho quá trình nhân dòng. Loại này khả năng tái bản của plasmid trong tế bào ký chủ tăng mạnh cả trong trường hợp khi tế bào chứa chúng bị xử lý bởi chất ức chế tổng hợp protein tế bào như chloramphenicol hoặc spectinomycin. Những plasmid có số lượng copy cao thường không có cơ chế điều khiển quá trình phân li chính xác về số bản copy plasmid vào trong các tế bào con. Ngược lại đối với loại plasmid có số bản copy/tế bào thấp thì thường bị điều khiển khá nghiêm ngặt bởi những protein được sinh ra trong chu kỳ đầu của tế bào vi khuẩn và tái bản đồng thời với quá trình tái bản nhiễm sắc thể vi khuẩn. Hầu hết các plasmid loại này đều có chứa những loci gọi là par trên DNA của nó, vị trí này giúp cho plasmid phân ly bản copy một cách chính xác vào tế bào con. Tính cạnh tranh của plasmid. Trong một tế bào vi khuẩn E.coli có thể tồn tại nhiều loại plasmid khác nhau. Plasmid nào có khả năng tái bản cao và khi tái bản không cần hòi hỏi hệ thống kiểm tra khắt khe thì sẽ tái bản mạnh dần dần thay thế các loại khác nhau trong tế bào. 3. Các yêu cầu cần thiết của một vector dùng trong sinh học phân tử - Vectơ phải có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào ký chủ không phụ thuộc vào sự sao chép của bộ gen tế bào ký chủ. - Vectơ phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng DNA tối đa. Hơn nữa, kích thước vectơ càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và hiệu quả. - Vectơ phải có những đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa chúng; các đặc tính này được mã hóa bởi các gen chọn lọc. Thông thường đó là đặc tính kháng kháng sinh hoặc khả năng sản sinh một enzym (b-galactosidase của operon lactose) chuyển hóa một cơ chất tạo màu phát hiện được trên môi trường thạch). - Vectơ phải tồn tại được trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và gây ít xáo trộn nhất cho tế bào chủ. - Vectơ phải mang những vị trí nhận biết cho mỗi enzym của một số lượng tối đa enzym giới hạn (RE). Điều này mở rộng khả năng xây dựng vectơ tái tổ hợp. Thật vậy, mỗi RE tạo một dạng đầu so le riêng, có khả năng gắn nối với một đoạn DNA mang đầu so le tương ứng. Các đầu sole càng đa dạng thì các trình tự DNA gắn vào cũng càng đa dạng hơn. Hơn nữa, các vị trí nhận biết này thường được đặt vào giữa các gen chọn lọc. Như vậy, khi một trình tự DNA gắn xen vào một vị trí cắt cũng sẽ xen được vào giữa gen và làm bất hoạt gen ấy. Tóm lại, vectơ được xem là càng mạnh khi càng có nhiều các đặc tính vừa kể. Có nhiều loại vectơ: plasmid, phage, cosmid, YAC… chọn loại vectơ nào thì phải dựa vào kích thước của đoạn DNA cần tạo dòng và mục đích tạo dòng. 4. Ứng dụng chủ yếu của các vector -Tạo dòng nhằm khuếch đại số lượng lớn bản sao của một trình tự nhất định. -Chuyển các gen