Bài giảng các phương pháp nuôi cấy tế bào - Chương I: Mở đầu

5/17/2013 1 CHƢƠNG MỞ ĐẦU GIỚI THIỆU MÔN HỌC ThS. Nguyễn Thành Luân Email: luannt@cntp.edu.vn KHOA CNSH & KTMT BÀI GIẢNG CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỀ CƢƠNG MÔN HỌC Tên học phần: CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO Mã học phần: 08220058 Số tín chỉ: 2 (2, 0, 4) Trình độ: Dành cho sinh viên đại học Hệ đào tạo: Đại học Mục tiêu môn học – Trình bày đƣợc kiến thức chung về nuôi cấy tế bào, những hiểu biết chung về môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy; cũng nhƣ các phƣơng pháp nuôi cấy cơ bản ở các mô tế bào khác nhau nhƣ vi sinh vật, thực vật hoặc động vật. – Hiểu đƣợc sự ảnh hƣởng của các điều kiện ngoại cảnh đến khả năng nuôi cấy và sinh trƣởng, phát triển của tế bào cũng nhƣ xuất hiên các biến dị của mô hoặc tế bào sinh vật khi có sự thay đổi các yếu tố ngoại cảnh. 5/17/2013 2 Nội dung cơ bản của môn học ─ Cơ bản về nuôi cấy tế bào ─ Cấu trúc cơ bản của tế bào và sự di truyền của nó sau khi nuôi cấy. ─ Cơ chế điều hòa và hoạt động của hệ gen đối với tế bào nuôi cấy. ─ Các phƣơng pháp và kỹ thuật áp dụng cho kỹ thuật nuôi cấy tế bào. ─ Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật nuôi cấy mô & tế bào. Tài liệu học tập • Sách, giáo trình chính [1] Nguyễn Hoàng Lộc. Giáo trình Công nghệ tế bào, NXB Đại học Huế. 2006 [2] Bùi Trang Việt. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Nhà xuất bản Giáo dục. 2005 [3] Nguyễn Đình Giậu, Nguyễn Chi Mai, Trần Thị Việt Hồng. Sinh lý học người và động vật. Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM. 2000 Tài liệu tham khảo  Novakovic, G.V. & Freshney, R.I. Culture of Specialized Cells – Culture of Cells for Tissue Engineering, Wiley-Liss, New Jersey, USA. 2006  Mather, J.P. & Roberts, P.E. Introduction to Cell and Tissue Culture: Theory And Technique, Plenum Press, New York. 1998. 5/17/2013 3 Tiêu chí đánh giá môn học  Dự lớp: 80% trở lên tính theo số tiết lên lớp  Thi giữa học phần: 0%  Thi kết thúc học phần: 70%  Khác: 30% (Thảo luận, tiểu luận…) Đánh gia ́ tiểu luận (30%) • Seminar + tiểu luận theo nhóm • Thời gian: 15 phút/nhóm, phải có đầy đủ thành viên báo cáo • Chủ đề vê ̀ 1 tài liệu chuyên ngành vê ̀: – Nuôi cấy tê ́ bào VSV – Nuôi cấy tê ́ bào thực vật – Nuôi cấy tê ́ bào động vật • Chú trọng vào các phƣơng pháp nuôi cấy hiện đại, ứng dụng cao • Mỗi nhóm tiểu luận: <= 5 ngƣời BÁO CÁO TIỂU LUẬN • Sinh viên tự chọn lọc tên đề tài phù hợp về các lĩnh vực nuôi cấy tế bào vi sinh vật, thực vật & động vật. • Chọn lọc phƣơng pháp nuôi cấy hiện đại, theo quy trình nuôi cấy theo công nghiệp (thành phẩm). • Ƣớc lƣợng rõ ràng giá cả, phân tích ƣu và nhƣợc điểm của thiết bị và hiệu suất sử dụng cho đối tƣợng cụ thể. 5/17/2013 4 Cấu trúc bài báo cáo seminar • Bao gồm các phần: – ĐẶT VẤN ĐỀ – TỔNG QUAN – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: chú trọng – KẾT QUẢ DỰ KIẾN – THẢO LUẬN & KẾT LUẬN. – KIẾN NGHỊ (NẾU CÓ) BÁO CÁO DƢỚI DẠNG FILE PPT ĐƢỢC GHI ÂM THỜI HẠN NỘP BÀI LỚP TRƢỞNG TỔNG HỢP CÁC FILE CỦA CÁC NHÓM VÀO ĐĨA VÀ GỞI ĐĨA VỀ KHOA VÀO NGÀY 05/07/2013 (Không nhận bài sau ngày trên) BÌA ĐĨA GHI: BÀI TIỂU LUẬN MÔN….. LỚP:……………. Thi kết thúc học phần • Hình thức thi: Trắc nghiệm • Bao gồm tất cả nội dung đã đƣợc học trong toàn bộ môn học và giáo trình liên quan. • Gồm 4 phần chính: Đại cƣơng nuôi cấy tế bào, PP nuôi cấy TB VSV, Thực vật, Động vật (Có câu hỏi tiếng Anh) 5/17/2013 5 ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT STT Nội dung Số tiết 1 Chương 1: Mở đầu 2 2 Chương 2: Sinh trưởng và bất động của tế bào 4 3 Chương 3: Động học sinh trưởng của tế bào 4 4 Chương 4: Thiết kế hệ lên men 4 5 Chương 5: Nuôi cấy tế bào vi sinh vật 4 6 Chương 6: Nuôi cấy tế bào động vật 4 7 Chương 7: Nuôi cấy tế bào thực vật 4 8 Báo cáo tiểu luận 4 Các giảng viên phụ trách môn học • ThS. Nguyễn Thành Luân (PP nuôi cấy TB VSV - 3 tuần đầu) • ThS. Phạm Văn Lộc (PP nuôi cấy TB thực vật - 2 tuần tiếp theo) • ThS. Lại Đình Biên (PP nuôi cấy TB động vật - 3 tuần cuối) CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU 5/17/2013 6 ĐẠI CƢƠNG VỀ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO • Khái niệm Công nghệ sinh học hiện đại • Lịch sƣ̉ hình thành Công nghệ tế bào • Các quá trình sinh học trong công nghệ tế bào • Tại sao lại là: Nuôi cấy tế bào? • Các ƣu và nhƣợc điểm của công nghệ tế bào Công nghệ sinh học hiện đại • “Công nghệ sinh học hiện đại là các quá trình sản xuất ở quy mô công nghiệp mà nhân tố tham gia trực tiếp và quyết định là các tế bào sống (vi sinh vật, thực vật và động vật). Mỗi tế bào sống của cơ thể sinh vật hoạt động trong lĩnh vực sản xuất này đƣợc xem nhƣ một lò phản ứng nhỏ”. Công nghệ sinh học hiện đại • Thuật ngữ “Công nghệ sinh học” thƣờng đƣợc sử dụng. Vậy CNSH là gì? • Những kỹ thuật mới nhƣ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant) và dung hợp tế bào (cell fusion), đƣợc xem là lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại. 5/17/2013 7 Câu hỏi • Hãy cho biết bản chất của phƣơng pháp DNA tái tổ hợp và dung hợp tế bào? • Các ứng dụng của 2 phƣơng pháp trên Nhu cầu của CNSH hiện đại • Các dƣợc phẩm: – Sản xuất Insulin để chữa bệnh đái tháo đƣờng – Sản xuất các Hormone sinh trƣởng ngƣời để điều trị bệnh còi của trẻ em – Các Interferon (IFNs) để chống viêm nhiễm, vaccine phòng bệnh và các kháng thể đơn dòng dùng để chẩn đoán QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐIỂN HÌNH 5/17/2013 8 Nhu cầu của CNSH hiện đại • Các con giống sạch bệnh hoặc khoẻ mạnh hơn, các vật nuôi dùng làm thực phẩm có sản lƣợng cao có thể đƣợc phát triển • Các loài cây trồng quan trọng đƣợc biến đổi di truyền để có các tính trạng chống chịu stress • Chống chịu chất diệt cỏ và kháng côn trùng • Phát triển các vi sinh vật đƣợc biến đổi di truyền (genetically modification organisms) Recombinant DNA (rDNA) - Cloning  Là những kỹ thuật cho phép thao tác trực tiếp nguyên liệu di truyền của các tế bào riêng biệt.  