Bài 8: Sản xuất kháng thể đơn dòng

SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG (Monoclonal antibodies-Mab) Là kháng thể kháng một kháng nguyên nào đó được tạo ra từ một dòng tế bào lymphocyte B trong điều kiện in vitro Định nghĩa Là kháng thể với một đặc hiệu duy nhất cho một vị trí epitope duy nhất của kháng nguyên (Milstein) George Kohler và César Milstein – Nobel Y-Sinh học 1984 : Kháng thể đa dòng Kháng thể đơn dòng Tương tác KN-KT không chuyên biệt Giới hạn về số lượng Tương tác KN-KT chuyên biệt Không giới hạn về số lượng Dễ sản xuất Đòi hỏi kỹ thuật cao Kháng thể đơn dòng 1 2 3 4 epitope Huyết thanh Kháng thể đa dòng Kháng thể đơn dòng 8 bước tạo MAb • Chọn động vật gây nhiễm, chọn Ag • Gây đáp ứng miễn dịch • Thu TB lách và TB myeloma • Dung hợp TB lách với TB myeloma • Sàng lọc, dòng hóa hybridoma • Nhân sinh khối MAb bằng phương pháp in vitro hay in vivo • Tinh chế MAb • Thu nhận, kiểm tra MAb (1a) Chọn động vật gây nhiễm • Động vật thường được sử dụng để tạo hybridoma: mouse (chuột nhắt), Sprague Dawley rat (chuột lớn), Armenian hamster, thỏ • Mouse là mô hình lý tưởng nhất: đáp ứng miễn dịch mạnh tổng hợp kháng thể nhanh • 2 dòng mouse lý tưởng trong công nghệ sản xuất MAb: BALB/c và C57BL/6 • Lai cùng dòng • Chuột cái • 6-8 tuần tuổi • “sạch tuyệt đối” BALB/c C57BL/6 Lai taïo 1967 taïi Ñöùc Lai taïo 1982 taïi Myõ Rat Hamster Hệ thống chuồng chuột sạch (1b) Chọn Ag • Quyết định sự thành công của quy trình • Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản phẩm tạo thành • Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm (MAb gắn đặc hiệu với Ag tiêm vào) • Được nhận diện bởi MAb mục tiêu • Có tính gây đáp ứng miễn dịch (antigenic) mạnh • Có cấu trúc càng giống với Ag tự nhiên càng tốt Hiện nay, Ag thường được tạo ra bằng kỹ thuật protein tái tổ hợp. • Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các hapten phối hợp với protein, vaccine thương phẩm hay là một phân tử protein nào đó Antigen Các vị trí tiêm Ag Intravenous (i.v.): into a vein (tiêm vào tĩnh mạch) Intradermal (i.d.): into the skin (tiêm vào da) Subcutaneous (s.c.): beneath the skin (tiêm dưới da) Intramuscular (i.m.): into a muscle (tiêm vào cơ) Intraperitoneal (i.p.): into the peritoneal cavity (tiêm vào khoang bụng) (2) Gây đáp ứng MD Phải gây ĐƯMD khác loài Nguyên tắc 1 Sử dụng động vật gây nhiễm là mouse thì phải dùng kháng nguyên có nguồn gốc từ rat hay hamster để gây đáp ứng miễn dịch (2) Gây đáp ứng MD Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng một loài với đối tượng gây ĐƯMD để đảm bảo khả năng dung hợp của nó với tế bào lách Nguyên tắc 2 - Tế bào lách được thu nhận từ mouse thì nên chọn dòng myeloma mouse như SP2/0 hay X63/Ag.8653 - Tế bào lách được thu nhận từ rat thì nên chọn dòng myeloma rat như Y3/Ag1.2.3 (2) Gây đáp ứng MD Phải có chất bổ trợ (adjuvant) đi kèm Nguyên tắc 3 • CFA (Complete Freud’s Adjuvant): nước, nhũ tương dầu, xác vi khuẩn Mycobactericum • IFA (incomplete Fleud’s adjuvant): nước, nhũ tương dầu • ALUM (Aluminum hydroxide gel) Tiêm 10-100g/1 chuột/1 lần Tá dược thường được sử dụng là CFA Với kháng nguyên là protein Tiêm 0,5 - 5 x107 tb/1 chuột/ 1 lần Tá dược thường được sử dụng là ALUM Với kháng nguyên là tế bào Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm 0 Tiêm mũi cơ bản CFA s.c. 14 Tiêm nhắc lại lần 1 IFA s.c. 28 Tiêm nhắc lại lần 2 IFA s.c. 36 Thu serum 42 Nghỉ trước khi dung hợp (hay tiêm nhắc lần 3) IFA s.c. 52 Tiêm nhắc lại lần cuối i.v. 55 Thu tế bào lách sau khi đã xác định hiệu giá của Ig trong huyết thanh Quy trình gây ĐƯMD ở mouse Ngaøy THAO TAÙC Chất bổ trợ Vò trí tieâm 0 Tiêm mũi cơ bản CFA i.p. 21 Tiêm nhắc lần 1 IFA i.p. 42 Tiêm nhắc lần 2 IFA i.p. 52 Kiểm tra serum 53 ELISA 63 Tiêm nhắc lần 3 IFA i.p. 73 Kiểm tra serum 74 ELISA 84 Tiêm nhắc lần 4 IFA i.p. 94 Kiểm tra serum 95 ELISA 98 Tiêm nhắc lần cuối i.v. 101-110 Thu lách Quy trình gây ĐƯMD ở rat Xác định hiệu giá kháng thể Pha loãng huyết thanh theo từng bậc (1) Bổ sung một lượng nhất định KN vào mỗi tube (2) Ủ - xác định độ pha loãng cao nhất vẫn cho phản ứng (trong trường hợp này là 1/16) (3) Undiluted serum 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Negative control Undiluted serum 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Negative control Huyết thanh ban đầu Chứng âm Huyết thanh ban đầu Chứng âm Chọn lọc hybridoma Tổng hợp nucleotide Con đường de novo (bị ức chế bởi môi trường HAT) Con đường dự trữ (sử dụng enzyme HGPRT) B cell de novo Salvage (HGPRT+) Hybridoma de novo Salvage (HGPRT+) Myeloma de novo Salvage (HGPRT-) Chết ChếtSống Môi trường chọn lọc HAT Môi trường chọn lọc HAT Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con đường: – Con đường De novo cần hoạt động của enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) – Con đường Salvage cần enzyme HGPRTase (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) để tổng hợp purine – Aminopterin có trong HAT ức chế hoạt tính của DHFR  tế bào phải tổng hợp nucleotide bằng con đường Salvage – Tế bào HGPRT(-) không có khả năng tổng hợp purine (hypoxanthine hay guanine) bằng con đường Salvage Dung hợp tế bào lách với myeloma Chuột đã được gây MD Lympho B Chuột Dầu khoáng Plasmacytoma (Bào tương ung thư) Myeloma Hybridoma Dung hợp Không sản xuất Ig Có bộ máy tiết Ig “Bất tử” trong in vitro Sản xuất Ig Không tồn tại lâu dài trong in vitro Sản xuất Ig Có bộ máy tiết Ig “Bất tử” trong in vitro Immortal Tumor Of Lymphocytes + 8 - Azaguanine Myeloma Cells HGPRT- Myeloma Cells Kiểm tra myeloma (4) Các kĩ thuật dung hợp tế bào • Kết dính tự nhiên • Hóa chất (PEG) • Các yếu tố vật lý (xung điện, sóng siêu âm) • Virus (Sendai) • Vi tiêm Máy tạo xung điện Buồng dung hợp Tế bào trong buồng dung hợp (5a) Sàng lọc hybridoma Dung hợp Lympho B Myeloma Hybridoma Sàng lọc Ag Dòng hóa Hybridoma sản xuất Ig mục tiêu Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA Western Blotting Immunoflorescent essay (5b) Dòng hóa Hybridoma (6) Nhân sinh khối MAb • Hybridoma được nuôi trong môi trường phát triển nhân tạo (bioreactor, bình Roux) • MAb được tiết vào nước nổi của dịch nuôi cấy tế bào (supenatant cell culture) • Nhược điểm: Nồng độ MAb thu được tương đối thấp (0,01-0,5mg/mL dịch nuôi cấy) • Ưu điểm: Có thể sản xuất với số lượng lớn bằng hệ thống bioreactor (6a) Sản xuất MAb in vitro Hệ thống bioreactor nhân sinh khối tế bào • Hybridoma được tiêm vào khoang bụng của vật chủ (ascites) • MAb được tiết vào dịch nước báng (ascites fluid) • Ưu điểm: Nồng độ MAb thu được khá cao (1- 15mg/mL nước báng) • Hạn chế: Đạo lí xã hội về sử dụng động vật thí nghiệm (6b) Sản xuất MAb in vivo Mồi chuột bằng pristane Tiêm hybridoma vào khoang bụng (peritoneal cavity) Thu thập nước báng (ascites fluid) Pristane • 2,6,10,14 - tetramethylpentadecane • Tách chiết từ dầu gan cá mập • Gây ra bệnh viêm khớp ở Rat, là mô hình nghiên cứu bệnh viêm khớp mãn tính ở người • Gây ra bệnh lao da ở chuột, là mô hình nghiên cứu bệnh tự miễn • Là yếu tố quan trọng kích thích tạo nước báng trong khoang bụng của chuột, kích thích sự tạo MAb (7) Tinh chế protein • Sắc ký ái lực (affinity chromatography) • Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography) • Lọc gel (gel filtration) • Sắc ký cao áp • Kết tủa với muối ammonium sulfate hay acid caprylic Hệ thống sắc kí lỏng cao áp HPLC (High pressure liquid chromatography) Sắc ký ái lực Mab trong liệu pháp chữa trị ung thư Tế bào khối u Ag ung thư Mab kháng Ag ung thư NK cells, Mf ADCC MAC Bổ thể Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano (quantum dot) Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano (quantum dot) ứng dụng trong in vitro KTĐD gắn quantum dot phát huỳnh quang trong nhận diện thụ thể bề mặt tế bào ung thư đại tràng Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano (quantum dot) ứng dụng trong in vivo Mouse MAb Chimeric MAb Humanized MAb Mouse Mab: toàn bộ phân tử kháng thể có nguồn gốc từ chuột Chimeric MAb: vùng Fab từ chuột, vùng Fc từ người Humanized MAb: 3 vùng hypervariable từ chuột, các vùng còn lại từ người