Bài giảng Biến dị soma trong quá trình nuôi cấy in vitro

BIẾN DỊ SOMA TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Thị Lý Anh Nhóm sv thực hiện: Nhóm 6 Lê Như Sang Trương Thị Mai Nguyễn Hải Hà Mông Thị ThuThủy Phan Thị Hương Cù Thu Hà NỘI DUNG Một số khái niệm 1.1 Biến dị 1.2 Biến dị tế bào soma 1.3 So sánh biến dị dòng soma với đột biến Phân loại biến dị dòng soma 2.1 Biến dị kiểu gen 2.2 Biến dị kiểu hình III Nguyên nhân gây biến dị dòng soma 3.1 Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các mẫu cấy 3.2 Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy IV Cơ chế tạo biến dị soma V Lợi ích và tác hại của biến dị dòng soma VI Chọn lọc biến dị dòng soma VII Khả năng ứng dụng và triển vọng VIII Ví dụ về một công trình nghiên cứu ứng dụng thành công biến dị dòng soma trong việc chọn tạo giống. I CÁC KHÁI NIỆM 1.1 Biến dị: Biến dị là những biến đổi mới mà cơ thể sinh vật thu được do tác động của các yếu tố môi trường và do quá trình tái tổ hợp di truyền. Biến dị tạo nên sự đa dạng vô cùng lớn ở các cá thể sinh vật, là nguyên nhân cơ bản của tiến hoá và là nguồn nguyên liệu cho chọn giống. I. CÁC KHÁI NIỆM 1.2 Biến dị dòng soma Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến dị thể hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin và Scowcropt, 1981). Biến dị dòng soma còn được gọi là biến dị dòng vô tính. Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài cây trồng như thuốc lá, khoai tây, cà chua, mía, họ cải… bao gồm đây đủ các tính trạng nông học như chiều cao cây, số nhánh, thời gian sinh trưởng cũng như các tính trạng hóa sinh khác. Hình ảnh về biến dị tế bào soma ở dâu tây và cúc 1.3 So sánh biến dị tế bào soma và đột biến Cần phân biệt giữa hai khái niệm: biến dị tế bào soma và đột biến II. PHÂN LOẠI BIẾN DỊ DÒNG SOMA Biến dị kiểu gen (genetic hay heritable variation) Biến dị kiểu hình (epigenetic hay phenotypic variation) 2.1 BIẾN DỊ KIỂU GEN Là các biến dị có khả năng di truyền, xảy ra với tỷ lệ rất thấp và không có tích thuận nghịch Bản chất: Chưa được làm sáng tỏ Bao gồm 3 loại: Đột biến hệ gen, đột biến NST và đột biến gen Đột biến hệ gen Là các biến đổi về số lượng NST . Loại phổ biến là sự sai khác về số lượng NST như đa bội, dị bội,hay thể khảm. Các loài có độ bội thể cao và nhiều về số lượng NST cao dễ bị biến đổi hơn các loài có mức độ bội thể thấp và ít NST. Biến đổi này xảy ra thường xuyên trong nuôi cấy tế bào, đặc biệt tròn nuôi cấy tế bào trần Những biến đổi này có thể xảy ra ngay từ giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, do sự phân tách NST không bình thường ở những chu kỳ tế bào đầu tiên. Đa bội thể ở tỏi và đu đủ ĐỘT BIẾN NST Là các biến đổi về cấu trúc NST, các thay đổi này có thể bao gồm các hiện tượng như: Mất đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hay nhân đoạn (Tạo ra các NST lớn hơn), chuyển đoạn và các biến đổi trong quá trình giảm phân. Những biến đổi này có thể ảnh hưởng tới kiểu hình ở R0 và các thế hệ tiếp theo. ĐỘT BIẾN GEN (ĐỘT BIẾN ĐIỂM) Là các biến đổi ở mức độ phân tử: sự thay đổi của một cặp base, thay đổi về số lượng bản sao của một trình tự đặc thù, sự thay đổi trong thể hiện của các nhóm đa gen hay sự thể hiện của các gen nhảy(Transposable elements).Sự xuất hiện các đột biến này về cơ bản mang tính ngẫu nhiên Những tính