Bài 9: Các kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật

1Các kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 2Nội dung bài học  Mở đầu  Các phương pháp chuyển gen không sử dụng virus  Các phương pháp chuyển gen sử dụng virus  Ứng dụng  Kết luận 3Mở đầu  Dự án giải mã bộ gen Người (Human Genome Project, 1990 – 2003)  Hiểu biết rõ ràng hơn về bộ gen Người  Cải tiến về các phương pháp chuẩn đoán, điều trị trên từng cá thể Liệu pháp gen 4Mở đầu  Liệu pháp gen là việc áp dụng các nguyên lí di truyền trong điều trị bệnh lí trên người  Liệu pháp gen = chuyển vật liệu di truyền vào tế bào với các mục tiêu  Thay thế cho các gen mất chức năng  Ức chế sự biểu hiện của gen bệnh  Tiêu diệt tế bào bệnh bằng gen tự sát  5Mở đầu Mô hình liệu pháp gen 6Mở đầu  Chiến lược chuyển gen  In vivo  Ex vivo 7Mở đầu  Các phương pháp chuyển gen  Phương pháp chuyển gen sử dụng virus  Phương pháp chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp hóa học  Phương pháp vật lí 8Phương pháp  Chuyển gen bằng virus  Khả năng xâm nhiễm đa dạng và chuyên biệt  Gắn chèn gen mục tiêu vào bộ gen của tế bào chủ  biểu hiện ổn định protein mục tiêu  Retrovirus, Herpesvirus, Adenovirus, Lentivirus, 9 Quá trình sao chép của virus Phương pháp 10 Chuyển gen sử dụng virus  Chiến lược sử dụng vector virus  Giai đoạn 1: tạo vector virus Vector DNA Helper DNA Virus hoang dại Vector retrovirus Protein virus Protein virus Tín hiệu đóng góiGen mục tiêu Gen cần thiết của virus Tế bào đóng gói 11 Chuyển gen sử dụng virus vector Vector trần mRNA và Protein trị liệu Vector tồn tại trong nhân Vector gắn chèn vào NST Tế bào mục tiêu  Giai đoạn 2: quá trình xâm nhiễm 12 Chuyển gen sử dụng virus  Retrovirus  Cấu tạo  Vỏ  Thụ thể Glycoprotein  Lõi  Protein lõi  Vật liệu di truyền  Các enzym 13 Chuyển gen sử dụng virus  Retrovirus 14 Chuyển gen sử dụng virus  Retrovirus  Ưu điểm  Gắn chèn gen mục tiêu vào NST của tế bào quan tâm  biểu hiện gen mục tiêu ổn định  Ít nhạy cảm với hệ miễn dịch  Sử dụng đối với các dòng tế bào phân chia mạnh  Khuyết điểm  Gắn chèn gen mục tiêu một cách ngẫu nhiên  Không có khả năng chuyển nhiễm lên các dòng tế bào không phân chia  Sự biểu hiện bắt đầu giảm đi sau một thời gian biểu hiện ổn định 15 Chuyển gen sử dụng virus 16 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp hóa học  Calcium Phosphate  DEAE dextran  Liposome  Phương pháp vật lí  Điện biến nạp  Súng bắn gen 17 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp hóa học  Sử dụng lần đầu tiên vào năm 1965 (DEAE- dextran)  Giúp cho DNA dễ dàng bám và di chuyển qua màng tế bào, màng nhân.  Hiệu quả thấp hơn so với các phương pháp chuyển gen sử dụng virus  Yêu cầu nghiêm ngặt về hóa chất sử dụng  Không liên quan đến các vấn đề về an toàn sinh học 18 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp Calcium Phosphate  Tạo tủa từ phức hợp DNA/CaCl2 và đệm HBS 2X (Hepes buffer saline)  Tủa có chứa DNA sẽ được gắn lên bề mặt tế bào quan tâm  DNA sẽ di chuyển vào bên trong tế bào thông qua cơ chế thực bào (endocytosis)  Tủa CaPO4: ngăn chặn sự ảnh hưởng của nuclease 19 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp Calcium Phosphate 20 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp DEAE-dextran  Phức hợp DNA/DEAE-dextran được tạo ra dưới tác dụng của lực tĩnh điện  DEAE-dextran có điện tích +, gắn kết DNA (-) và màng tế bào (-)  Hiệu quả cao hơn Calcium phosphate, nhưng DEAE-dextran