Phương pháp kiểm tra vi sinh vật trong sản phẩm thuỷ sản

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN Chương VI YÊU CẦU TRONG LẤY MẪU, XỬ LÝ MẪU, TIẾP NHẬN MẪU TẠI PHÒNG THÍ NGHIỆM Phương pháp thu, bảo quản và vận chuyển mẫu • Các khái niệm ▫ Mẫu ban đầu: Mẫu ban đầu được lấy từ các bao bì chứa đựng (hay đơn vị chứa) khác nhau, ở các vị trí khác nhau để đảm bảo tính chất đại diện trung bình cho lô hàng. Số lượng của mẫu ban đầu tuỳ thuộc vào số lượng đơn vị chứa của lô hàng. ▫ Mẫu trung bình: Mẫu trung bình là lượng mẫu cần thiết lấy ra từ mẫu ban đầu sau khi đã trộn đều mẫu ban đầu. Nó phụ thuộc vào loại và dạng sản phẩm ban đầu. ▫ Mẫu phân tích: Mẫu phân tích là lượng mẫu cần thiết dùng cho quá trình phân tích được lấy ra từ mẫu trung bình. Các loại mẫu đều được dán nhãn • Phải đảm bảo 2 điều kiện: - Mẫu có tính đại diện cho lô hàng, lượng mẫu đủ để phân tích. - Thành phần & số lượng VSV ko được biến đổi kể từ khi lấy mẫu đến khi phân tích. Cách tiến hành lấy mẫu • Mẫu dạng hạt: ngũ cốc, cà phê, trong lô hàng có số lượng bao dưới 5 thì bao nào cũng lấy một ít ở vị trí khác nhau. Trong lô hàng từ 6 - 100 bao thì lấy ít nhất 5 bao, trong lô có số bao lớn hơn 101 trở lên thì lấy ít nhất 5% số bao .v.v. Dụng cụ lấy mẫu là xiên lấy mẫu • Lô hàng sắp theo hình vuông, gạch 2 đường chéo lấy mẫu ở 2 tam giác đối diện bất kỳ • Mẫu ban đầu phải có khối lượng 3 – 5 kg Mẫu dạng lỏng: rượu, nước mắm • Sản phẩm trong phy hay bồn lớn thì dùng ống xi phông, ống hút có độ dài khác nhau để lấy mẫu ở các vị trí khác nhau: trên, giữa và ở đáy, rồi trộn đều. Lượng mẫu tối thiểu là 2 lít mẫu trung bình. • Nếu sản phẩm lỏng chứa trong chai lọ, can... và lô hàng có ít hơn 1000 đơn vị chứa thì lấy 2% số đơn vị chứa, nếu lô hàng có trên 1000 đơn vị chứa thì lấy từ 0,3 - 1% số đơn vị chứa. Sau đó trộn đều tất cả số mẫu ban đầu đã lấy được, để lấy ra mẫu trung bình khoảng 2 lít • Phần còn lại của mẫu phân tích là mẫu lưu Các sản phẩm khác dạng sánh hoặc bán rắn • Lấy 50 – 100 ml đối với tinh dầu, dầu ăn có thể lấy lượng lớn hơn • Bơ lấy 200 g trở lên cho mẫu trung bình • Lưu ý đối với dầu thực vật, bơ phải trách sự oxy hoá của không khí Nhà máy CBTS: mẫu (kiểm tra vệ sinh công nghiệp) lấy với khối lượng nhỏ, nhiều thời điểm & công đoạn khác nhau trong qt cbiến. Thịt, cá: nơi nhiễm chủ yếu là bề mặt, sd các dụng cụ lấy mẫu để quét trên bề mặt sp hay cắt mẫu với độ dày từ 2-3 mm. Dụng cụ lấy và chứa mẫu Từ các chất liệu khác nhau: phải thanh trùng. Bình (có mẫu) được niêm phong, ghi số thứ tự mẫu, người lấy mẫu Ghi nhãn Ghi nhãn trên mẫu: ngay trước hay sau lấy mẫu để phù hợp hồ sơ mẫu. Ghi nhãn trên dcụ vchuyển: tên, đchỉ , đthoại người nhận, gửi kèm dấu hiệu dễ vỡ, tphẩm, trữ lạnh Yêu cầu nhãn: chịu áp suất, không thấm nước, không thể tháo bỏ, tẩy xóa. Hồ sơ mẫu Mỗi mẫu có hồ sơ mẫu phù hợp vời nhãn ghi trên mẫu và thùng chứa. Thông tin hồ sơ mẫu Người yêu cầu PTN phân tích mẫu: Tên, địa chỉ, điện thoại. Nơi lấy mẫu (cửa hàng, khách hàng..), ngày, địa điểm, thời gian lấy mẫu. Miêu tả hoàn cảnh, môi trường nơi lấy mẫu. Bản chất mẫu. 1 nhãn dễ đọc ghi rõ tên mẫu. T0 mẫu, kho chứa khi lấy mẫu. Nguyên nhân lấy mẫu. Thông tin thực phẩm được lấy mẫu: chế biến, thời gian sản xuất, dạng bao bì, điều kiện bảo quản. Tên nhà sx, nhà nhập khẩu. Ngày sx, ngày đóng gói, thời hạn sử dụng, số sx. Phương pháp lấy mẫu. Người lấy mẫu: tên, địa chỉ, điện thoại. PTN: tên, địa chỉ, điện thoại. Các chỉ tiêu phân tích. TIẾP NHẬN MẪU TẠI PHÒNG THÍ NGHIỆM Ghi nhãn Kiểm tra: nhãn trên mẫu có phù hợp số của hồ sơ mẫu. T0 mẫu, tgian mẫu đến: ghi trong hồ sơ mẫu. T0 mẫu khi đến Đo T0 = 1 phần mẫu hay 1 mẫu phụ xlý giống mẫu chính. Đk bao gói Mẫu giữ ở bao bì gốc (tốt nhất). Nếu chuyển bao bì, mẫu giữ ở túi vô trùng & bằng các vật liệu không ảnh hưởng tình trạng ban đầu của mẫu. - Mẫu lỏng: kiểm tra bình chứa (rò rĩ, nắp đậy kín, bị nứt /thủng) có gây nhiễm bẩn vào mẫu. - Mẫu rắn: kiểm tra bao bì (tình trạng chân không- có khí bên trong?, bị nứt/ lõm?), đk lý tính bên trong ( màu sắc, cơ cấu, mất chất lỏng). Bao bì/ lớp bọc bị hư hỏng: ghi nhận, báo cáo phân tích. Bảo quản mẫu trước & sau khi phân tích Với mẫu thực phẩm: sau khi lấy- bquản tách biệt nhau, giữ ở T0 thấp nước đá),vận chuyển ngay về PTN. Mẫu mau hư hỏng: bảo quản đông, đặc biệt trữ dài hạn, giữ mẫu ở tủ đông (-20oC). Ko thể bquản đông, phân tích mẫu trong 36h giữ trong tủ lạnh (0-4oC). Thực phẩm đồ hộp hay thực phẩm khó hư hỏng bảo quản ở T0 phòng đến phân tích. Mẫu đến cuối/ hết hạn sd: Bảo quản ở T0 ghi trên bao bì. Từ chối nhận mẫu Kiểm tra cảm quan: hư hỏng (mục đích thẩm định lại kết quả kiểm tra cảm quan: nhận kiểm tra vi sinh). Mẫu đến PTN: t0 quá cao, hư hỏng, bị nhiễm khi vchuyển. Xử lý mẫu Tiền xử lý mẫu theo phương pháp chuẩn: • Rã đông thực phẩm đông lạnh: ở T0 tủ lạnh (40C) 18h. Mẫu thực phẩm nhỏ: đặt nơi ổn định nhiệt (không >370C) 15’. • Đồng nhất mẫu cần duy trì t0 lạnh. • Khối lượng mẫu phân tích 10/ 25gram. • Mẫu thực phẩm hàm lượng muối cao, nồng độ muối dung dịch pha loãng phù hợp nồng độ muối trong mẫu. • Mẫu thưc phẩm hàm lượng đường cao: bổ sung đường sucrose. Mẫu thực phẩm mau hỏng: bảo quản lạnh ngay sau lấy mẫu (T0 0-4oC) ở thùng nước đá, mẫu tránh tx trực tiếp với nước đá. Mẫu dạng đông (block) không để tan đá trước khi đến PTN. Mẫu khó hư hỏng: dùng bao, túi kín; T0 vận chuyển, bảo quản không vượt 45oC. Mẫu kiểm nghiệm phải đạt các yêu cầu: Dụng cụ chứa mẫu không rò rỉ, có nắp đậy kín, không bị nứt /thủng gây nhiễm bẩn vào mẫu. Mẫu dạng hút chân không: không có khí bên trong. Mẫu dạng block hay mẫu nguyên con: còn nguyên vẹn không bị biến dạng, giập nát. Mẫu nước: phân tích ngay sau khi thu. Mẫu bảo quản lạnh 1h), vận chuyển tối đa 6h và bảo quản ở PTN tối đa 2h. Thời gian, T0 bảo quản và vận chuyển ghi trong hồ sơ mẫu. Phương pháp kiểm nghiệm VSV sử dụng kỹ thuật truyền thống • Ưu điểm: chi phí thấp (ko cần trang bị thiết bị hiện đại) • Nhược điểm: tgian cho kquả chậm, ko đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm thực tế. Các kỹ thuật cơ bản • Tiệt trùng Thanh trùng khô Dụng cụ thuỷ tinh Các dụng cụ chịu nhiệt Nhiệt độ thông thường 170oC trong 2h Thanh trùng ướt Môi trường nuôi cấy Nhiệt độ 121oC trong 15p Dùng đèn cồn Tiệt trùng không gian làm việc Khử trùng dụng cụ như dao, kéo, nhíp, que cấy, que trải, Pha loãng • Dung dịch pha loãng thường dùng Nước muối sinh lý hoặc dung dịch peptone • Thường pha loãng theo dãy thập phân Tỷ lệ dung dịch:mẫu 9:1 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml Ống mẫu 1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml Tách ròng Trữ vi khuẩn • Trên môi trường đặc • Trên môi trường loãng (BHI, TSB + glycerol, 1:1) • Trữ khô ở - 80oCA Loại môi trường, chỉ tiêu sinh hoá dùng trong kiểm nghiệm vi sinh sp thuỷ sản Phân loại môi trường Theo trạng thái vật lý • MT nuôi cấy VSV: mt lỏng, mt đặc và mt xốp. • MT lỏng(ko có agar): dùng để ktra các đặc tính sinh hoá, tăng sinh và tồn trử VSV. • MT đặc (có chứa agar): dùng để phân lập, tách ròng VSV với mđích thu các khuẩn lạc rời hay xđ hình thái khuẩn lạc. • MT xốp: chỉ sd trong vi sinh công nghiệp. Hình Các loại môi trường theo trạng thái vật lý Theo công dụng • Môi trường tiền tăng sinh: giàu dinh dưỡng, ko có chất ức chế đặc hiệu tạo đk hầu hết các loại VSV ptriển. • Môi trường tăng sinh: có kn ức chế sự sinh trưởng 1 số nhóm VSV nhưng tạo đk ptriển VSV khác. • Môi trường chung: ko chứa các chất ức chế, dùng phân lập hầu hết các loại VSV (là mt lỏng hoặc mt đặc). • Môi trường phân biệt (mt đặc trưng) (mt đặc): chứa các thành phần thuận lợi cho sự phát hiện các giống hay loài VSV từ một mẻ cấy thuần chủng hoặc hổn hợp. • Môi trường thử phản ứng sinh hoá: dùng để xđịnh 1 vài tính chất sinh hoá các dòng VK được phân lập. Yêu cầu phải sd dòng thuần, nếu ko kquả dễ cho hiện tượng dương tính giả (kquả sai). Những điều cần lưu ý trong sử dụng môi trường • Phòng kiểm nghiệm: sd mt nhập khẩu có sẵn (dạng khan). Ưu điểm: giảm đáng kể sự sai lệch giữa các lần pha chế mt. • Bảo quản: Mt khô bquản nơi khô thoáng,T0 (15 – 25oC), đậy kín (tránh bị hút ẩm do hơi nước trong ko khí), nếu không mt xhiện hiện tượng: thay đổi pH, vón cục. Lưu ý: Ko dùng mt bị vón cục, quá hạn sd. • Pha chế: Nước pha mt khô là nước cất (các mt có hướng dẫn lượng mt và lượng nước). Các mt nhạy cảm với T0 (ko đun mt quá tgian cần thiết). • Điều chỉnh pH: MT khô khi hoà tan, đun và khử trùng đúng cách có pH phù hợp cho ptriển VSV. 1 số trường hợp cần điều chỉnh pH phù hợp (sd NaOH / HCl). Lưu ý: MT đặc, điều chỉnh pH khi T0 mt ở khoảng 45oC và dụng cụ đo pH có chế độ bù nhiệt. MT lỏng đo pH ở T0 phòng. • Khử trùng môi trường: Thiết bị dùng khử trùng mt - nồi hấp tiệt trùng (Autoclave), ở T0 (121oC) với tgian 15’ ko kể thời gian nâng nhiệt . Chỉ tiêu sinh hoá trong kiểm nghiệm vi sinh a. Nhuộm Gram • 1884 Hans Christian Gram (nhà khoa học Đan mạch) (1853 – 1938) phát hiện pp. • Dựa trên đặc tính hóa lý của thành tế bào ▫ Vi khuẩn Gram dương: lớp peptidoglycan dầy 20 – 80 nm, chiếm 90% khối lượng. ▫ Vi khuẩn Gram âm: lớp peptidoglycan dầy 7 - 8 nm, chiếm 10% khối lượng và có thêm lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài. Phương pháp nhuộm Gram Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn Dùng thuốc nhuộm kiềm, tím tinh thể nhuộm trong 1 phút Rửa nước tối đa 5 giây Thêm dung dịch Lugol (1% I, 2% KI) trong 1 phút Rửa nước Phủ lên mẫu với ethanol 95% hoặc hỗn hợp aceton:ethanol 95% 5:95 Rửa nước Nhuộm tiếp với Sanfranin hoặc fuchsin 1 phút Rửa nước và để khô Kết quả: quan sát lame dưới KHV ▫ Vi khuẩn Gram dương: xanh đen hay tím ▫ Vi khuẩn Gram âm: đỏ vàng hay đỏ tía Thử nghiệm khả năng lên men nguồn Carbohydrate Loài VK khác nhau  khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate khác nhau Ví dụ • Loài VSV lên men kỵ khí glucose. • Loài VSV sd glucose = con đường oxy hoá. • Loài VSV sd glucose = cả 2 pp. • Loài VSV ko có kn sd glucose Nguyên tắc: Xác định khả năng lên men 1 nguồn carbohydrate đặc hiệu (có trong môi trường nuôi cấy) tạo acid (hay acid & sinh hơi) của VSV làm đổi màu chất chỉ thị. Các sp cùng đặc trưng trong lên men: •Acid lactic •Acid formic và acid acetic •Acid lactic và ethanol •Ethanol Sd thuốc thử phenol red (pH 6.4 – 8)có màu vàng trong mt acid & màu đỏ trong mt kiềm. • H2O2 (hydro peroxide) (sp cuối mang tính oxh của quá trình biến dưỡng đường kiểu hiếu khí) khi tích tụ nhiều  gây độc tế bào. • Men catalase có trong VSV hiếu khí/ kị khí tuỳ nghi (ngoại trừ Streptococcus spp). Men catalase xtác pứng oxh - khử của 2 phân tử hydro peroxide (H2O2). • Trong pứng phân giải: 1 phân tử H2O2 hđộng như 1 cơ chất, 1 phân tử H2O2 hđộng như chất cho  cơ chất bị khử bởi nguyên tử hydro chất cho => cơ chất bị khử và chất cho bị oxy hoá. • H2O2 + H – O – O – H -- catalase  2 H2O + O2 Thử nghiệm Catalase Nguyên tắc: Xác định sự có mặt của enzyme catalase ở VSV. • Hoá chất sd là ddịch H2O2 30% (Superoxal) giữ lạnh trong chai sẫm màu, tránh ánh sáng. (Do H2O2 rất dễ bị phân huỷ nên cần phải kiểm tra chất lượng của H2O2 trước sd). • Ktra = các chủng VK (+) tính và (-) tính với pứng catalase /hoặc sd mt thạch máu & mt chocolate agar (hồng cầu đã bị phân huỷ). • PP thử pứng catalase của VSV: sd lame, cho trực tiếp ddịch H2O2 vào ống nghiệm chứa VSV cần thử (VSV đã thuần) hoặc sd ống mao dẫn để thử kn phân giải H2O2 của VSV. Phương pháp thử Phản ứng catalase dương tính Thử nghiệm Citrate Xác định khả năng sd citrate như 1 nguồn carbon duy I cho hđộng trao đổi chất của VSV. Hình 3. Phân tử Citric Cơ sở sinh hóa: NL ccấp cho VSV trong mt ko có nguồn ng liệu sd cho qt lên men hay tạo sp lactic. VSV sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất. Thử nghiệm Decarboxylase (LDC, ODC) và dehydrolase (ADH) của các a.amin Nguyên tắc: Xác định khả năng tổng hợp các enzyme khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ các a.amin: lysine, ornithin và arginine, qua đó làm kiềm mt nuôi cấy. Cơ sở sinh hóa: khử nhóm carboxyl(-COOH) của 1 a.amin để giải phóng các amin hay diamin & CO2. Mỗi loại men decarboxylase tác động lên 1 cơ chất. 3 nhóm enzyme decarboxylase quan trọng thường sử dụng lysine, ornithin và arginine  Là các enzyme cảm ứng  Chúng chỉ được tổng hợp khi mt nuôi cấy có pH acid và có cơ chất đặc hiệu  Các sản phẩm của chúng làm môi trường chuyển sang kiềm  Phản ứng tách carboxyl xãy ra điều kiện kị khí, là phản ứng không thuận nghịch và cần coenzyme chung pyridoxal phosphate (vitamin B6). Sử dụng chất chỉ thị Bromcresol purple (pH 5.2-6.8) hoặc cresol red. Nguyên tắc: Phát hiện khả năng của VK có thể tạo Indol trong mt canh trypton. Tryptophan là a.amin bị oxy hoá bởi VSV nhờ hệ thống enzyme - tryptophanase tạo 3 sp biến dưỡng  Indol  Skatol (methyl indol)  Indolacetic acid (IAA) Sp trung gian: indolpyruvic acid (IPA). ▫ Tryptophan  IPA ▫ IPA (tách amin)  Indol ▫ IPA (tách carboxyl)  Skatol Thuốc thử Kovac Thử nghiệm khả năng sinh Indol Hình Phản ứng Indol Thử nghiệm Methyl red  Nguyên tắc: Xác định khả năng của VSV sản xuất và duy trì các sản phẩm acid bền trong môi trường từ quá trình lên men glucose. Sử dụng methyl red (4.4-6.2 đỏ sang vàng) làm chất chỉ thị để xác định nồng độ ion H+ hiện diện khi 1 VSV lên men glucose. Tất cả VK thuộc nhóm Enterobacteriaceae đều cho phản ứng MR (+) tính sau 18 – 24 giờ ủ. Sau khoảng thời gian (>48 giờ), VSV MR (+) tính tiếp tục sinh các sản phẩm acid (acid lactic, sucsinic, acetic và formic) làm giảm pH- vượt quá khả năng ổn định pH của hệ dung dịch đệm và duy trì tính acid của môi trường (<=4,3). Các VSV MR (-) tính sau lên men glucose làm acid hoá mt ttục biến dưỡng các sp này bằng phản ứng tách carboxyl sinh các acetoin trung tính. Sự giảm các sp acid và tăng các sp trung tính  đẩy pH mt tăng dần về hướng trung tính. Sự chính xác của phép thử MR phụ thuộc: Tgian ủ cần thiết để thể hiện sự khác biệt trong biến dưỡng glucose. Tgian ủ tối thiểu phải đủ để VSV MR (+) giảm hết mức pH và VSV MR (-) tăng tối đa pH mt. Hình Phản ứng Methyl red Voges – Proskauer (VP) Nguyên tắc: phát hiện khả năng tạo sản phẩm trung tính là acetoin (acetylmethylcarbinol) của VSV trong quá trình lên men glucose. QT biến dưỡng: biến glucose thành a.pyruvic - chất trung gian chủ yếu trong qt biến dưỡng glucose. Từ chất này, VSV có thể biến đổi theo nhiều con đường sinh hoá khác nhau. Sd thuốc thử là -naphtol. Hình Phản ứng VP Nguyên tắc: Xác định khả năng phân giải urea  2 phân tử ammonia + CO2 do tác động của enzyme urease và làm kiềm hoá môi trường của VSV. • Cơ chất urea là một diamide của acid carbonic gọi là carbamide. • Enzyme đặc hiệu - urease xúc tác sự thuỷ phân urea  tạo 2 phân tử amonia. • Urease là enzyme quan trọng ở VSV liên quan đến sự phân giải các hợp chất hữu cơ. • Enzyme thuộc loại enzyme sẵn có do sự hình thành enzyme không phụ thuộc có mặt của cơ chất urea. • Cơ sở của phản ứng: tạo các phân tử amonia trong pứng  làm mt bị kiềm hoá và làm chuyển màu thuốc thử. • Sử dụng thuốc thử phenol red có vùng chuyển màu từ pH 6,8 – 8,4 màu chuyển từ vàng đỏ. Urease Hình 7. Phản ứng Urea Khả năng sinh H2S Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh H2S từ hợp chất hữu cơ và vô cơ chứa lưu huỳnh trong qt ptriển của VK tạo các vệt màu đen trên mt nuôi cấy. Sử dụng men - Cysteine desulfurase Chất chỉ thị pứng là các muối sắt II hoặc sắt III. Pứng H2S với các muối này  tạo muối FeS kết tủa màu đen Tính di động Đánh giá khả năng di động của VSV VSV chuyển động chủ yếu nhờ các tiên mao (ở VK hình que, 1 số VK hình cầu). Vi khuẩn di động nhờ 1 hay nhiều tiên mao và vị trí các lông thay đổi tuỳ loài và đk nuôi cấy. 1 số VSV có thể chuyển từ trạng thái di động sang trạng thái ko di động (do mất tiêm mao) nhưng đa số ko có khả năng ngược lại. Sử dụng môi trường thạch mềm (nồng độ agar 4 – 5 g/l). T0 là yếu tố rất quan trọng, VSV di động ở các T0 khác nhau. Cơ quan di động của VK có bản chất là protein, bị biến tính ở T0 cao. Có xu hướng mất đi tính di động: VSV trữ tgian dài. Tiến hành:  Cấy đâm sâu VSV vào mt thạch mềm chứa 0.5% agar. Ủ qua đêm ở T0 thích hợp với tính di động của vsv.  Q sát hiện tượng sau nuôi cấy, nếu VSV di động sẽ làm đục mt, VSV ptriển lan ra khỏi vết cấy. Ngược lại, VSV ko di động ptriển sinh khối quanh đường cấy, mt ko bị đục bởi sinh khối VK. VK ko di động ở 37oC sau 48h cần được ủ tiếp ở T0 21 – 25oC trong tgian 5 ngày để khẳng định kết quả. Cần quan sát tính di động ở các tế bào non <24 h nuôi cấy Hình Khả năng di động của vi khuẩn trên môi trường thạch mềm PHƯƠNG PHÁP MỚI TRONG KIỂM NGHIỆM VSV Hình. Nguyên tắc Sandwich ELISA