Bài 11: Liệu pháp gen

GENE THERAPY LIỆU PHÁP GEN (LPG)  LPG là gì?  LPG được dùng làm gì?  Làm sao sử dụng LPG? Hay sử dụng LPG như thế nào?  Việc ứng dụng LPG: thành tựu và thất bại?  Thuận lợi và hạn chế của LPG?  LIỆU PHÁP GEN (LPG)  Sửa chữa gen bệnh  Thay gen bệnh bằng gen lành  Ức chế sự biểu hiện của gen bệnh  Tiêu diệt tế bào (TB) bệnh LPG - CHUYỂN GEN LÀNH VÀO MÔ BỆNH Bệnh máu khó đông do thiếu/hư YTĐM số IX ở chó BT: máu đông trong 8-10 phút Bệnh: máu đông trong 50-60 phút TS. Kenneth Brinkhous (ĐH North Carolina) QT CG 1 giờ, Biểu hiện trong 15 tháng, Đông máu trong 20 phút VLDT cần chuyển Phương pháp Chiến lược chuyển 3. VLDT cần chuyển  Gen lành  Gen gây chết  Antisense nucleic acid Một bộ bao gồm: Gen Promoter mạnh Gen chọn lọc Plasmid/ VR vector 2. Phương pháp CG  Vector virus (VR)  Vector không VR  PP vật lí: vi tiêm, bắn gen 1. Chiến lược CG  Trực tiếp: In vivo  Nhiều giai đoạn: Ex vivo  in vivo TB nhận thường là TB sinh dưỡng chưa biệt hóa. CÁC CHIẾN LƯỢC CG • In vivo • Vector chuyển chứa các trình tự gen mục tiêu được đưa trực tiếp vào bệnh nhân, và được thiết kế cho tế bào/mô đích • Được kiểm soát như các sản phẩm sinh học/CNSH khác, theo hướng dẫn của FDA • Ex vivo • Tế bào biến đổi di truyền bằng vector ex vivo và được đưa vào cơ thể bệnh nhân • Được kiểm soát như các tế bào ghép, theo hướng dẫn của FDA Ex vivo  In vivo In vivo CÁC CHIẾN LƯỢC CG 1. VLDT được truyền trực tiếp vào cơ thể bệnh nhân; 2. Khả năng kiểm soát thấp; ít thao tác; 3. Chỉ dành cho những mô không phát triển in vitro; hoặc những tế bào nuôi in vitro không thể chuyển trở lại vào cơ thể 1. Đầu tiên, VLDT được chuyển vào tế bào được nuôi cấy in vitro 2. Quá trình được kiểm soát; tế bào CG được chọn lọc và nuôi cấy tăng sinh; nhiều thao tác hơn 3. TB thường của tự thân BN; được ghép trở lại vào cơ thể BN CÁC PHƯƠNG PHÁP CG 1 Tiêm DNA trần vào khối u bằng syringe 2 Chuyển DNA bằng liposome -- DNA được phủ các hạt đạn vàng (bắn gen), không dùng trong trường hợp ung thư 3 Các phương tiện sinh học (vector) như VR và VK VR được biến đổi DT sao cho không nhân lên khi ở bên trong cơ thể chủ và là phương tiện chuyển gen hiệu quả nhất hiện nay CÁC PHƯƠNG PHÁP CG Các vector chuyển gen • Vector = tác nhân mang và chuyển vật liệu di truyền vào tế bào • Vector có thể là • viral (retroviral, lentiviral, adenoviral, ) • non-viral (plasmid DNA, liposomes, ) • Vector & và phương pháp chuyển • Nâng cao sự biểu hiện gen phù hợp với nhu cầu • Nâng cao hiệu quả chuyển gen • Hướng tiếp cận mới • Kĩ thuật “chỉnh sửa (editing)” gen Sangamo (zinc finger nucleases) Tiêm DNA trần LPG DNA trần Dạng vòng ổn định hơn dạng plasmid không vòng Chuyển vào trong mạch  Gan và cơ Chuyển vào trong cơ -- Theo thời gian, sự biểu hiện in vivo thấp dần -- Rất rẻ Vaccin DNA LP miễn dịch ung thưDiệt VR và VK (VC truyền thống thì tốt hơn khi có sẵn) Bị động Làm tăng PUMD đã có trước đó đ/v UT Chủ động Khởi phát PUMD kháng lại KN khối u không nhận diện được Ứng dụng vaccine DNA trần ở bệnh truyền nhiễm HIV hepatitis B and C Influenza Papilloma Cytomegalovirus Tuberculosis, Lyme disease Helicobacter pylori Malaria TB T nhận diện TB gan với KST sốt rét bên trong www.malaria-vaccines.org.uk Sản xuất IFN-gamma IFN-gamma kích thích sự trình diện KN Vaccin DNA Vài epitope có bản chất peptid Được nhận diện bởi TB T Thành phần MD quan trọng của KN sốt rét protein có tên là thrombospondin related adhesion protein (TRAP). Vaccin DNA mã hóa cho phần chèn có thể nhận diện miễn dịch Bắn gen Được sáng chế dành cho chuyển gen vào TB thực vật Có thể ứng dụng cho TB ĐV hữu nhũ DNA hạt vàng trong da sau khi được bắn gen DNA plasmid được dồn vào hạt vàng hay tungsten có kích thước 1-3 micron. Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy_DMD) Liên kết NST X; 1/3500 trên TG 30% trường hợp có đột biến mới Không có dystrophin, protein màng TB (xấp xỉ 0.01% protein cơ xương). Chuyển minigen dystrophin ở chuột LDC LPG Không điều trị Gen: 2.4 Mb, mRNA: 14 kb (lớn quá, không thể dùng vector) Kiểu hình Becker: chuyển không hoàn thiện trình tự 2003 Thử nghiệm phase 1 Chín BN trong ba nhóm: Tiêm 1 liều thấp plasmid+dystrophin Tiêm 1 liều cao plasmid+dystrophin Tiêm 2 lần liều cao plasmid+dystrophin Xét nghiệm mô cơ Sự biểu hiện dystrophin 1 đến 10% ở các sợi cơ của nhóm 1 và 2, 100% ở nhóm 3 Không PUMD, không tác dụng phụ Chuyển gen dystrophin ở người Liposome  Cải tiến LPG dùng DNA trần (plasmid hay non-plasmid)  Nâng cao tỉ lệ chuyển thành công Màng lipid  hiệu quả >>>: tránh thoái biến DNA Thuốc trị liệu Cationic liposome Các giọt lipid tích điện (+) có thể tương tác với các DNA tích điện (-), bao phủ và chuyển DNA vào TB Đầu lipid tích điện + Lipofectin, lipofectamine, lipofectase. Liposome nhanh chóng bị “xóa sổ” khỏi dòng máu và bị thu nạp bởi các macrophage ở gan Các phối tử bề mặt của liposome làm giảm sự thoái biến (monosialoganglioside hay polyoxyethylene) Trouble shooting Liposome Liposome biến đổi hydrophilic polyoxyethylene Piedmont Máu-gan Da Liposome biến đổi Ruột - Đường uống Immunoliposome – tác kích chủ động  Kháng thể của myosin nội bào hướng liposome đến vùng tim bị nhồi máu  Kháng thể kháng các phân tử đặc hiệu khối u hướng liposome đến vị trí khối u Liposome – phương tiện LPG trong điều trị UT • Rẻ hơn dùng VR • Không gây PUMD • Đặc biệt phù hợp trong trường hợp chuyển vào mô phổi (bệnh xơ nang) • Số lượng plasmid DNA cần nhiều hơn 100 – 1000 lần so với vector VR Hiệu quả chuyển gen bằng Liposome Ω Tháng 1/1995: CFTR-liposome đưa vào cơ thể BN đường mũi Ω 12 BN, giảm nhẹ ở 20% BN Ω Hiệu quả tối đa vào ngày thứ 3, giảm nhanh ở ngày 7 Ω Không PUMD Xơ nang (Cystic fibrosis_CF) Bệnh DT gây chết ở trẻ sơ sinh (1/2000). Ít gặp ở người Châu Á và Châu Phi Hư hỏng gen CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) rối loạn dẫn truyền Cl- và Na+ Ở TB biểu mô ở nhiều cơ quan (tăng hấp thu Na+). Tuyến mồ hôi (tiết nhiều muối) Tổn thương tụy (đái tháo đường) Phổi sx nhiều chất nhầy ( dễ nhiễm khuẩn, ho, tử vong) Đường tiêu hóa (táo bón) Bình thường CF Phế nang Xơ nang (Cystic fibrosis_CF) Pseudomonas aeruginosa >>  neutrophil >>  xơ hóa, tổn thương Tụy BT CF ᴥ Các enzyme tụy không thể giải phóng khỏi tuyến  tổn thương ᴥ Giảm tiết insulin ᴥ Giảm dung nạp đường  ĐTĐ Xơ nang (Cystic fibrosis_CF) Gen CFTR (NST số 7) 27 exons, 1480 aa ATP binding domain CFTR ₪ Đột biến ở Delta F508 ₪ 50% TH bệnh là đồng hợp tử ₪ 30% dị hợp tử ₪ Gấp cuộn không đúng, dạng nhạy cảm với protease  Bị thoái biến ngay khi vào Golgi Retrovirus (RV) Adenovirus (AV) Adeno-associated virus Herpes simplex virus • Bộ gen RNA, tạo các bản sao DNA mạch đôi, có thể sát nhập vào bộ gen chủ • HIV, MoMuLV, Rous sarcoma virus VR mạch đôi DNA gây bệnh nhiễm khuẩn mắt, ruột, đường hô hấp ở người. Gây cảm lạnh VR mạch đơn DNA có thể chèn VLDT của chúng vào vị trí chuyên biệt ở NST số 19 VR mạch đôi DNA nhiễm vào TB thần kinh Vector virus Chiến lược chung tạo vector virus Retroviral vector ɤ Hiệu quả xâm nhiễm cao; là vector thường dùng để điều trị các bệnh phổ biến bằng LPG ɤ Không thể xâm nhập vào màng nhân  chỉ xâm nhiễm khi TB đang phân chia phù hợp cho LP điều trị UT ɤ Gắn chèn vào BG  bền vững và khả năng gây UT Moloney murine leukaemia virus (Mo-MLV) ₰ Có thể nhiễm vào TB người và chuột; ₰ Chỉ nhân lên trong TB đóng gói; ₰ Vector không hoàn chỉnh không lây lan; ₰ Đoạn gen < 7.5 kb không đủ trong một số TH LPG sử dụng RV vector trong điều trị lâm sàng Suy giảm MD trầm trọng phối hợp Severe Combined Immunodoficiency (SCID): ADA-SCID và X-linked SCID  Nhiễm khuẩn thường xuyên và điều trị KS không hiệu quả  Không lớn, thường bị áp xe ở da và các cơ quan  Nhược lympho bào (lymphopenia) (<200)  Phân loại  Đột biến ADA (Adenosine deaminase): SCID liên kết NST 20: 25% trường hợp  Đột biến thụ thể C-gamma của IL-7: SCID liên kết NST X  70 nguyên nhân khác (không phải đơn gen) LPG sử dụng RV vector trong điều trị SCID  “Bubble”  Ghép tủy  LP thay thế enzyme PEG-ADA (ADAGEN): tác dụng tạm thời, đắt, thiếu máu tán huyết, leukemia  LPG • Cuối 1970s: protein ADA được mô tả • 1983: công bố trình tự gen ADA • 1990: thử nghiệm LPG đầu tiên trên người sử dụng vector chuyển MoMLV được FDA chấp thuận • Ashanti DeSilva, 4 tuổi • Tế bào T được CG (MoMLV-ADA), tăng sinh (IL-2) và trưởng thành in vitro • Điều trị lặp lại 6 – 12 tháng theo vòng đời của TB T • Không rõ kết quả của LPG do điều trị phối hợp ADA-PEG LPG sử dụng RV vector trong điều trị SCID-ADA Donald Kohn chẩn đoán 3 thai nhi ADA-SCID Khi giảm PEG-ADA, tỉ lệ TB T tăng lên 1 – 10%, gấp 100 – 1000 lần Không lâu sau khi truyền TB máu dây rốn, 0.01 – 0.1% TB T ở nhũ nhi biểu hiện gen chuyển. Thu nhận máu dây rốn LPG sử dụng RV vector và TBG máu dây rốn trong điều trị SCID-ADA Thử nghiệm LPG thành công vào 2000; 8/10 BN bình phục 3.5 năm sau khi ghép TBG CG - Không cần sống trong bong bóng khí - Có số lượng TB T bình thường (cả CD4 và CD8) - Có phản ứng với miễn dịch trẻ nhỏ (uốn ván, bạch hầu, bại liệt) - Kháng thể sx ra đủ  không cần truyền kháng thể định kì Trầm trọng hơn SCID-ADA, vì không có TB B, T và NK LPG sử dụng RV vector trong điều trị X-linked SCID 2/15 trường hợp mắc leukemia do gen trị liệu chèn vào gần vùng LMO2 proto-oncogene (LMO2: vai trò trong tạo mạch) Lentivirus  Là RV có thể xâm nhiễm TB đang phân chia hoặc không đang phân chia vì chúng có thể đi qua màng nhân còn nguyên vẹn;  Có thể nhiễm vào các tế bào không phân chia hoặc đã biệt hóa như TB TK, đại thực bào, Tb cơ, gan;  Đại diện: HIV-1 (nhiễm TB Th) trong điều trị AIDS ADENOVIRUS • VR không có vỏ bao chứa DNA mạch đôi thẳng, có thể chuyển gen >30 kb; • Có thể nhiễm TB đang phân chia hoặc không đang phân chia • 12 sợi “anten” cho VR bám dính • Là kí chủ thường xuyên với cơ thể người, đã được sử dụng làm vaccine, quen thuộc với hệ thống miễn dịch ở người • Không gắn chèn vào BG chủ nhưng biểu hiện ổn định khi TB không phân chia; • Tính KN mạnh  gây ĐUMD mạnh Jesse Gelsinger, 18 tuoåi (Pennsylvania, 1999) - Thieáu huït enzyme Ornithine transcarbamylase - cheát sau 4 ngaøy LPG - Coù theå do vector adenovirus gaây caùc phaûn öùng mieãn dòch traàm troïng ADENOVIRUS Gen mã hóa ornithine transcarbamylase (OTC) Chứng thiếu hụt OTC (liên kết NST X) OTC là enzyme chủ chốt trong chu trình biến dưỡng nitơ trong cơ thể Hyperammonemia Thiếu OTC Nôn mửa, hôn mê Ammonia là chất độc TK Ứng dụng LPG sử dụng ADENOVIRUS Jesse Gelsinger, 18 tuoåi (Pennsylvania, 1999) - Thieáu huït enzyme Ornithine transcarbamylase - cheát sau 4 ngaøy LPG o Tỉ lệ 1/30.000 ở Mỹ o Nặng hơn ở nam giới o Độc tính o Nồng độ cao ammonia o Tái tổ hợp adenoviruxs với loại hoang dại Ứng dụng LPG sử dụng ADENOVIRUS Chứng xơ vữa động mạch (Atherosclerosis): sự tạo mạch cục bộ Mục tiêu: cải thiện dòng chảy ở chi hay tim thiếu máu bằng cách kích thích sự tạo mạch bổ sung AdV chuyển VEGF-121 ở BN tắt nghẽn động mạch chi Tắt nghẽn Liều đơn Ad-VEGF tiêm vào 20 vùng cơ chi dưới University of Michigan Health System Ứng dụng LPG sử dụng ADENOVIRUS Moät soá nhöôïc ñieåm cuûa vector virus : - Tính ñaëc hieäu teá baøo quaù cao (nhaát laø caùc retrovirus) - Kích thöôùc gene caàn ñöa vaøo haïn cheá - Söï gaén xen ngaãu nhieân vaøo NST - Taïo phaûn öùng mieãn dòch khoâng mong muoán Adeno-associated virus (AAV) -- không kích thích viêm ở cơ thể chủ -- không tạo kháng thể tự kháng nó -- không xâm nhiễm TB không phân chia -- chèn vào một điểm trên BG của chủ (NST 19 ở người) Chuột mắc ĐTĐ do hóa chất hoặc DT Intronless insulin gene Glucose -sensitive promoterAAV Trình tự tin hiệu tiếtenhancer Kiểm soát đường huyết và duy trì đến 8 tháng Tiêm vào tĩnh mạch cửa gan LPG sử dụng AAV làm vector trong điều trị ĐTĐ ở chuột Gen tự sát – LPG ung thư (113 TN ở Mỹ về LPMD UT) 54% TN là LPMD cho khối u ác tính Chuyển gen ức chế khối u TP53 LPG tự sát Gen tự sát – LPG ung thư Gen tự sát Tiền thuốc Thuốc có hoạt tính Viral thymidine kinase Ganciclovir Ganciclovir triphosphate Cytosine deaminase 5-fluorocytosine 5-fluorouracil Linamarase Amygdalin cyanide nitroreductase CB 1954 nitrobenzamidine Examples of suicide gene/prodrug combinations and the active cytotoxic drug selectively produced in the target cell. Linamarase = beta-glucosidase, chuyển cơ chất cyanogenic glucoside, linamarin, thành glucose và cyanide Ion cyanide khuếch tán tự do xuyên màng tế bào. Gen tự sát – LPG ung thư GAÂY CHEÁT TEÁ BAØO BEÄNH VÍ DUÏ VEÀ LIEÄU PHAÙP GENE TRONG UNG THÖ TUYEÁN GIAÙP  dn-RET (dominant negative)- proto- oncogene vôùi “ñoät bieán theâm chöùc naêng” seõ baát hoaït oncoprotein bình thöôøng  PTP (Protein Tyrosine Phosphatase) ñieàu hoøa bieåu hieän cuûa TNF (Tumor Necrosis Factor)  Gadd45 kieåm tra chu trình teá baøo, söûa sai DNA, apoptosis  HMGI(Y) (High Mobility Group) : Protein “nonhistone” trong nhaân ôû ÑV coù vuù coù tính linh ñoäng ñieän di cao, bieán ñoåi caáu truùc DNA vaø NSC laøm aûnh höôûng ñeán söï sao cheùp, phieân maõ, taùi toå hôïp,, lieân quan ñeán söï hình thaønh khoái u vaø di caên  ONYX-015 laø 1 adenovirus nhaân baûn trong teá baøo khoâng bieåu hieän p53 (protein söûa sai)  NIS (Sodium Iodide Symporter) + hoùa trò 131I Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007 LPG CHO TỪNG LOẠI BỆNH • Bổ sung (Gene transplantation) (dành cho BN bị mất gen) • Sửa chữa (Gene correction) (sửa các đột biến chuyên biệt ở gen mục tiêu) • Tăng cường (Gene augmentation) (nâng cao sự biểu hiện gen quan tâm) • Giết trúng đích (Targeted killing): chuyển gen hủy diệt (tự sát) vào tế bào chuyên biệt • Loại bỏ (Gene ablation) – ức chế sự biểu hiện của gen mục tiêu SÖÛA CHÖÕA SAI HOÛNG TREÂN GENE BEÄNH • Thoâng qua taùi toå hôïp ñoàng daïng Öu ñieåm : taùi laäp hoaøn toaøn tình traïng bình thöôøng Nhöôïc ñieåm : raát khoù thöïc hieän thaønh coâng Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007 BOÅ SUNG GENE LAØNH THAY CHO GENE BEÄNH Trong tröôøng hôïp gene beänh khoâng bieåu hieän, gene laønh ñöôïc ñöa vaøo teá baøo vaø bieåu hieän ñeå taùi laäp kieåu hình bình thöôøng Öu ñieåm : deã thöïc hieän Nhöôïc ñieåm : Bieåu hieän cuûa gene khoâng ñöôïc ñieàu hoøa nhö trong ñieàu kieän bình thöôøng Chæ söû duïng khi gene beänh laø laën Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007 ÖÙC CHEÁ SÖÏ BIEÅU HIEÄN CUÛA GENE BEÄNH Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007 Oligonucleotide ngaén lieân keát vôùi mRNA (maõ hoùa cho protein beänh)  öùc cheá söï dòch maõ cuûa mRNA ñoù Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007 TRIPLEX FORMING OLIGONUCLEOTIDES (TFO) TFOs lieân keát vôùi moät trình töï DNA maïch ñoâi thoâng qua lieân keát hydrogen Hoogsteen Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007 RIBOZYME-SPLICEOSOME Söûa chöõa ñoät bieán treân mRNA thoâng qua Ribozyme goàm 3 vuøng : maõ hoùa (coding domain), “caét noái trans” (trans splicing domain) vaø vuøng lieân keát vôùi pre-mRNA (binding domain) Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007 Các bệnh có thể ứng dụng LPG Disease Defect Target cell Severe combined Adenosine deaminase 4 Bone marrow cells or immunodeficiency T-lymphocytes Hemophilia Factor VIII, Factor IX deficiency Liver, muscle, fibrob. Cystic fibrosis Loss of CFTR gene Airspaces in the lung Hemoglobulinpathies  or  globulin gene Bone-marrow cells 1-antitrypsin deficiency 1-antitrypsin Lung or liver cells Cancer Many causes Many cell types Neurological diseases Parkinson’s, Alzheimers Direct injection into the brain Cardiovascular Restenosis, arteriosclerosis Vascular endothelium Infectious diseases AIDS, hepatitis B T cells, macrophages, Liver cirrhosis Fibrogenesis Hepatocyte growth factor Autoimmune disease Lupus, diabetes MHC, 2-microglobulin FDA chưa phê chuẩn bất kì sản phẩm về LPG ứng dụng trên người Bốn trở ngại lớn của LPG: 2) Phản ứng miễn dịch làm giảm hiệu quả của LPG và sự lặp lại LPG không ý nghĩa 3) Rủi ro với vector virus: Độc tính, phản ứng miễn dịch và viêm, khả năng gây bệnh trở lại 4) Rối loạn đa gen phổ biến như bệnh tim, Alzheimer, viêm khớp, đái tháo đường do sự phối hợp tác động của nhiều gen. 1) Trạng thái tự nhiên ngắn: hiệu quả ngắn.