trạng đột biến thu được ở những cây tái sinh R0 và cũng được di truyền cho các đời sau. BIẾN DỊ KIỂU HÌNH Các biến dị kiểu hình thường liên quan đến sự thay đổi trong quá trình thể hiện của một gen nhất định. Điển hình là các quá trình khuếch đại và methyl hóa gen. Các biến dị kiểu hình thường xuyên xuất hiện ở các cây tái sinh sau nuôi cấy như là kết quả của các phản hồi về mặt sinh lý. Các thay đổi về kiều hình có thể là tạm thời, không có tính di truyền và có thể phục hồi trạng thái ban đầu. Tuy nhiên chúng có thể duy trì trong suốt chu kỳ sống của các cây tái sinh Nguyên nhân: Chưa được tìm hiểu rõ nhưng chắc chắn có liên quan đến một vài thay đổi trong quá trình biểu hiện gen. Hiện tượng khuyếch đại gen cũng làm thay đổi hệ gen. Ví dụ như ở cỏ linh lăng đã thu được dòng tế bào có mức kháng thuốc thuốc trừ cỏ photphinotrixin tăng 20 lần so với bình thường. Thuốc này có tác động ức chế enzyme glutaminsythetase. Phân tích cho thấy, gen kiểm tra ezyme này được khuếch đại 4 -11 bản, làm tăng hoạt tính phiên mã lên 8 lần Hiện tượng tăng mạnh mẽ khả năng sinh trưởng của các cây tái sinh khi trồng trên đất. Biều hiện này có thể liên quan đến việc trở lại của trạng thái trẻ hoá hoặc quá trình loại bỏ virus khỏi nguồn mẫu cấy ban đầu Các ví dụ khác thuộc nhóm này gồm hiện tượng ra hoa sớm, bạch tạng, các thay đổi về hình dạng, mầu sắc cánh hoa, hình dạng lá và chiều cao cây... Chuối lùn III. NGUYÊN NHÂN GÂY BIẾN DỊ DÒNG SOMA Bất kì một yếu tố có khả năng có thể dẫn đến các thay đổi di truyền đều được xem như là một nguyên nhân gây ra các biến dị này. Các yếu tố này chia làm ba nhóm: sinh lý, di truyền, hoá sinh. Hai nguyên nhân chính gây biến dị dòng soma là: tính không đồng nhất di truyền của các tế bào soma của mẫu cấy ban đầu và tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy in vitro 3.1 Sự đa dạng di truyền của tự nhiên của các tế bào nuôi cấy Các mẫu cấy có nguồn gốc từ một dòng đơn tính, từ hạt hay cây con được xem như là đồng nhất về mặt di truyền và khi lấy mẫu có thể có kiểu hình giống nhau. Tuy nhiên các mẫu cấy này thực tế lại bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau như là ploem, xylem, nhu mô, mô vỏ… Những tế bào này có mức độ bội thể khác nhau. Nói cách khác, có sự đa dạng tế bào giữa các loại tế bào trong cùng một mẫu cấy. Sự đa dạng này được gọi là đa bội vô tính (Polysomatic). Ngoài ra nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm. Chúng chứa những lớp tế bào hoặc mô có cấu trúc di truyên khác nhau được phát triển từ meristem có chứa lớp hay bộ phận mô bị đột biến. Hiện tượng này đặc biệt phổ biến ở cây thân gỗ. 3.2 Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy Phương thức nhân giống in vitro Các phương thức nhân giống khác nhau sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị vô tính khác nhau. Nhìn chung nếu chồi bất định được tái sinh từ một tế bào thì cơ hội để xuất hiện các biến dị soma thường là lớn hơn rất nhiều từ các chồi được tái sinh từ nhiều tế bào. Các quá trình nuôi cấy callus, huyền phù hoặc protoplast do đó thường có nhiều biến dị soma Loại mẫu cấy. Các loại mẫu cấy khác nhau thường thể hiện mức độ biến dị khác nhau. Các mẫu cấy có nguồn gốc từ các thể tiền chồi như chồi nách, chồi đỉnh hoặc meristem thường có mức độ biến dị thấp hơn khi sử dụng các mẫu cấy có