Bài 7: Kỹ thuật bảo quản tế bào

KỸ THUẬT BẢO QUẢN TẾ BÀO ThS. Phan Lữ Chính Nhân PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc • Bảo quản ở nhiệt độ trên -130oC • Bảo quản ở nhiệt độ dưới -130oC • Đông khô ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO • Trữ ở nhiệt độ dưới -130oC • Tế bào ở dạng huyền phù • Tế bào dừng phân chia và các hoạt động trao đổi chất MỤC ĐÍCH • Giảm chi phí nuôi cấy và duy trì tế bào đồng thời bảo quản nguồn tế bào dự phòng – Tiết kiệm thời gian và hóa chất – Là cách thức thay thế cho việc nuôi cấy nhiều nguy cơ gây chết tế bào • Giảm sự thay đổi hay mất các đặc tính của tế bào – Giảm nguy cơ biến đổi di truyền – Ngăn sự già yếu tế bào – Ngăn quá trình biến đổi tế bào DỤNG CỤ - THIẾT BỊ ĐÔNG LẠNH Nitơ lỏng – Không màu, không mùi, không dễ cháy, không độc – Nhiệt độ -196oC (thể lỏng) và -156oC (thể hơi) Thiết bị trữ lạnh – Tủ lạnh (4oC), tủ âm (-20oC, -80oC) – Thiết bị trữ lạnh bằng Nitơ lỏng (-196oC) Không kiểm soát nhiệt độ Có kiểm soát nhiệt độ (Nicool) DỤNG CỤ - THIẾT BỊ ĐÔNG LẠNH Bể ổn nhiệt Nhiệt độ trong bình trữ nitơ lỏng • Cryotube (cryovial, ampoule) NGUỒN TẾ BÀO • Loại/khả năng sống, tăng trưởng/sinh lí/số lượng/phương pháp tế bào được nuôi • Giai đoạn tốt nhất (log phase) • Chỉ đông lạnh những tế bào tăng sinh tốt và không nhiễm CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG CỦA TẾ BÀO ĐỐI VỚI MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH 1. Thể tích (V) và diện tích bề mặt tế bào (A) 2. Tính thấm nước của tế bào (Lp) 3. Loại và nồng độ chất bảo quản lạnh 4. Tốc độ làm lạnh (B) CÁC BƯỚC BẢO QUẢN LẠNH • Tế bào và mô tiếp xúc với chất bảo quản (bước cân bằng) • Làm lạnh mẫu xuống nhiệt độ âm • Trữ ở nhiệt độ dưới -130oC • Làm ấm và giải đông • Pha loãng và loại bỏ các chất bảo quản lạnh trước khi tái nuôi cấy CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH • Sự hình thành tinh thể nước đá • Độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh • Tốc độ khử nước • Sự giảm thể tích của tế bào • Sự giảm hoạt động của enzyme • Độ pH của dung dịch • Sự hình thành bọt khí SỰ HÌNH THÀNH TINH THỂ NƯỚC ĐÁ • Nhiệt độ ở thời điểm biến đổi giai đoạn • Tốc độ làm lạnh • Thành phần các chất hoà tan trong dung dịch. • Nồng độ dung dịch 4 yếu tố quyết định kiểu hình tinh thể nước đá ĐỘ THẨM THẤU CỦA MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH Sự hình thành đá Nồng độ chất hòa tan tăng Áp suất thẩm thấu tăng TỐC ĐỘ KHỬ NƯỚC - Tính thấm nước của màng tế bào - Năng lượng hoạt hóa của tính thấm nước - Tỉ lệ diện tích bề mặt / thể tích của tế bào SỰ GIẢM THỂ TÍCH CỦA TẾ BÀO - Tính thấm nước của màng tế bào và năng lượng hoạt hóa của tính thấm - Tốc độ làm lạnh - Thực tế và tính toán? HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME - Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa của các phân tử phản ứng. - Giảm - Tác hại đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt động của các protein – Vai trò của chất bảo vệ. ĐỘ pH DUNG DỊCH • Giảm theo nhiệt độ • Cân bằng acid-baz + Chất bảo vệ lạnh Glycerol: tính baz yếu DMSO: tính baz mạnh Propanediol, methanol + Nồng