Bố trí thí nghiệm quan sát cấu tạo, hoạt động của tinh trùng và đánh giá một số chỉ tiêu sinh lí của tinh dịch phục vụ cho thực hành nội dung sinh lí sinh sản, học phần Sinh lí người và động vật

JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE 2014, Vol. 59, No. 6BC, pp. 125-130 This paper is available online at BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM QUAN SÁT CẤU TẠO, HOẠT ĐỘNG CỦA TINH TRÙNG VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÍ CỦA TINH DỊCH PHỤC VỤ CHO THỰC HÀNH NỘI DUNG SINH LÍ SINH SẢN, HỌC PHẦN SINH LÍ NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT Nguyễn Đình Dũng1, Nguyễn Văn Hiền2 1Văn phòng Đảng uỷ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Tóm tắt. Đặc điểm cấu tạo, hoạt động của tinh trùng, các đặc điểm sinh lí của tinh dịch là những nội dung quan trọng trong nghiên cứu và giảng dạy sinh lí người và động vật. Bài viết này đề cập đến cách bố trí thí nghiệm để nghiên cứu đặc điểm cấu tạo, hoạt động của tinh trùng, các chỉ tiêu sinh lí của tinh dịch. Các đặc điểm của tinh trùng được đề cập đến là hình thái, cấu tạo chung, acrosome, tinh trùng kì hình, các dạng vận động và đặc tính của tinh trùng. Các chỉ tiêu sinh lí của tinh dịch hoạt lực tinh trùng, tỉ lệ tinh trùng kì hình. Các phương pháp nghiên cứu được đề xuất là giải đông tinh đông lạnh trong nước ấm ở 37◦C trong 50 giây; sử dụng dung dịch formon citrate 2,9% (hoặc formon Salina) trong 5 - 7 phút để cố định tiêu bản; sử dụng dung dịch Acro - stain của hãng IMV (Pháp) để nhuộm acrosome của tinh trùng. Từ khóa: Tinh nguyên; tinh đông lạnh; cấu tạo, hoạt động của tinh trùng; chỉ tiêu sinh lí của tinh dịch. 1. Mở đầu Theo Bộ Giáo dục và Đào tạo, để nâng cao chất lượng đào tạo cần tập trung nhiều vào công tác học tập của sinh viên, cần làm cho người học trở nên năng động trong việc học của chính mình (Bộ Giáo dục và Đào tạo, 2005). Phương pháp lĩnh hội kiến thức thông qua thực hành, thí nghiệm đã được khẳng định có hiệu quả cao trong dạy học nói chung và dạy học Sinh học nói riêng. Phương pháp dạy học thực hành là phương pháp giảng dạy trên cơ sở quan sát giáo viên làm mẫu và thực hiện tự lực của người học dưới sự hướng dẫn của giáo viên nhằm hoàn thành các bài tập, các công việc thuộc chuyên ngành, từ đó hình thành các kĩ năng, kĩ xảo. Thêm vào đó, phương pháp dạy học thực hành còn giúp người học củng cố tri thức, phát triển năng lực tư duy để có đủ khả năng xử lí các tình huống nghề nghiệp trong thực tế cuộc sống [3,7]. Trong nghiên cứu và giảng dạy nội dung sinh lí sinh sản, học phần Sinh lí người và Động vật, đặc điểm cấu tạo, hoạt động của tinh trùng, các chỉ tiêu sinh lí của tinh dịnh là một nội dung được người học đặc biệt quan tâm. Các đặc điểm này của tinh trùng và tinh dịch từ lâu đã được đề cập đến trong nhiều tài liệu Sinh học [1,2,4]. Tuy nhiên, những hình ảnh dù được xuất bản với chất Liên hệ: Nguyễn Đình Dũng, e-mail: nddung@hnue.edu.vn 125 Nguyễn Đình Dũng, Nguyễn