độc với tế bào, dễ làm chết tế bào sau biến nạp  Thực hiện biến nạp không sử dụng huyết thanh 21 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp DEAE-dextran 22 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp Cationic lipid (Liposome)  Một trong những phương pháp không sử dụng virus khá hiệu quả  Khi cho Cationic lipid vào DNA  Tập hợp DNA (điện tích)  Hình thành phức hợp 2 lớp nhiều tầng DNA/cationic lipid  Dễ dàng thấm qua màng tế bào hoặc di chuyển thông qua quá trình thực bào  Một số loại cationic lipid độc với tế bào  Một số sản phẩm thương mại: Lipofectamine (Invitrogen), Fugene (Roche, Promega) 23 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp Cationic lipid (Liposome) 24 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp vật lý  Thường sử dụng khi các phương pháp chuyển gen bằng hóa học kém hiệu quả  Không phụ thuộc vào loại tế bào  Không có giới hạn về kích cỡ DNA chuyển  Yêu cầu có các dụng cụ chuyên biệt (Súng bắn gen, Máy điện biến nạp, Hệ thống vi thao tác, ) 25 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp điện biến nạp  Sử dụng dòng điện  tạo một điện trường tác động lên màng tế bào trong thời gian cực ngắn (us – ms)  Xuất hiện các lổ (pore) trên màng tế bào  vector dễ dàng di chuyển xuyên qua màng tế bào  Thông số điện biến nạp giữa các dòng tế bào rất khác nhau  Thường gây chết tế bào !!! 26 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp điện biến nạp 27 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp điện biến nạp 28 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp bắn gen  Hệ thống bao gồm một xylanh và một “hộp đạn” có chứa các hạt vàng được phủ DNA  Khi kích hoạt hệ thống, khí nén Helium được giải phóng, tác động một sóng siêu âm lên các hạt vàng có phủ DNA  các hạt này di chuyển vào tế bào chất của tế bào  Thường áp dụng cho tế bào thực vật (Bắp, Lúa mạch, Đậu nành, ) 29 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp bắn gen 30 Ứng dụng  Bệnh SCID – Suy giảm miễn dịch trầm trọng (Severe Combined Immunodeficiency Disease)  Do thiếu hụt Adenosin Deaminase (Adenosine Deaminase Deficiency (ADA)), dẫn đến tạo ra một số lượng lớn S-adenosylhomocysteine, gây độc cho sự trưởng thành của Lympho T và B  Gen mã hóa nằm ở NST số 22 (32Kbp, 12 exons)  Hậu quả: Lympho T và B không có chức năng  Các tác nhân lạ dễ dàng xâm nhập  chết, nếu không điều trị 31 Ứng dụng  Điều trị  Trước khi có liệu pháp gen  ghép tủy  David, bị SCID khi vừa mới sinh ra đời, nhận tủy của chị gái  chết, do bị ung thư máu 32 Ứng dụng  Điều trị  Tháng 9, 1990, NIH đã điều trị cho 2 bệnh nhân SCID đầu tiên bằng liệu pháp gen  Ashanti – 4 tuổi, được tiến hành ghép các tế bào lympho đã được biến nạp gen mã hóa ADA bằng phương pháp sử dụng retrovirus (~109 vector retrovirus được sử dụng)  Cynthia – 9 tuổi, điều trị giống như Ashanti  Thành công trong việc tái tạo hệ miễn dịch, tuy nhiên, các tế bào bạch cầu có đời sống ngắn, phải lặp lại các ca ghép tế bào đã được chuyển gen. 33 Ứng dụng  Bệnh ung thư và liệu pháp sử dụng virus oncolytic  Chuyên biệt receptor  Chuyên biệt sao chép  Không có sự xuất hiện của protein kháng virus  Sử dụng promoter thích hợp 34 Ứng dụng  Bệnh ung thư và liệu pháp sử dụng virus oncolytic AFP promoter 35 Kết luận  Các kỹ thuật chuyển gen  ưu điểm và khuyết điểm riêng  Liệu pháp gen  chưa ổn định, cần thêm sự hoàn thiện của các phương pháp chuyển gen  Liệu pháp gen = “ốc đảo giữa sa mạc”