độ chất bảo vệ lạnh • Sự phù hợp về nhiệt độ và pH SỰ HÌNH THÀNH BỌT KHÍ • Khi nhiệt độ hạ, tinh thể đá tạo các lỗ rò rỉ • Khi giải đông, hình thành bọt khí. • Kích thước bọt khí: 25-100 micron, tỉ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh • Số lượng bọt khí tỉ lệ thuận với tốc độ làm lạnh • Ảnh hưởng của hệ đệm bicarbonate MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH • Hepes • Huyết thanh • Kháng sinh • Muối • Đường • Chất bảo quản lạnh CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH • Khái niệm • Đặc tính • Phân loại + Chất bảo quản ngoại bào: BSA, FBS, saccharide, disaccharide (trehalose, lac, suc), trisaccharide (raffinose), polymer (PVP, polyethylenglycol) + Chất bảo quản nội bào: methanol, ethanol, ethylen glycol, 1,2- isopropandiol, glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO) • Tác dụng CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH Hoạt động: khử nước và bù nước Nồng độ thích hợp? A. Quá trình đông lạnh B. Quá trình tan đông C. Quá trình bù nước D. Quá trình tái nuôi cấy Khối lượng tế bào của phôi tương ứng trong quá trình đông lạnh CHẤT PHỤ TRỢ ĐÔNG LẠNH - Không thấm vào tế bào - Bảo vệ tế bào trong quá trình bù nước - Thường là mono-,di- hoặc tri-saccharide A. Quá trình đông lạnh B. Quá trình tan đông C. Quá trình bù nước khi có đường Sucrose D. Tái nuôi cấy Khối lượng tế bào phôi tương ứng trong quá trình đông lạnh có sucrose MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH VÀ KIỂU TẾ BÀO TẾ BÀO BÁM DÍNH TẾ BÀO Ở DẠNG HUYỀN PHÙ 90% môi trường mới 10% chất bảo quản lạnh (DMSO) 45% môi trường mới 45% môi trường cũ 10% chất bảo quản lạnh (DMSO) PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH • Đông lạnh chậm • Đông lạnh nhanh • Phối hợp đông lạnh nhanh và chậm • Đông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa) ĐÔNG LẠNH CHẬM (Làm lạnh cân bằng) • Sử dụng chất bảo quản với nồng độ thấp (1-2M) • Tốc độ làm lạnh chậm (0,1 – 1,0oC/phút) • Hạ nhiệt tự động • Sự khử nước diễn ra suốt quá trình làm lạnh • Cân bằng giữa tốc độ nước rời khỏi tế bào và nước chuyển sang dạng đá • Chi phí cao, tổn thương tế bào do tác động của nồng độ chất tan. ĐÔNG LẠNH NHANH • Nồng độ chất bảo quản thấp • Tốc độ làm lạnh nhanh • Hạ nhiệt: ba bước • Khử nước không hoàn toàn, hình thành đá nội bào ĐÔNG LẠNH PHỐI HỢP NHANH VÀ CHẬM • Giai đoạn 1: làm lạnh chậm đến -20oC • Giai đoạn 2: làm lạnh nhanh đến -196oC ĐÔNG LẠNH CỰC NHANH (THỦY TINH HÓA) • Nồng độ chất bảo quản cao (>5M) • Tốc độ làm lạnh cực nhanh (2000-25000oC/phút) • Tế bào bị khử nước nhờ tiếp xúc với nồng độ chất bảo quản cao, nước ở dạng băng vô định hình • Có thể ảnh hưởng đến tế bào do nồng độ chất bảo quản cao • Quy trình thực hiện dễ dàng, nhanh chóng, chi phí thấp BIẾN ĐỔI CỦA TẾ BÀO QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH KHÔNG CHẤT BẢO QUẢN QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH KHÔNG CHẤT BẢO QUẢN QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH CÓ CHẤT BẢO QUẢN QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH CÓ CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TỐI ƯU • Tỉ lệ tế bào sống cao nhất • Phương pháp – Làm lạnh chậm để rút nước ra khỏi tế bào – Ngăn sự hình thành tinh thể – Sử dụng chất bảo quản lạnh – Nhiệt độ bảo quản dưới -130oC – Giải đông nhanh để giảm thiểu sự hình thành của tinh thể QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 1. Kiểm tra tình trạng tế bào 2. Bảo dưỡng và thu nhận tế bào 3. Sử dụng chất bảo vệ lạnh phù hợp 4. Sử dụng dụng cụ trữ phù hợp với điều kiện đông lạnh 5. Đánh dấu 6. Điều chỉnh tốc độ làm lạnh 7. Trữ tế bào ở nhiệt độ dưới -130oC 8. Thường xuyên kiểm tra mức nitơ lỏng 9. Ghi nhận định kì KIỂM TRA TÌNH TRẠNG TẾ BÀO – Tình trạng tốt nhất (log phase, mật độ 90%) – Quan sát bên ngoài – Kiểm tra nhiễm + Nuôi trong MT không kháng sinh vài lần trước kiểm tra + Quan sát trực tiếp dưới KHV – Thay môi trường nuôi 24 tiếng trước khi đông lạnh Loại môi trường cũ Huyền phù vào môi trường đông lạnh Tách tế bào Li tâm thu cặn tế bào Đếm mật độ tế bào Bổ sung vào dụng cụ đông lạnh Đưa vào nhiệt độ đông lạnh phù hợp Giải đông ở 37 C Loại môi trường bảo quản Tái nuôi cấy trong môi trường mới ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH ĐẾN TẾ BÀO Hiện tượng Phản ứng của tế bào Giảm nhiệt độ Biến đổi lipid màng Giải trùng hợp bộ xương tế bào Tăng nồng độ chất hòa tan Co thẩm thấu Tăng nồng độ ion Tác động trực tiếp lên màng tế bào, làm hòa tan protein màng Khử nước Mất ổn định lớp đôi lipid Kết tủa muối Không rõ Sự hình thành bọt khí Tổn thương cơ học đối màng và bộ xương tế bào Dung dịch trở nên quá nhớt Hạn chế quá trình khuếch tán, thẩm thấu Thay đổi pH Biến tính protein Tế bào bị đặc lại Tổn thương màng GIẢI ĐÔNG • Rã đông nhanh - 37oC trong bể ổn nhiệt - Giảm thiểu sự hình thành tinh thể • Pha loãng từ từ để ngăn sốc áp suất thẩm thấu • Quá trình bù nước của tế bào • Loại chất bảo quản lạnh: + Thay, ủ trong môi trường mới + Li tâm nhẹ QUY TRÌNH GIẢI ĐÔNG • Lấy các ống đông lạnh tế bào ra khỏi bình nitơ lỏng. • Kiểm tra cẩn thận các nhãn và nắp. • Giữ ống đông lạnh ngoài không khí khoảng 30 giây. • Đặt toàn bộ ống đông lạnh nhúng vào bình ổn nhiệt 370C và lắc nhẹ cho đến khi tan hết. • Rửa tế bào bằng li tâm dịch tế bào đã giải đông trong môi trường nuôi mới. • Tái huyền phù tế bào trong môi trường mới. • Trải các tế bào vào đĩa nuôi cấy với môi trường bình thường. Nồng độ tế bào ban đầu phải cao từ 2-3x10.000 tế bào/cm2. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TẾ BÀO SAU GIẢI ĐÔNG • Nhuộm xác định số lượng tế bào sống, chết • Nuôi cấy sau giải đông • Sức sống tế bào sau giải đông: tăng sinh CÁC VẤN ĐỀ KHI ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 1. Trong quá trình thu nhận và thao tác tế bào + Sự tiếp xúc giữa tế bào và chất bảo quản lạnh + Sự duy trì lượng lớn tế bào ở nhiệt độ phòng và pH 2. Trong quá trình làm lạnh + Làm lạnh quá nhanh, quá chậm hay bị gián đoạn + Sử dụng chất bảo quản lạnh không phù hợp hay sử dụng nồng độ không thích hợp 3. Trong quá trình trữ lạnh + Quá trình chuyển tế bào vào bình trữ lạnh + Nhiệt độ đông lạnh không được duy trì ổn định 4. Trong quá trình giải đông + Giải đông chậm + Phương pháp loại chất bảo quản lạnh không phù hợp