vào tế bào kí chủ hay vào cơ thể sinh vật khác tạo ra sinh vật chuyển gen. -Sản xuất một lượng RNA từ DNA được tạo dòng. -Sản xuất protein với số lượng lớn từ DNA tạo dòng. II. Các vector dùng trong chuyển nạp gen 1. Plasmid và tính chất Plasmid là nhân tố di truyền ngoài nhiễm sắc, tìm thấy sống cộng sinh ở trong tế bào của rất nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Vật chất di truyền của plasmid là phân tử DNA kép, vòng có kích thước từ 1 đến 200kb. Plasmid chỉ sinh sản được trong tế bào vi khuẩn, plasmid có chứa các gen chống kháng sinh, chống kim loại nặng và rất mẫn cảm với các tác nhân gây đột biến. Khi tái sinh, plasmid có thể cần hoặc không cần protein của chính gen mình, một số plasmid chuyền một cách dễ dàng DNA của mình vào tế bào của nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Plasmid có khả năng tự nhân đôi trong tế bào vi khuẩn và hầu hết là có khả năng di động từ tế bào này sang tế bào khác. Những plasmid nào có episome thì có khả năng gắn và rời DNA của mình ra khỏi nhiễm sắc thể của vi khuẩn kí chủ một Plasmid và thể thực khuẩn l, chỉ chuyển tải và nhân được những đoạn DNA ngoại dài từ 10 đến 20 Kb. Vùng tái bản chứa đoạn DNA, trong đó có chứa vị trí DNA bắt đầu sao chép và đồng thời cũng chứa những gen tổng hợp lên các protein cần cho quá trình tự tái bản. Dấu hiệu để chọn lọc hay gen đánh dấu để chọn lọc, thường là trội và là những gen điều khiển khả năng chống kháng sinh như tetracycline và kanamycin. Vùng nhân gen là nơi chứa các vị trí cắt bởi các enzyme cắt hạn chế, tại đây mẩu gen ngoại được gắn vào và được nhân lên mà không ảnh hưởng đến cấu trúc các gen chọn lọc và tái bản. Số lượng sao chép của thể plasmid trong một tế bào vi khuẩn tuỳ theo loại plasmid, cao thì > 20 copy/ 1 tế bào, thấp thì < 20. Tính tự bất hợp của plasmid: Trong 1 tế bào vi khuẩn lúc đầu có thể cùng tồn tại nhiều loại plasmid khác nhau, loại plasmid nào sao chép nhanh hơn sẽ chiếm ưu thế và cạnh tranh mạnh hơn và cuối cùng khử bỏ các loại khác sinh sản chậm hơn. Ngày nay người ta đang bán trên thị trường rất nhiều các plasmid có kèm theo cả chủng E.coli kí chủ, môi trường nuôi cấy vi khuẩn này, và bản đồ di truyền của plasmid và cả nguyên tắc chọn lọc khi dùng để nhân gen ngoại. Muốn hiểu được cơ chế chọn lọc plasmid tái tổ hợp, chúng ta nhớ lại cơ chế điều hoà và hoạt động của Lac operon. Để tổng hợp được men b-galactosidase cần thiết để phân giải đường lactose cần có 3 gen là lacZ, lacY và lacA. LacY cần cho việc hấp thụ lactose, chỉ có LacZ chịu trách nhiệm trực tiếp tạo ra b-galactosidase. Gen LacZ lại bao gồm đoạn gen tổng hợp lên đầu C của men b- galactosidase gọi là đoạn w, còn đoạn gen chịu trách nhiệm tổng hợp đầu N của men b-galactosidase là đoạn