nguồn gốc không phải đỉnh sinh trưởng như lá, rễ hay protoplast. Khả năng xảy các biến dị soma còn phụ thuộc vào kiểu gen cũng như tuổi cây mẹ. Các dòng già hơn thường ẩn các biến dị sẵn có ở mức cao hơn các dòng trẻ hơn. Các loài có độ bội càng cao và số lượng NST càng nhiều thì có tính biến dị càng cao Loại và nồng độ chất điều tiết sinh trưởng sử dụng Cho các mô nuôi cấy dài ngày trong môi trường chứa các auxin mạnh như 2,4 D hoặc 2,4,5 T thường gây ra các sai khác trong cây tái sinh. Ví dụ như các cây dầu dừa tái sinh từ callus nuôi cấy dài ngày trên môi trường có chứa 2,4 D có tỷ lệ rất lớn các biến dị khi trồng trên đồng ruộng Thời gian nuôi và số lần cấy chuyển Việc nuôi cấy dài ngày trong điều kiện in vitro cũng như tăng số lần cấy chuyển cũng sẽ làm tăng khả năng xuất hiện các biến dị soma Nguyên nhân của hiện tượng này là do sự thay đổi của các kiểu methyl hóa bình thường của DNA genome. IV. CƠ CHẾ TẠO BIẾN DỊ SOMA Sự thay đổi các kểu Methyl hóa bình thường của DNA genome. Quá trình methyl hóa là một quá trình mà một nucleotide cụ thể, thường là Adenine hay Cytosin – có một nhóm methyl gắn liền với nó. Khi quá trình methyl hóa xảy ra như vậy trong một vùng mã hóa DNA cho một gen hoạt động, nó đã cản trở gen này và gen bị bất hoạt. Việc bất hoạt gen do quá trình methyl hóa có thể không được nhận biết về mặt hiện tượng mặc dầu quá trình này đã được tìm thấy trong nuôi cấy mô ở một số loài như ngô, khoai tây và nho. Sự sắp xếp lại của NST Sự mất, nhân đôi và tái tổ hợp vô tính là các nguồn chính của biến dị di truyền thể hiện ở các dòng soma. Ví dụ: Khi nghiên cứu về cơ chế dẫn đến sự thay đổi trong NST, một số ý kiến cho rằng sự tái bản muộn của vùng dị NS là nguyên nhân chính dẫn đến các biến dị dòng vô tính ở ngô và đậu lớn Sự hoạt hóa các nhân tố chuyển vị Sự tách ra hay xen vào của các nhân tố này ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc các gen cấu trúc ở gần nó. Hơn thế sự tách ra không chính xác của các nhân tố chuyển vị có thể tạo ra sự tái sắp xếp của các trình tự nucleltide phụ . Chúng là nguyên nhân của các biến đổi trong biểu hiện gen cấu trúc NST. Các nhân tố chuyển vị như Tnt2 trong thuốc lá được hoạt hóa trong nuôi cấy mô. Đột biến điểm Chúng có thể là đột biến lặn hay trội. Các đột biến gen đã được tìm thấy ở cây cà chua (13 đột biến gen đơn khác nhau ở 230 cây tái sinh), lúa mì, thuốc lá VI. CHỌN LỌC DÒNG TẾ BÀO SOMA 6.1. Nguyên tắc chọn lọc tế bào: Chọn trực tiếp: Thông qua ưu thế về sinh trưởng hay sự khác biêt thấy được về màu sắc có thể chọn được từ quần thể tế bào. Hệ thống tế bào hay được sử dụng là các tế bào dịch huyền phù hoặc khối callus. Điều kiện chọn lọc là các độc tố với nồng độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên sinh trưởng của tế bào. Thông thương người ta trộn tế bào và môi trường thạch chứa dược tố và chọn những tế bào sống sót phân chia thành khuẩn lạc mô sẹo hoặc cấy trực tiếp lên môi trường chọn lọc chứa độc tố. Chọn gián tiếp: Trong trường hợp này đặc điểm của dong được chọn là kết quả biểu hiện khuyết tật của tế bào. Thí dụ điển hình là tổng hợp enzym nitrate reductase (NR). Trên môi trường chứa Clo3- những tế bào có NR sử dụng clo3- như NO3- và khử thành clo2-, clo2- tác dụng như một độc tố cho nên chỉ có những tế bào không có NR mới sống sót trên môi trường