Phương pháp tách RNA tổng số và mRNA

Phương pháp tách RNA tổng số và mRNA Tách RNA tổng số RNA được tiến hành chiết tách gồm các bước cơ bản tương tự như DNA (bao gồm phá vỡ màng tế bào, loại protein, tủa RNA) nhưng ở đây ta dùng enzyme desoxyribonuclease (DNase) để phân huỷ DNA. Do RNA kém bền và dể bị phân huỷ bởi enzyme ribonuclease (RNase) có nhiều ở khắp nơi, hoạt tính cao lại bền với nhiệt (trên 90°C), vì vậy, điều kiện thao tác để chiết tách phải được tiến hành trong môi trường vô cùng nghiêm ngặt. Phương pháp chung để tách RNA tổng số được tiến hành như sau: - Tế bào được nghiền với chất tẩy rửa SDS, sarcocyl nồng độ cao, nitơ lỏng để biến tính protein. Đồng thời mẫu cũng được nghiền với chất khử (2- mercaptoethanol) để ức chế RNase. Nước sử dụng cũng được xử lý với DEPC (Diethylpyrocarbonat) cũng để loại bỏ RNase. - Các protein, DNA được loại bỏ qua xử lý mẫu với hỗn hợp dung môi Trizol (phenol pH=4, guanidinium thiocyanate, glycerol, sodium acetate), khi ly tâm, ta tách được RNA trong pha nước. DNA ở pH=4 bị hấp phụ vào pha dưới cùng với phenol, protein biến tính nằm giữa hai pha cũng bị loại cùng với DNA cùng với pha phenol. RNA trong pha nước được hút ra sau đó tủa bằng izopropanol để -20°C, li tâm và rửa lại bàng ethalnol 79%, thu hồi RNA tinh khiết, bảo quản lạnh để làm các thí nghiệm tiếp theo. Chất lượng của RNA tổng số được đánh giá sơ bộ qua điện di trên gel agarose. Tách từng loại RNA khác nhau Dựa vào kích thước trọng lượng phân tử, người ta có thể tiến hành sắc kí, điện di hoặc ly tâm để tách từng loại RNA. Phương pháp tách mRNA: Do kích thước bé lại chiếm lượng nhỏ (1÷ 5%) RNA tổng số, có cấu trúc đa dạng nên không thể tách bằng phương pháp trên. Nhờ đặc điểm mRNA có đuôi polyA, do đó, người ta tách mRNA ra khỏi mẫu bằng phương pháp sắc ký ái lực oligodt-xenlulose. Ngày nay trên thị trường có loại viên bi từ, trên bề mặt có gắn oligodt. Sau khi mRNA bám trên bề mặt các viên bi từ, thông qua liên kết bổ sung với oligodt, các viên bi này thu nhận và đem ly tâm ta thu được mRNA tinh khiết. Lưu ý rằng, để tách mRNA, người ta đi từ tế bào biệt hoá, lượng mRNA nhiều và đây cũng là con đường nghiên cứu cấu trúc gen mã hoá. Ngày nay người ta đã tổng hợp được ngân hàng mRNA. Phương pháp tách chiết DNA và plasmid của vi khuẩn Mọi nghiên cứu và ứng dụng của công nghệ gen đều được bắt đầu từ việc thu nhận một lượng axit nucleic tinh sạch. Mối quan tân đầu tiên của kỹ thuật tách chiết axit nucleic là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn, không bị phân hủy bởi tác nhân cơ học, tác nhân hóa học và enzyme như RNase, DNase. I. Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn DNA có kích thước lớn, mọi việc chiết tách cần phải tránh mọi tác nhân cơ học, hoá học tới phân tử DNA này. Việc tách DNA từ tế bào vi khuẩn được chia làm bốn bước cơ bản: 1. Nuôi cấy và thu sinh khối Tùy từng loại vi khuẩn mà người nghiên cứu chuẩn bị môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau như nhiệt độ, độ pH, và điều kiện dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn. Tách tế bào ra khỏi dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm và làm sạch tế bào. Thông thường khoảng 1.000ml dịch nuôi cấy li tâm và thu lấy khoảng 10ml cặn vi khuẩn. 2. Phá vỡ màng tế bào và giải phóng các thành phần bên trong Axít nucleic được giải phóng ra khỏi màng tế bào bằng phương pháp hóa học và sinh học để thu dịch chiết tế bào. Enzyme lysozyme là một enzyme có trong lòng trắng trứng hoặc phage T4, có khả năng phá vỡ thành phần trùng hợp của thành tế bào. EDTA (TrilonB) tạo phức với Mg+2 dạng hòa tan và làm vỡ thành tế bào. Đồng thời EDTA ngăn không cho enzyme trong tế bào phân hủy DNA. Người ta còn có thể phá vỡ màng tế bào và giải phóng DNA ra khỏi liên kết histon bằng chất tẩy rửa SDS (Sodium Derecyl Sylfat) hoặc enzyme protease. Các chất phá vỡ màng này làm li giải màng, tách rời các phần tử lipit và gây ra sự gẫy màng tế bào. 3. Làm sạch DNA từ dịch chiết tế bào Loại bỏ các thành phần không mong muốn như protein, lipit và các thành phần khác bằng kết tủa phân đoạn. Mẫu được lắc mạnh trong hệ dung môi phenol-chloroform để biến tính, kết tủa protein và giải phóng axít nucleic vào dung dịch lỏng. Protein bị biến tính sẽ tách ra khỏi pha nước có chứa DNA sẽ được tách ra nhờ ly tâm. Dịch nổi gồm axit nucleic và nước được hút ra và tiếp tục phân hủy RNA bằng enzyme RNase. Sau đó, tách DNA và nước để thực hiện bước phân tích tiếp theo. 4. Thu hồi DNA dạng đặc Mục đích của bước này là thu DNA dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của enzyme. Có 2 phương pháp kết tủa: - Kết tủa DNA trong etanol với sự có mặt Na+ nồng độ cao, nhiệt độ thấp, tỷ lệ giữa etanol và mẫu phân tích là 3:1. - Kết tủa trong izopropanol, tỷ lệ giữa rượu và mẫu là 1:1. Với phương pháp này không cần sự có mặt của muối và loại được DNA có phân tử lượng thấp. Ly tâm cao tốc và thu nhận DNA dạng cô đặc. Trong cả hai phương pháp, DNA thu được sẽ rửa trong etanol-70% để loại izopropanol và muối để thu được DNA tinh khiết. II. Phương pháp tách DNA plasmid Việc tách DNA plasmid ra khỏi DNA nhiễm sắc thể là rất khó khăn. Tuy nhiên người ta có thể dựa vào sự khác nhau lý hóa giữa hai loại DNA như: kích thước, hình thái, cấu trúc của chúng. Về nguyên tắc được tiến hành theo 3 bước sau: - Bước 1 : Sau khi thu hồi và làm sạch các tế bào có chứa plasmid, người ta xử lý trong hỗn hợp SDS, EDTA hoặc NaOH làm DNA sợi đôi biến tính thành DNA sợi đơn nằm cạnh nhau. - Bước 2: Xử lý hỗn hợp trên trong môi trường đệm (NaCH3COO+CH3COOH) để kết tủa protein và SDS dạng tập hợp. - Bước 3: Đưa về môi trường trung tính, DNA sợi đơn được hồi tính trở lại. Còn DNA (NST) do dài nên hồi tính chậm và kết tủa cùng SDS. Tách DNA plasmid bằng cách kết tủa trong etanol hoặc izopropanol, sau đó ly tâm tách được plasmid tinh sạch.