a. Gen lacZ có mặt ở cả DNA của vi khuẩn và được nồng vào cả DNA của vectơ plasmid sống trong vi khuẩn E.coli, ở đây đoạn a nằm đúng tại vị trí nhân gen ngoại. Điều thú vị mà Monod và Jacob đã khám phá ra năm 1967 là khi vi khuẩn bị xẩy ra bất kì một đột biến đoạn a hoặc đoạn w của bất kể gen Lac của vi khuẩn hay của plasmid chứa trong nó thì đều mất khả năng tổng hợp b-galactosidase, nếu đồng thời xẩy ra đột biến ở cả đoạn a và đoạn w thì men b-galactosidase vẫn được tổng hợp bình thường, hiện tượng này gọi là hiện tượng bổ sung a (Alpha-Complementation). Người ta đã lợi dụng đặc tính này trong tái tổ hợp để chọn lọc những dòng vi khuẩn có chứa plasmid có đoạn gen ngoại được gắn vào tại vị trí đoạn a hay không. Như vậy, conoly nào chứa plasmid có đoạn DNA ngoại gắn tại vị trí nhân gen, nằm trong vùng a của gen LacZ, sẽ làm cho gen này không hoạt động, thì sẽ không tổng hợp được enzim b-galactosidase, khi nuôi cấy trong môi trường chứa Isoprony1-1 thio-b-D galactosidase (IPTG) thì conoli đó sẽ chuyển từ mầu bình thường xanh thành mầu trắng. 2. Các thực khuẩn thể vectơ Thực khuẩn thể (bacteriophage)là một dạng virut gây nhiễm trên tế bào vi khuẩn, chúng chỉ có thể sống và sinh sản được trong tế bào kí chủ, sử dụng vật chất và hệ enzim của tế bào kí chủ để tổng hợp lên các sản phẩm gen của chính mình. prophage Hình 3-14. Chu trình sống và xâm nhiễm của thể thực khuẩn Cấu tạo thể thực khuẩn gồm phần đầu dài 1000A0 rộng 700A0, có vỏ bọc ngoài là protein bên trong là lõi DNA vòng. Phần đuôi dài 1100A0, có sợi đuôi để bám vào tế bào kí chủ khi xâm nhiễm. Năm 1952, tại Cold Spring Harbor New York, bằng phương pháp phóng xạ, Alfed Hershey và Martha Chase đã chứng minh rằng khi xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn chỉ có DNA cuả thực khuẩn mới xâm nhập vào tế bào còn vỏ protein vẫn nằm bên ngoài. DNA của thực khuẩn l gồm các nhóm gen cần thiết để thực khuẩn bám, xâm nhập và phân rã tế bào như protein 0 và P cần thiết để tái bản DNA và giúp cho đầu và đuôi thực khuẩn bám dính và sinh trưởng trong tế bào. Vùng gen thứ 2 là vùng gen tái bản DNA, quá trình tái bản cần cả protein của tế bào kí chủ vi khuẩn và protein của chính thực khuẩn. Trước khi xâm nhập, tại vị trí cos, DNA vòng của thực khuẩn bị cắt ra tạo thành một sợi thẳng dài có 2 đầu đối mã (cohesive end), đây là một đặc thù cơ bản của thực khuẩn thể. Lúc này DNA của thực khuẩn có thể gắn được vào DNA của vi khuẩn, tái bản cùng với vi khuẩn hoặc có thể lại tái kết hợp để trở thành trạng thái ban đầu hình vòng. Ngoài ra để nhân gen chúng cần có các gen chọn lọc, đoạn nhân gen (polylinker). 3. Các cosmit vectơ Khi muốn nhân đoạn DNA lớn từ 30 đến 40 Kb thì phải cần đến thể cosmid vectơ. Cosmid là những plasmid vectơ được tạo ra để nhân những gen lớn của sinh vật nhân thật. Nó gồm có vùng tái bản, vùng nhân gen, gen chọn lọc và đặc biệt là có vùng cos. Vị trí cos này lấy từ thực khuẩn l, chính vì thế người ta còn gọi là thực khuẩn chứa cosmid. Khi nhiễm cosmid vào tế bào vi khuẩn phần DNA nhập vào tế bào là của plasmid, còn vị trí cos của thực khuẩn giúp cosmid bám dính vào màng tế bào. 4. Vi khuÈn vµ ®Æc ®iÓm vi khuÈn Escherichia coli a. Vi khuÈn - Vi khuÈn lµ sinh vËt ®¬n bµo, ph©n chia rÊt nhanh b»ng h×nh thøc trùc ph©n v« tÝnh, cÇn diÖn tÝch m«i tr­êng rÊt nhá, qua thêi gian ng¾n t¹o ra mét sè l­îng lín tÕ bµo vi khuÈn. - Vi khuÈn cã thÓ ®­îc nu«i cÊy trong m«i tr­êng láng, hoÆc trªn bÒ mÆt m«i tr­êng ®Æc agarose chøa chÊt dinh d­ìng tèi thiÓu. - Mçi mét tÕ bµo ph©n chia v« tÝnh sÏ t¹o thµnh 2 -> 4 -> 8 -> 16 vµ cø tiÕp tôc ph©n chia m·i cho ®Õn khi dinh d­ìng trong m«i tr­êng bÞ c¹n kiÖt hoÆc nh÷ng s¶n phÈm d­ thõa cÆn b· ®éc h¹i tÝch lòy ®Õn mét ng­ìng lµm øc chÕ sù sinh tr­ëng cña quÇn thÓ. - Khi tr¶i tÕ bµo vi khuÈn trªn bÒ mÆt ®Üa Petri chøa m«i tr­êng agarose ®Æc, tõng tÕ bµo sÏ ph©n chia t¹o thµnh mét quÇn thÓ tÕ bµo ®ång nhÊt, nÕu ®¹t 107 tÕ bµo th× m¾t th­êng cã thÓ quan s¸t thÊy ®­îc vµ gäi lµ colony. C¸c tÕ bµo trong mét colony ®Òu xuÊt ph¸t tõ mét tÕ bµo ban ®Çu. - ViÖc thu nhËn c¸c thÓ ®ét biÕn ë vi khuÈn kh¸ dÔ dµng, vÝ dô nh­ c¸c ®ét biÕn dinh d­ìng ch¼ng h¹n. Vi khuÈn b×nh th­êng cã thÓ sinh tr­ëng vµ ph©n chia trong m«i tr­êng tèi thiÓu chØ chøa mu«Ý v« c¬, nguån cacbon cung cÊp n¨ng l­îng vµ n­íc. NÕu cã ®ét biÕn mÊt kh¶ n¨ng tæng hîp mét sè chÊt ch¼ng h¹n nh­ adenine, threonine hoÆc biotin th× c¸c ®ét biÕn nµy sÏ kh«ng sinh tr­ëng ®­îc trõ khi ph¶i thªm vµo m«i tr­êng c¸c chÊt trªn. - §ét biÕn n÷a lµ kh¶ n¨ng sö dông nguån n¨ng l­îng ®Æc biÖt, thÝ dô d¹ng d¹i lac+ sinh tr­ëng trong ®iÒu kiÖn cã ®­êng lactose trong khi ®ã d¹ng ®ét biÕn lac- th× kh«ng thÓ sinh tr­ëng trong m«i tr­êng chØ cã lactose.r - §ét biÕn kh¸ng l¹i kh¸ng sinh cã kh¶ n¨ng sinh tr­ëng trong m«i tr­êng chøa kh¸ng sinh. - C¸c nhµ di truyÒn dùa vµo c¸c d¹ng ®ét biÕn ®Ó ph©n biÖt c¸c chñng vi khuÈn víi nhau, chóng trë thµnh nh÷ng chØ thÞ di truyÒn. - Mét sè ký hiÖu kiÓu h×nh ®ét biÕn th­êng ®­îc sö dông trong nghiªn cøu di truyÒn vi khuÈn nh­ sau: + bio- : lµ d¹ng ®ét biÕn cÇn ph¶i bæ sung biotin vµo m«t tr­êng tèi thiÓu th× míi sinh tr­ëng ®­îc. + arg- lµ d¹ng ®ét biÕn cÇn ph¶i bæ sung arginine vµo m«t tr­êng tèi thiÓu th× míi sinh tr­ëng ®­îc. + met- lµ d¹ng ®ét biÕn cÇn ph¶i bæ sung methionine vµo m«t tr­êng tèi thiÓu th× míi sinh tr­ëng ®­îc. + lac- lµ d¹ng ®ét biÕn kh«ng sö dông ®­êng lactose lµm nguån c¸cbon ®­îc. + gal- lµ d¹ng ®ét biÕn kh«ng sö dông ®­êng galactose lµm nguån c¸cbon ®­îc + strr lµ d¹ng ®ét biÕn kh¸ng l¹i kh¸ng sinh streptomycin + strs lµ d¹ng ®ét biÕn mÉn c¶m víi kh¸ng sinh streptomycin - VÝ dô chñng A kÝ hiÖu: met- bio- thr+ leu+thi+ lµ d¹ng ®ét biÕn chØ sinh tr­ëng ®­îc nÕu trong m«i tr­êng tèi thiÓu ®­îc bæ sung thªm methionine vµ biotin. Chñng B kÝ hiÖu: met + bio + thr - leu – thi – lµ dßng ®ét biÕn chØ sinh tr­ëng ®­îc nÕu m«i tr­êng tèi thiÓu ®­îc bæ sung thªm threonine, leucine vµ thiamine. b. Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) vai trò và tính chất Vi khuẩn E.coli ®Çu tiªn ®­îc ph¸t hiÖn vµ ®Æt tªn bëi mét nhµ vi khuÈn häc ng­êi §øc tªn lµ Theodore Escherich. Lµ vi khuÈn sèng trong ®­êng ruét cña ng­êi vµ ®éng vËt, ký sinh lµnh tÝnh nh­ng thØnh tho¶ng cã g©y ra bÖnh viªm nhiÔm èng tiÕt liÖu vµ Øa chÈy. E. coli cã nhiÒu ®Æc tÝnh ­u viÖt nh­: khả năng sinh sản rất nhanh trong môi trường tối thiểu chỉ chứa đường glucose cung cấp năng lượng, một số muối khoáng làm nguồn nitơ, lân và kim loại hiếm. Chúng có thể sinh sản rất nhanh trong môi trường giầu dinh dưỡng, sau khi cấy 20 đến 30 phút, số lượng có thể tăng gấp đôi. CÊu t¹o tÕ bµo h×nh ch·o, kÝch th­íc nhá kho¶ng 1 micromet, có 3 l«ng roi t¸c dông b¸m vµo tÕ bµo cña m« ®éng vËt, chøa một nhiễm sắc thể vòng dài 4,6 triệu bp. Chøa 4000 gen kh«ng cã intron, trong ®ã 35% sè gen ch­a biÕt chøc n¨ng. Giai ®o¹n h÷u tÝnh do chøa yÕu tè F gäi lµ yÕu tè ®ùc (yÕu tè cho). Cã thÓ chøa mét sè lo¹i plasmid kh¸c mang nh÷ng gen gióp tÕ bµo vi khuÈn sèng ®­îc trong m«i tr­êng ®Æc biÖt nhê cã chøa nh÷ng gen kh¸ng kh¸ng sinh. Chóng cã nhiÒu kiÓu h×nh biÓu hiÖn vÒ kÝch th­íc colony, tÝnh kh¸ng kh¸ng sinh, ®Æc tÝnh sö dông nguån c¸cbon vµ nhuém mµu cã thÓ quan s¸t gièng nh­ kiÓu h×nh cña sinh vËt nh©n thËt. V× thÕ, vi khuÈn cã nhiÒu ®Æc tÝnh thuËn tiÖn cho nghiªn cøu di truyÒn vµ trong tái tổ hợp DNA, hầu hết các vectơ đều dùng E.coli làm tế bào kí chủ để nhân bản DNA của mình. 5. NÊm men vµ vect¬ ( Saccharomyces cerevisiae) a. NÊm men - Lµ nÊm men b¸nh mú, thuéc sinh vËt nh©n thËt, nÊm men cã hÇu hÕt nh÷ng ®Æc tÝnh cña sinh vËt nh©n thËt bËc cao. V× thÕ nã ®­îc lùa chän trong nhiÒu nghiªn cøu nh÷ng vÊn ®Ò vÒ sinh häc ph©n tö cña sinh vËt nh©n thËt. Nu«i cÊy nÊm men rÊt ®¬n gi¶n, kinh tÕ vµ nhanh, chØ sau 90 phót trong m«i tr­êng giÇu dinh d­ìng th× quÇn thÓ cã thÓ t¨ng gÊp ®«i. Ng­êi ta dïng nÊm men trong c¶ nu«i cÊy h¶o vµ yÕm khÝ, trªn c¶ m«i tr­êng láng lÉn agarose ®Æc víi dung tÝch sinh khèi lín. Nã cã thÓ sinh tr­ëng trªn m«i tr­êng tèi thiÓu chøa dextrose hay glucose lµm nguån c¸c bon, muèi kho¸ng cung cÊp nit¬, l©n vµ kim lo¹i hiÕm kh¸c. Nã sinh tr­ëng m¹nh trªn m«i tr­êng protein vµ dÞch chiÕt tÕ bµo nÊm men - N©m men cã thÓ tån t¹i æn ®Þnh ë c¶ tr¹ng th¸i ®¬n vµ l­ìng béi. TÕ bµo ®¬n béi tån t¹i 