Văn Hiền lượng hình ảnh cao đến đâu, số liệu thống kê cụ thể như thế nào cũng không sinh động, tạo được hiệu quả ghi nhớ cao bằng quan sát hình ảnh được thực tế. Đặc biệt, những mẫu vật đó được tự tay người học làm sẽ tạo được sự hứng khởi trong chủ động lĩnh hội tri thức ở người học. Bài viết này đề cập đến cách bố trí thí nghiệm nghiên cứu cấu tạo, hoạt động của tinh trùng và đánh giá một số chỉ tiêu sinh lí của tinh dịch nhằm nâng cao hiệu quả dạy học nội dung Sinh lí sinh sản, học phần Sinh lí người và Động vật. 2. Nội dung nghiên cứu 2.1. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu Vật liệu Sử dụng tinh dịch dạng tinh nguyên và tinh đông lạnh của lợn đực khoẻ mạnh, đã trưởng thành về sinh dục thuộc giống lợn Yorkshire và Landrace. Nội dung nghiên cứu Cấu tạo, các dạng vận động của tinh trùng và một số chỉ tiêu sinh lí của tinh dịch lợn. Phương pháp giải đông tinh đông lạnh. Phương pháp làm tiêu bản quan sát cấu tạo, hình thái tinh trùng. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp đánh giá chất lượng tinh nguyên Nồng độ tinh trùng được đánh giá bằng máy so màu SDM-S của hãng Minitub (Đức). Hoạt lực tinh trùng, tỉ lệ tinh trùng kì hình được nghiên cứu dựa trên sử dụng phần mềm Sperm Vision 3.0. Phương pháp giải đông Cọng rạ sau khi đông lạnh trong nitơ lỏng được giải đông bằng nước ấm ở nhiệt độ và thời gian khác nhau, sau đó pha loãng với môi trường BTS. 2.2. Kết quả và thảo luận Đặc điểm vận động của tinh trùng và cách tiến hành thí nghiệm để quan sát * Đặc tính chuyển động tới trước Tinh trùng còn sống luôn luôn chuyển động. Sự chuyển động của tinh trùng là nhờ phần cổ- thân và phần đuôi. Trong khi vận động, đuôi tinh trùng luôn uốn éo, co rút tạo áp lực cho tinh trùng tiến về phía trước. Ngoài ra do phần đầu tinh trùng có hình khí động học (hình quả lê, hình chùy), có khả năng xoay tròn quanh trục thân, kết hợp với sự vận động xoay tròn của cổ - thân và đuôi tạo thành véc tơ chuyển động thẳng tới trước. Tốc độ di chuyển tới trước của tinh trùng phụ thuộc vào các điều kiện nội tại (sức sống của tinh trùng) và ngoại cảnh (niêm dịch đường sinh dục cái tiết ra nhiều hay ít; mức độ đặc, loãng của tinh dịch; phương thức phóng tinh của con đực; mức độ co bóp của các bộ phận bên trong đường sinh dục cái trong đó chủ yếu là sừng tử cung và ống dẫn trứng). Tốc độ di chuyển của tinh trùng còn phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường. Ở nhiệt độ từ 38 - 40◦C, tinh trùng chuyển động nhanh, nhưng ở nhiệt độ 5◦C, tinh trùng gần như không vận động. Ngoài ra, tốc độ vận động của tinh trùng còn phụ thuộc vào mức độ thành thục của chính nó. Tốc độ trung bình của tinh trùng ngựa thành thục trong cơ quan sinh dục cái là 5mm/phút; tinh trùng bò, dê: 4 mm/phút và tinh trùng thỏ, chó: 2 mm/phút. 126 Bố trí thí nghiệm quan sát cấu tạo, hoạt động của tinh trùng và đánh giá một số... Sự vận động của tinh trùng gắn liền với hoạt động của enzym và trao đổi chất. Ở dịch hoàn phụ, tinh trùng gần như không vận động, nhưng khi được phóng ra, gặp tinh thanh nó hoạt động ngay lập tức vì nó được hoạt hóa bởi các enzym và cơ chất có trong tinh thanh. Trạng thái hoạt động của tinh trùng thể hiện chất lượng tinh dịch. Nếu tinh trùng hoạt động càng mạnh thì chất lượng càng tốt. Tinh trùng có 3 hình thức vận động cơ bản [1]: + Vận động tiến thẳng: Đây là những tinh trùng có khả năng thụ thai. + Vận động xoay tròn: Tinh trùng vận động và di chuyển theo một vòng tròn, những tinh trùng có dạng vận động này thường không có khả năng thụ thai. + Vận động tại chỗ: Là dạng vận động kiểu “lắc lư” tại chỗ, nghĩa là vị trí không gian của tinh trùng không thay đổi. Tinh trùng loại này thường là những tinh trùng non hoặc bị dị tật không có khả năng thụ thai. Với công nghệ kĩ thuật số người ta có thể xác định được các dạng chuyển động, tốc độ chuyển động của tinh trùng và xác định được khoảng cách tinh trùng chuyển động trong khoảng thời gian nhất định đó là khoảng cách, vận tốc chuyển động theo đường ziczăc, theo đường trung bình và theo đường thẳng. + DCL (Distance Curve Line): Độ dài đường ziczăc (µm). + DAP (Distance Average Path): Độ dài đường trung bình (µm). + DSL (Distance Straight Line): Độ dài đường thẳng (µm). Tương ứng với mỗi dạng chuyển động trên, người ta cũng đã xác định được tốc độ chuyển động của tinh trùng ở 3 dạng đường đi là: + VCL (Velocity Curve Line): Tốc độ chuyển động theo đường ziczăc (µm/giây). + VAP (Velocity Average Path): Tốc độ chuyển động theo đường trung bình (µm/giây). + VSL (Velocity Straight Line): Tốc độ chuyển động theo đường thẳng (µm/giây). Hình 1: Các dạng vận động của tinh trùng Để quan sát và đo được các dạng vận động này của tinh trùng cần sử dụng kính hiển vi kết nối với máy tính có cài sẵn phần mềm Sperm Vision 3.0. Tiến hành bằng cách: Dùng Micropipet hút lấy 0,23 µl tinh nguyên hoặc tinh pha, bơm vào phiến kính chuyên dụng, quan sát dưới kính hiển vi và đánh giá bằng phần mềm trong máy tính. Nếu không có hệ thống máy tính cài đặt phần mềm Sperm Vision 3.0 vẫn có thể quan sát được các dạng vận động của tinh trùng bằng cách: nhỏ một giỏ tinh dịch lên phiến kính, đậy lamen lên trên giọt tinh dịch và quan sát dưới kính hiển vi thường. Với cách thí nghiệm này chỉ có thể quan sát được các dạng vận động và đường đi của tinh trùng, không đo được các số đo cụ thể. * Đặc tính lội ngược dòng Tinh trùng có xu thế lội ngược dòng niêm dịch của đường sinh dục cái. Khi vào trong đường sinh dục cái gặp dòng niêm dịch chảy ngược, vận tốc chuyển động của tinh trùng sẽ tăng từ 2-2,5 127 Nguyễn Đình Dũng, Nguyễn Văn Hiền lần. Nhờ có đặc tính này, khi gặp dòng niêm dịch chảy ra của đường sinh dục cái, tất cả tinh trùng đang chuyển động hỗn loạn đều vận động về cùng một hướng: tiến vào phía ống dẫn trứng. Để quan sát được đặc tính này của tinh trùng cần tiến hành bằng cách: nhỏ một giọt tinh nguyên hoặc tinh pha lên phiến kính, sau đó đưa lên quan sát trên kính hiển vi. Qua kính hiển vi có thể quan sát được hướng chảy của tinh dịch và hướng chuyển động của tinh trùng ngược với hướng chảy của tinh dịch. * Đặc tính tiếp xúc với vật lạ Trong khi vận động, nếu gặp các vật lạ (hạt bụi, bọt khí, trứng...), tinh trùng sẽ tiến đến bao vây lấy vật lạ đó. Nhờ có đặc tính này, khi vào đường sinh dục cái, tinh trùng luôn có xu thế bao vây lấy trứng, phá hủy các màng của tế bào trứng, đi vào nhân hoàn thành quá trình thụ tinh để tạo thành hợp tử. Để quan sát được đặc tính này của tinh trùng cần tiến hành bằng cách: Nhỏ một giọt tinh nguyên hoặc tinh pha lên phiến kính. Lấy một hạt bụi bất kì đặt vào giọt tinh dịnh và quan sát trên kính hiển vi sẽ thấy tinh trùng bao vây lấy hạt bụi đồng thời tiến hành công phá hạt bụi đó. Ngoài ra, nếu trong giọt tinh dịch có bọt khí hoặc các vật lạ khác cũng quan sát thấy hiện tượng tương tự. * Đặc tính tiếp xúc với điện Trong thời gian động dục, ống dẫn trứng và tử cung con cái có một điện thế nhất định và bản thân tinh trùng cũng mang điện, do đó có một điện thế được thiết lập giữa tinh trùng và ống dẫn trứng. Đặc tính của dòng điện là chạy từ nơi có điện thế cao đến nơi có điện thế thấp, cho nên tinh trùng vận chuyển theo một hướng nhất định. Có thể tiến hành thí nghiệm quan sát đặc tính này của tinh trùng bằng cách: Lấy hai cốc đựng tinh dịch, cho một dòng điện có hiệu điện thế 3,55 vol vào trong một cốc, cốc còn lại không cho dòng điện. Kết quả quan sát cho thấy tinh trùng trong cốc có dòng điện hoạt động mạnh hơn so với tinh trùng trong cốc không có dòng điện. Chế độ giải đông tinh dịch đông lạnh khi sử dụng tinh đông lạnh quan sát cấu tạo, hoạt động của tinh trùng Tinh nguyên là vật liệu thí nghiệm tốt nhất cho quan sát cấu tạo, hoạt động của tinh trùng. Tuy nhiên, không phải lúc nào cũng có tinh nguyên để phục vụ cho thực hành. Khi không có tinh nguyên có thể sử dung tinh đông lạnh thay thế. Tinh dịch khi đông lạnh sẽ ở trạng thái thủy tinh. Để có tinh dịch phục vụ cho thực hành cần phải có một khâu không thể thiếu là giải đông tinh dịch. Trong giải đông tinh dịch, nếu giải đông bằng cách tăng nhiệt độ từ từ thì khi nhiệt độ đạt -10◦C đến 0◦C tế bào chất sẽ chuyển sang pha kết tinh hoá làm cho cấu trúc của tinh trùng bị phá vỡ, tinh trùng chết nhanh chóng. Để tránh xảy ra hiện tượng này, khi giải đông tinh dịch cần ủ nóng nhanh dịch để tế bào chất cũng tan chảy nhưng không chịu đựng pha kết tinh hóa. Để giải đông tinh dịch có thể sử dụng nước ấm trong thời gian khác nhau. Thời gian và nhiệt độ giải đông có thể được tiến hành theo các chế độ: - Giải đông ở 37◦C trong 30 giây. - Giải đông ở 37◦C trong 50 giây. - Giải đông 40◦C trong 30 giây. - Giải đông 40◦C trong 50 giây. Sau khi giải đông trong nước ấm, tinh dịch được pha với môi trường BTS ở 37◦C để kiểm tra hoạt lực. Kết quả hoạt lực của tinh trùng sau giải đông được thể hiện ở Bảng 1. 