Ứng dụng PCR (Polymerase chain reaction) • PCR: phản ứng dây chuyền sd men polymerase (phát minh nhà khoa học người Mỹ, Kary Mullis -1983). • PP mô phỏng 1 quá trình sinh hoá trong tự nhiên: là quá trình sinh tổng hợp acid nucleic, dưới sự có mặt của men polymerase, DNA mẫu, các đoạn mồi (primer) và các nucleotic tự do trong môi trường, pứng thực hiện nhờ sự hổ trợ của máy PCR (còn gọi là máy luân nhiệt). • Các hợp phần của phản ứng PCR DNA mẫu (template) Mồi (primers) DNA-Polymerase Nucleotic • DNA mẫu (template) Là 1 đoạn gen (DNA or RNA) cần xđịnh trong bộ gen sinh vật. • Mồi (primers) Là những đoạn DNA ngắn, sợi DNA nhân tạo – ko quá 50 (thường 18-25bp) nucleotides (vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài được xác định bằng cặp base; chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) các đoạn mồi này phù hợp chính xác tại điểm bắt đầu và kết thúc của DNA cần khuếch đại. Nó gắn vào DNA mẫu ở những điểm khởi đầu và kết thúc, tại vị trí DNA-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi DNA mới. • DNA-Polymerase Là enzyme cho quá trình tổng hợp chuỗi nucleotic ở sinh vật. Trước đây (mới tìm quy trình PCR), enzyme ở các sinh vật bình thường ko chịu T0 cao  bị phá huỷ (giai đoạn biến tính DNA trong phản ứng PCR)  bsung thêm DNA-polymerase sau gđoạn biến tính  tốn tgian thực hiện pứng và tốn lượng lớn polymerase. Hiện nay, pứng PCR (cải tiến) sd enzyme polymerase VSV (Thermus aquaticus) sống suối nước nóng, hoạt động được ở T0 cao (tên: Taq polymerase)  giúp thực hiện phản ứng PCR đơn giản và tạo đk cho tự động hoá phản ứng. • Nucleotic Có 4 loại nucleotic (thành phần chủ yếu của DNA). Mỗi nucleotic cấu tạo từ 3 phần: 1 phân tử đường (deoxyribose), 1 nitrogen base, 1 triphosphate. Hình. Các loại nucleotide • Các quá trình trong phản ứng PCR Phản ứng PCR là 1 chuỗi nhiều chu kỳ ltiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn biến tính • Phân tử DNA có T0 biến tính ≠ (do..) • Nâng đến T0 biến tính (> 90oC) các liên kết hydro giữa 2 mạch đơn bị phá vỡ, 2 mạch đơn tách rời nhau. Giai đoạn bắt cặp • T0 phản ứng được hạ xuống (50 – 60oC) tạo đk các đoạn mồi bắt cặp với DNA mẫu (theo nguyên tắc bổ sung) Giai đoạn tổng hợp • Nâng đến T0 hoạt động của men Taq polymerase (khoảng 70oC)  tổng hợp chuỗi acid nucleic. Hình. Các quá trình của phản ứng PCR Các loại PCR • Multiplex PCR ▫ Xác định cùng lúc nhiều chỉ tiêu • Nested PCR ▫ Tăng tính chính xác do thực hiện phản ứng PCR 2 lần (đoạn dài và tiếp theo đoạn ngắn hơn bên trong) • RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ▫ Chuyển RNA sang DNA trước khi thực hiện PCR • Real time PCR ▫ Định lương sản phẩm PCR dựa vào khả năng phát quang của Sybr Green khi tương tác với DNA • Trong thực phẩm có thể có một số