2 d¹ng giao phèi lµ a vµ alpha, cßn tÕ bµo l­ìng béi chøa a/alpha vµ lµ kÕt qu¶ phèi hîp gi÷a tÕ bµo a vµ alpha. D¹ng l­ìng béi cã thÓ sinh tr­ëng nguyªn ph©n, nh­ng nÕu nu«i cÊy trong m«i tr­êng thiÕu c¸cbon vµ nit¬ th× nã sÏ xÈy ra qu¸ tr×nh ph©n bµo gi¶m nhiÔm ®Ó t¹o thµnh c¸c bµo tö n»m trong mét cÊu tróc gäi lµ ascus (c¸i bäc). NÕu dïng enzyme ph©n gi¶i líp vá tÕ bµo bäc sÏ thu ®­îc c¶ 4 bµo tö, ®­îc dïng ®Ó nghiªn cøu qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp vµ sù duy tr× æn ®Þnh cña c¸c gen, mµ kh«ng sinh vËt nh©n thËt nµo cã ®­îc ®Æc tÝnh nµy. - TÕ bµo nÊm men ®¬n béi cã hµm l­îng DNA b»ng 15 Mb chØ b»ng 3,5 lÇn cña vi khuÈn E.coli, chøa 16 nhiÔm s¾c thÓ d¹ng th¼ng, mçi chiÕc dµi tõ 200 – 2200 kb, hiÖn ®· ®Þnh vÞ ®­îc h¬n 900 gen. V× thÕ nhiÔm s¾c thÓ lín nhÊt cña nÊm men vÉn nhá h¬n 100 lÇn so víi nhiÔm s¾c thÓ trung b×nh cña ®éng vËt, nªn nã ®­îc dïng ®Ó nh©n dßng c¸c gen trong nhiÔm s¾c thÓ vµ nghiªn cøu cÊu tróc nhiÔn s¾c thÓ. - C¸c gen trªn c¸c nhiÔm s¾c thÓ kh¸c nhau sÏ ph©n ly ®éc lËp víi nhau theo nhãm liªn kÕt. - Cã 3 kiÓu yÕu tè cÊu tróc ®ßi hái ®èi víi nhiÔm s¾c thÓ chøc n¨ng cña nÊm men ®· ®­îc x¸c ®Þnh vµ nh©n dßng lµ ®o¹n gèc t¸i b¶n (ARS element), t©m ®éng (CEN element) vµ telomere. Muèn nh©n 3 yÕu tè nµy th× ®ßi hái ph¶i t¹o ra ®­îc nhiÔm s¾c thÓ nh©n t¹o. NhiÔm s¾c thÓ nh©n t¹o ®­îc sö dông ®Ó nghiªn cøu qu¸ tr×nh ghÐp cÆp, t¸ch vµ ph©n ly cña c¸c nhiÔm s¾c thÓ trong gi¶m vµ nguyªn ph©n. §Æc biÖt ng­êi ta sö dông nhiÔm s¾c thÓ nh©n t¹o ®Ó nh©n dßng nh÷ng ®o¹n DNA dµi tíi 400 kb. b. Vect¬ trong nÊm men - Gièng nh­ E. coli, nÊm men ®­îc sö dông réng r·i lµm ký chñ trong nh©n dßng gen. Cã 5 lo¹i plasmid dïng nÊm men lµm ký chñ lµ: YIp, YRp, YCp, YEp vµ YLp, trong ®ã trõ plasmid YLp (cã DNA th¼ng) kh«ng ký sinh ®­îc trong E.coli, sè cßn l¹i ®Òu ký sinh ®­îc trong E.coli. - C¸c vÐct¬ nµy chøa 2 kiÓu gen chän läc kh¸ng l¹i kh¸ng sinh, ®Òu lµ gen tréi, cã thÓ n»m trong genome nÊm men hoÆc trong genome plasmid. - ë vi khuÈn ký chñ, tÝnh kh¸ng kh¸ng sinh lu«n lµ tréi v× gen nµy chØ cã trong genome cña plasmid chø kh«ng cã trong vi khuÈn. Ng­îc l¹i, mét gen cña nÊm men ®­îc nh©n dßng ë plasmid cã thÓ ®ang tån t¹i trong genome nÊm men. V× thÕ gen chän läc chØ biÓu hiÖn tÝnh tréi mét khi gen ®ã trong tÕ bµo nÊm men ký chñ lµ gen lÆn - YIp (yeast integrating plasmid) lµ plasmid hîp nhÊt víi nÊm men, chøa nh÷ng gen chän läc nÊm men nh­ng thiÕu nh÷ng tr×nh tù gen cho phÐp chóng t¸i b¶n ®éc lËp víi ký chñ nÊm. Thay vµo ®ã, nã cã qu¸ tr×nh kÕt g¾n DNA cña m×nh vµo nhiÔm s¾c thÓ nÊm ký chñ b»ng c¸ch trao ®æi chÐo ®äan t­¬ng ®ång gi÷a tr×nh tù trªn plasmid víi nhiÔm s¾c thÓ nÊm men. KÕt qu¶ t¹o ra nh÷ng lÆp ®o¹n r¶i r¾c tr×nh tù cña nÊm sen k
Tài liệu liên quan