128 Bố trí thí nghiệm quan sát cấu tạo, hoạt động của tinh trùng và đánh giá một số... Bảng 1: Hoạt lực của tinh trùng sau giải đông Chế độ giải đông Hoạt lực của tinh trùng N X ± mx Cv% 37◦C trong 30 giây 98 28,12 ± 1,90 12,04 37◦C trong 50 giây 98 35,67 ± 1,14 11,27 40◦C trong 30 giây 98 32,10 ± 0,97 7,45 40◦C trong 50 giây 98 34,98 ± 1,57 9,23 Kết quả trên cho thấy, phương pháp giải đông ở nhiệt độ 37◦C trong 50 giây cho kết quả cao nhất. Không có sự sai khác giữa hoạt lực của phương pháp giải đông này so với hoạt lực của phương pháp giải đông ở nhiệt độ 40◦C trong 50 giây. Ngược lại, có sự sai khác về hoạt lực với phương pháp giải đông ở nhiệt độ 37◦C trong 30 giây và 40◦C trong 30 giây [6]. Quan sát cấu tạo của tinh trùng Cấu tạo của tinh trùng có thể quan sát được thông qua phần mềm Sperm Vision 3.0. Nếu không có hệ thống phần mềm này có thể tiến hành làm tiêu bản cố định bằng cách: Lấy hai phiến kính rửa sạch, sấy khô, nhỏ một giọt tinh dịch lên một phiến kính, dùng phiến kính kia gạt cho tinh dịch dàn đều và mỏng. Để hong khô ngoài không khí khoảng 5 phút. Sau đó dùng dung dịch formon citrate 2,9% (hoặc formon Salina) nhỏ lên mẫu tinh, dàn đều cho dung dịch formon phủ hết, để 5 - 7 phút cho khô (cố định tiêu bản). Sau khi formon đã khô, dùng lamen đậy lên và cố định lamen. Nhỏ một giọt dầu soi kính lên tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi phản pha với độ phóng đại 10 x 100 lần. Trong quá trình quan sát cần phân biệt cấu tạo các phần của tinh trùng, phân biệt tinh trùng bình thường, tinh trùng kì hình và tính tỉ lệ phần trăm tinh trùng kì hình trong tinh dịch [6]. Tỉ lệ phần trăm tinh trùng kì hình bằng số tinh trùng kì hình x 100/tổng số tinh trùng quan sát được. Nhuộm và quan sát acrosome của tinh trùng Acrosome (thể đỉnh) là thể nằm trong phần đầu của tinh trùng. Acrosome chứa enzim phân hủy vỏ trứng, giúp tinh trùng xâm nhập vào trứng. Chỉ có các tinh trùng có acrosome nguyên vẹn mới có thể tham gia thụ tinh. Vì vậy, tỉ lệ tinh trùng có acrosome nguyên vẹn là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng tinh dịch. Để quan sát acrosome cần tiến hành bằng cách: nhỏ một giọt tinh nguyên hoặc tinh pha lên trên phiến kính. Sau đó nhỏ một giọt dung dịch Acro - Stain của hãng IMV (Pháp) bên cạnh giọt tinh. Dùng đũa thuỷ tinh trộn đều, dàn mỏng tiêu bản trên phiến kính rồi để khô. Xem qua kính hiển vi với độ phóng đại 10 × 40 (có kính hiển vi phản pha càng tốt). Đếm số tinh trùng không còn acrosome nguyên vẹn. Lấy tổng số tinh trùng còn acrosome nguyên vẹn trên tổng số tinh trùng đếm được đó chính là (%) acrosome nguyên vẹn. Theo Johnson (1981) khi nghiên cứu tinh dịch lợn Đại bạch và Landrace cho biết tỉ lệ tinh trùng có acrosome bình thường đạt 91% [8]. Theo Đào Đức Thà và cs (2009) cho thấy tỉ lệ acrosome nguyên vẹn ở giống lợn Yorkshine và Landrace đạt 93,3% [6]. 