chọn lọc Chọn tổng thể Các tế bào dị dưỡng thực vật thường được chọn bằng phương thức xử lý đột biến và nuôi trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết có khi lại chính là yếu tố gây đột biến. VD: đột biến lặn chịu được S-2-aminoethyi cysteine xuất hiện sau khi xử lý phôi nuôi cấy 6.2. Cách chọn dòng tế bào: Không có tác nhân chọn lọc Các tế bào và callus không xử lý sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro ở các thời kỳ khác nhau trên môi trường không chứa tác nhân chọn lọc (độc tố hoặc các chất ức chế),được cảm ứng để phân hóa các cây hoàn chỉnh. Các cây tái sinh sẽ được trồng trên đồng ruộng để chọn lọc các biến dị. Bằng phương thức này người ta đã thu được các biến dị dòng soma của các cây trồng khác nhau. Các ví dụ Với Cây mía đường (Saccharum officinarum) người ta đã chọn được các cây kháng bệnh mốc sương (downey mildew), bệnh Fiji (do virus apid – transmitted) trên giống mía Pindar, hoặc cải thiện một số giá trị nông học của giống mía Q10 kháng bệnh dốm mắt. (Do Helminthosporium sacchari). Với cây khoai tây. Shepard và cộng sự (1980) đã tái sinh một số lớn cây từ protoplast tế bào thịt lá của giống “Russet burbank” và thông báo các biến dị thu được trong quần thể protoclones. Một trong số chúng kháng được bệnh thối sớm (early bright do Alternaria solani) hoặc thối muộn (late bright do phytophthora infestans) Với cây cà chua Evan và cs đã phân lập các dòng soma của cà chua bằng các biến dị hình thái là các đột biến lặn của tính bất dục kháng nấm Fusarium oxysporium ở mắt cuống lá, khả năng lục hóa của lá, màu sặc của quả và hoa. Có nhân tố chọn lọc Theo phương pháp này các dòng tế bào biến dị được sàng lọc từ nuôi cấy nhờ vào khả năng sống sót của chúng khi có mặt các độc tố/chất ức chế trong môi trường dinh dưỡng, hoặc dưới các điều kiện stress của môi trường. Các biến dị có thể thu được bằng cách chọn lọc trực tiếp, gián tiếp. Sự phân lập được tiến hành trong nuôi cấy dịch huyền phù hoặc bằng cách dàn trải tế bào đơn/protoplast. CÁC HƯỚNG CHỌN LỌC Kháng amino acid và các đồng đẳng của amino acid Kháng bệnh Kháng thuốc diệt cỏ Chống chịu với các stress của môi trường Kháng kháng sinh Kháng các đồng đẳng base của DNA Một số ví dụ thành công trong chọn lọc invitro đột biến soma Ứng dụng của biến dị soma Trong cải tiến giống cây trồng truyền thống, nhà chọn tạo giống phải trồng một số lượng lớn các cây trong nhà kính hay trên đồng nếu như muốn chọn lọc một đặc tính cụ thể nào đó. Nếu làm như vậy,số nguyên liệu sử dụng sẽ bị giới hạn bởi diện tích có sẵn và thời gian. Ngoài ra các yếu tố di truyền cũng cản trở đến quá trình chọn lọc Các hệ thống nuôi cấy tế bào giúp cho các nhà chọn tạo giống có môi trường được xác định rõ ràng,nơi mà áp lực chọn lọc có thể làm trên hàng ngàn các tế bào đơn và có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Như vậy có thể chọn lọc từ lượng rất nhỏ các vật liệu di truyền đồng nhất về di truyền và xây dựng các thử nghiệm nhanh chóng trong một vài đĩa petri hay bình nuôi cấy. Có thể nghiên cứu một loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hay ngược lại vì điều kiện môi trường đặc thù là có thể tạo ra ở bất cứ đâu. Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt tính sinh học với năng suất cao. Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý