Bài 2 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)

BAØI 2KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng. Phương pháp này được K.Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. I. NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR là phản ứng nhân bản trình tự DNA quan tâm trong ống nghiệm. Phương pháp này được thực hiện in-vitro với sự hiện diện của enzyme DNA-polymerase. Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt được lặp lại. P C R II. CÁC THÀNH PHẦN CẦN THIẾT ĐỂ THỰC HIỆN PHẢN ỨNG Sîi khu«n (DNA hoÆc cDNA) C¸c måi (Oligonucleotide primers) DNA polymerase chÞu nhiÖt (Taq) dNTP’s Dung dÞch ®Öm Ion Mg++ III. TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG 1. BiÕn tÝnh ADN: 94-95oC, 30-60 gi©y. 2. B¾t cÆp cña måi vµo sîi khu«n: 45-60oC, 30-60 gi©y. 3. Ph¶n øng kÐo dµi chuçi: 72oC, 60 gi©y/1kb. 3 b­íc trªn h×nh thµnh 1 chu kú. Ph¶n øng PCR ®­îc tiÕn hµnh trong kho¶ng 25-40 chu kú. Trong kü thuËt PCR th«ng th­êng ng­êi ta thùc hiÖn b­íc biÕn tÝnh ADN tr­íc khi b­íc vµo chu kú. B­íc nµy th­êng ®­îc thùc hiÖn ë 94-95oC, 2-3 phót. Ph¶n øng PCR - b­íc b¾t cÆp cña c¸c måi vµo sîi khu«n 5’ 3’ 5’ 3’ 45 - 60ºC Ph¶n øng PCR - b­íc kÐo dµi chuçi 72ºC 5’ 3’ 3’ 5’ Ph¶n øng PCR - s¶n phÈm ®­îc h×nh thµnh sau 3 b­íc 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ B¾t cÆp & kÐo dµi chuçi BiÕn tÝnh S¶n phÈm cuèi cïng cña ph¶n øng PCR IV. LỢI ÍCH CỦA PHẢN ỨNG PCR Thời gian thực hiện rất nhanh. Chỉ cần khoảng 3 giờ để khuếch đại trình tự DNA trong khi với phương pháp tạo dòng ta mất khoảng 1 tuần; Đơn giản và ít tốn kém; Độ tinh sạch của mẫu không cần cao; V. CÁC ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR 1. Nhân phân tử RNA bằng kỹ thuật PCR Cần có các đoạn mồi kết hợp được với khuôn RNA, sau đó tổng hợp các phân tử DNA nhờ enzyme reverse trancriptase theo kỹ thuật PCR. Enzyme Tth DNA-polymerase có thể thực hiện cả phản ứng sao chép ngược và phản ứng tăng số lượng. Quá trình này cần có ion mangan. 2. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kỹ thuật RAPD được thực hiện theo các bước sau: Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR; Điện di trên gel; Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng. Các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. VI. CÁC HẠN CHẾ CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR 1. Kích thước của trình tự cần khuếch đại Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt. 2. Sự ngoại nhiễm. 3. Các sai sót gây ra do Taq polymerase. Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá cao (10-4)