3. Kết luận Tinh dịch lợn dạng nguyên hoặc tinh dịch lợn đông lạnh đều sử dụng được trong thực hành quan sát cấu tạo và đánh giá một số chỉ tiêu sinh lí của tinh dịch. 129 Nguyễn Đình Dũng, Nguyễn Văn Hiền Phương pháp đem lại hiệu quả cao trong nghiên cứu cấu tạo, hoạt động của tinh trùng và đánh giá chỉ tiêu sinh lí của tinh dịch là: - Sử dụng phần mềm Sperm Vision 3.0 trong thực hành quan sát cấu tạo, hoạt động của tinh trùng. - Sử dụng phương pháp giải đông ở nhiệt độ 37◦C trong 50 giây để giải đông tinh dịch đông lạnh. - Sử dụng dung dịch formon citrate 2,9% (hoặc formon Salina) trong 5 - 7 phút để cố định tiêu bản quan sát cấu tạo hình thái tinh trùng, thống kê tỉ lệ tinh trùng kì hình. - Sử dụng dung dịch Acro - Stain của hãng IMV (Pháp) để nhuộm và quan sát acrosome của tinh trùng, thống kê tỉ lệ tinh trùng bị hư hỏng acrosome. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Tấn Anh, 1985. Một vài đặc điểm sinh vật học của tinh trùng. Tạp chí KHKT NN số 278, 376 - 377. [2] Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Văn Hoan, 2000. Giáo trình Sinh lí sinh sản gia súc. Nxb Nông nghiệp Hà Nội. [3] Đinh Quang Báo, Nguyễn Đức Thành, 1996. Lí luận Dạy học Sinh học. Nxb Giáo dục. [4] Trịnh Hữu Hằng, Đỗ Công Huỳnh, 2007. Sinh lí học người và động vật, tập 2. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. [5] Lương Tất Nhợ và cộng sự. Khảo sát đánh giá chất lượng tinh dịch 3 giống lợn Yorkshire, Duroc, Landrace. [6] Đào Đức Thà, Đỗ Hữu Hoan, Nguyễn Đình Dũng, Văn Lệ Hằng, 2009. Ảnh hưởng tốc độ ly tâm, chế độ cân bằng, môi trường, thời gian đông lạnh và chế độ giải đông đến chất lượng tinh dịch lợn dạng cọng rạ. Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi. Số 18 = 2009. [7] Đặng Thị Dạ Thủy, 2012. Bài tập thí nghiệm trong nghiên cứu tài liệu mới trong dạy học môn Sinh học ở trường phổ thông. Tạp chí Giáo dục số đặc biệt 11/2012, Tr 107 = 109. [8] L. A. Johnson, J. G. Aalbers, C.M.T. Willems and W. Sybesma, 1981. Use of Boar Spermatozoa for Artificial Insemination. I. Fertilizing Capacity of Fresh and Frozen Spermatozoa in Sows on 36 Farms. J ANIM SCI 1981, 52:1130-1136. ABSTRACT Arrange experiments to research of structure characteristics and activity of sperm, and the physiological features of semen use for practical reproductive physiology, human and animals physiology Sperm structure characteristics, sperm activity and physiological characteristics of semen are the important contents in studying and teaching human and animals physiology. This article refers to experiments to research of structure characteristics and activity of sperm, and the physiological features of semen as well. The sperm characteristics mentioned in this article are morphology, general structure, acrosome, anormality rate, and movement form. The physiological parameters of semen include sperm motility, sperm unusual rate. In order to thrawing frozen semen, it is suggested that semen should be warmed up in water at 37◦C for 50 seconds; then formol citrate solution 2.9% (or formol Salina) is used to fixe specimen in 5-7 minutes. Acro -stain is use to make the slice to see sperm acrosome morphology. 130