Có thể đƣợc sử dụng để phát triển các vi sinh vật sản xuất các sản phẩm mới cũng nhƣ các cơ thể hữu ích khác. 5/17/2013 9 Mục tiêu chính của công nghệ rDNA • Gắn một gen ngoại lai (foreign gene) mã hóa cho một sản phẩm mong muốn vào trong các dạng DNA mạch vòng (plasmid vector) của vi khuẩn • Chuyển gene vào trong một cơ thể vật chủ  gen ngoại lai có thể biểu hiện để sản xuất sản phẩm của nó từ cơ thể này. Dung nạp tế bào (cell fusion) Dung nạp tế bào • Là quá trình hình thành một tế bào lai đơn (single hybrid cell) với nhân và tế bào chất từ hai loại tế bào riêng biệt để tổ hợp các đặc điểm mong muốn của cả hai loại tế bào này. • Ứng dụng trong việc ứng dụng sản xuất tế bào lai trong sản xuất kháng thể đơn dòng, ghép mô tế bào,… 5/17/2013 10 Công nghê ̣ nuôi cấy tế bào • Các công nghệ DNA tái tổ hợp hoặc dung nạp tế bào đƣợc khởi đầu bởi những nghiên cứu thuần túy và các kết quả cuối cùng có thể phát triển thành một loại tế bào mới có thể sản xuất sản phẩm có ý nghĩa thƣơng mại  Đòi hỏi phải phát triển thành quy trình công nghiệp với một công nghệ khả thi và có hiệu quả kinh tế  Nhu cầu tìm hiểu các phƣơng pháp nuôi cấy tế bào tối ƣu nhất. Lịch sử hình thành Từ khi nào chúng ta đã biết có công nghệ nuôi cấy tế bào? Công nghệ nuôi cấy tế bào ngày nay khác với công nghệ nuôi cấy tế bào ngày xa xƣa nhƣ thế nào? Mục đích của nuôi cấy tế bào hiện đại? Lịch sử hình thành “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành“ hay “Tế bào là đơn vị sống căn bản của mọi cấu trúc sinh vật” (Schleiden và Schwann, 1838). 5/17/2013 11 Lịch sử hình thành Sydney Ringer (1836 – 1910), ngƣời Anh khám phá ra dung dịch Ringer’s Solution quyết định nồng độ ƣu trƣơng từ các loại muối gồm 6.5g NaCl, 0.42g KCl, 0.25g CaCl2 and 1 mole Natri bicarbonate Ứng dụng trong tất cả các thí nghiệm in vitro về các mô và cơ quan (cơ, tim của chim, cá, động vật có vú..) Lịch sử hình thành Vào năm 1885, Roux chuyển 1 mẫu đĩa môi trƣờng nuôi cấy tế bào thần kinh of 1 phôi tế bào gà và duy trì trong 1 môi trƣờng muối saline, mở đầu cho việc phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào. Wilhelm Roux (1850 – 1924) ngƣời Đức Lịch sử hình thành • Từ 1907–1910, sáng chế ra mô tế bào nhân tạo từ tế bào thần kinh ếch trong môi trƣờng chứa lymphocytes Ross Granville Harrison (Mỹ) (1870 – 1959) 5/17/2013 12 Lịch sử hình thành • Đến năm 1960, Melcher và Bergman là những tác giả đầu tiên tách và nuôi cấy thành công tế bào đơn của thực vật trong các bình lên men ở môi trƣờng nhân tạo. Mục đích tìm hiểu • Các chất xúc tác sinh học và tế bào đƣợc chọn lọc hoặc sửa đổi di truyền phải thích hợp cho các hoạt động sản xuất • Phù hợp với mô hình sản xuất quy mô công nghiệp ứng dụng • Tìm hiểu các phƣơng pháp tối ƣu nhất cho nhu cầu thu nhận sinh khối 1 sản phẩm thƣơng mại Các quá trình sinh học (Bio-processing) – Phải thu đƣợc các chất xúc tác sinh học tốt nhất (vi sinh vật, tế bào động vật, tế bào thực vật,hoặc enzyme) – Tạo ra môi trƣờng tốt nhất có thể cho sự xúc tác bằng cách thiết kế các bioreactor/fermenter thích hợp với phƣơng thức tối ƣu nhất. – Phân tách các sản phẩm mong muốn từ hỗn hợp phản ứng trong một phƣơng thức kinh tế nhất. NHẮC LẠI 5/17/2013 13 Bio-prossessing Kỹ thuật tạo dòng tế bào Bể phản ứng sinh học 5/17/2013 14 Bể phản ứng sinh học Theo anh/chị, bể phản ứng sinh học là gì? Nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào là chọn lọc các tế bào ở giai đoạn phát triển tối ƣu nhất trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của tế bào sinh vật sống gồm 4 giai đoạn là: thích nghi, tăng trƣởng, cân bằng và suy tàn. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào • Điểm khác biệt giữa phƣơng pháp nuôi cấy tế bào đơn thực vật và động vật, VSV ở: – Mức độ vô trùng – Tồn tại dƣới dạng huyền phù – Tốc độ phân chia  sinh khối – Phƣơng thức sinh dƣỡng – Các chất đƣợc tạo ra trong quá trình trao đổi chất – Cấu trúc cơ thể sinh vật 5/17/2013 15 Các dạng nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào vi sinh vật  Nuôi cấy tế bào vi khuẩn  Nuôi cấy virus và các bacteriophage  Nuôi cấy tế bào VSV eukaryotes: nấm men, nấm mốc, tảo (algae), ĐV nguyên sinh (metazoa) Sơ lược về lịch sử phát hiện và giới thiệu kháng sinh penicillin Phát hiện tình cờ vào năm 1928 do A. Fleming Kháng sinh penicillin 5/17/2013 16 Penicillin chrysogenum • Thuộc họ hiếu khí bắt buộc, • Là loại nấm sợi bào tử hở. • Khi mới phát hiện trong môi trường đặc, chúng tạo ra hai dạng khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty dinh dưỡng màu trắng Dựa vào tính chất của canh trường Nuôi cấy chìm Nuôi bề mặt 5/17/2013 17 Hiệu quả kinh tế • Với nguồn cơ chất chính là glucoza và lên men theo phương pháp chìm • Nồng độ penicillin G trong dịch lên men những năm 80 - 90 của thế kỷXX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng năng suất khoảng 40 - 50 kg penicillin G/m3 dịch lên men ). Nuôi cấy tế bào thực vật  Nuôi cấy mô tế bào thực vật khởi nguồn từ sự tách chiết các nhóm mô từ rễ, lá, mầm (explant culture) thành các mô sẹo (callus) trên môi trƣờng dinh dƣỡng in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi trường nhân tạo được kiểm soát. 5/17/2013 18 Nuôi cấy hoa lan Mokara Hình . Lan Mokara đỏ  Lan Mokara là một loài hoa đẹp có giá trị kinh tế cao.  Mokara có hoa nhiều màu sắc được rất nhiều người ưa thích & là loại hoa có lượng tiêu thụ lớn trên thị trường. Nuôi cấy tế bào côn trùng • Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) – Nghiên cứu phản ứng sinh hóa học – siRNA (RNA thầm lặng) • Các loài ấu trùng của bƣớm, châu chấu và sâu − Recombinat protein  Xác định các nhóm RNA hoặc DNA khó xác định ở các nhóm sinh vật bậc cao Nuôi cấy tế bào động vật • Đa dạng: – Nuôi cấy tế bào gốc – Sản xuất vaccine – Biệt hóa dòng tế bào động vật – Hoạt chất chống ung thƣ – Kháng thể đơn dòng – …….  Ứng dụng các thử nghiệm thành công trên ngƣời phục vụ cho mục đích y học 5/17/2013 19 Công nghệ tế bào gốc (stem cell) Sản phẩm của quá trình sinh học • Sản phẩm biến dƣỡng của sinh vật • Sản phẩm sơ cấp: carbohydrate, acid béo (fatty acid), amino acid,… • Sản phẩm thứ cấp: alkaloid, nicotine, berberin, ginsenosid, palitaxel, bacteriocin, … • Sản phẩm thứ cấp giúp đáp ứng stress, phòng vệ chống vi sinh vật, côn trùng,… Ứng dụng trong tách chiết hợp chất sinh học thứ cấp • Hợp chất ginsenosid từ cây Nhân sâm (Panax ginseng): – Tác dụng đến hệ thần kinh trung ƣơng – Gia tăng sức đề kháng – Tăng cƣờng co bóp cơ tim – Hạ đƣờng huyết 5/17/2013 20 Saponin • Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nƣớc, có tác dụng nhũ hóa và tẩy sạch. • Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng. • Độc với cá và động vật máu lạnh; có tác dụng diệt những loài thân mềm nhƣ giun, sán, ốc sên. • Kích ứng niêm mạc, gây hắt hơi, đỏ mắt. • Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-ß-hydroxysteroid khác Ứng dụng nuôi cấy TB trong y dƣợc • Bao gồm: – Sản xuất các hoạt chất nhƣ Diosgenin, Codeine, Morphine, Atropine, Hyoscy- amine, Scopolamine, Digoxin, Digitoxin, Quinine, Reserpine, Artemisinin – Vaccine – Hormone tăng trƣởng/kích thích – Kháng thể đơn dòng – Tế bào gốc trong cấy ghép mô/tế bào Chọn lọc phƣơng pháp làm tăng sản lƣợng • Điều kiện môi trƣờng thích hợp • Chọn lựa chủng có năng suất cao • Biến đổi tiền chất • Xử lý với các chất cảm ứng • Cố định tế bào • Tiết sản phẩm ra môi trƣờng • Gây đột biến tế bào • Phát sinh hình thái 5/17/2013 21 Cố định tế bào • Một hệ thống cố định có thể duy trì sự sống của tế bào qua một khoảng thời gian dài và phóng thích phần lớn sản phẩm ra môi trƣờng ngoại bào ở dạng ổn định: • Sự cố định thƣờng bị hạn chế • Sinh khối ban đầu phải đƣợc nuôi cấy dạng huyền phù tế bào • Sản phẩm bắt buộc tiết ra môi trƣờng • Sản phẩm bị thoái biến • Ngăn cản sự khuếch tán của tế bào Tiết sản phẩm ra môi trƣờng • Có thể làm tăng khả năng sản xuất những hợp chất thứ cấp bằng cách kích thích cho tế bào tiết chúng ra ngoài môi trƣờng. • Để làm tăng sự tiết sản phẩm ra môi trƣờng, ngƣời ta cố gắng làm tăng tính thấm của màng tế bào nhƣng kết quả đạt đƣợc vẫn rất hạn chế. Gây đột biến tế bào • Các dạng đột biến điều hòa và đột biến khuyết dƣỡng đƣợc sử dụng rộng rãi để sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm nhƣ amino acid, nucleotide, kháng sinh,… • Sự gia tăng hoạt động biến dƣỡng bằng cách sử dụng các đột biến điều hòa có thể thực hiện • Việc chọn lọc các kiểu tế bào đồng dạng cho mục đích nuôi cấy là một yếu tố quan trọng để sản xuất ra các loại sản phẩm 5/17/2013 22 Phát sinh hình thái Nuôi cấy lông rễ (chuyển plasmid Ri vào vết thƣơng trên mô) Chọn lọc môi trƣờng thích hơp • Điều kiện môi trƣờng thích hợp – Thành phần các chất trong môi trƣờng nuôi cấy, chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, pH, nhiệt độ, độ thông khí, độ lay chuyển, ánh sáng,… Ví dụ: Auxin thƣờng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng để cảm ứng sự tạo mô sẹo, và nó sẽ đƣợc giữ lại với một hàm lƣợng rất thấp hoặc loại bỏ hẳn để tế bào sản xuất các chất biến dƣỡng Các lƣu ý trong sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy tế bào • Không nên nuôi cấy tế bào một cách đại trà mà không tính toán đến khả năng tạo ra những sản phẩm đặc biệt của loài đó. • Không phải tất cả các cơ quan đều có khả năng tạo ra chất mà ta quan tâm. • Trong quá trình nuôi cấy, luôn luôn phải tiến hành tuyển chọn để nâng cao năng suất tạo ra các sản phẩm bậc 2. • Bổ sung cơ chất tƣơng ứng. • Tìm ra môi trƣờng đặc hiệu cho từng loại tế bào 5/17/2013 23 Các ƣu điểm • Điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, ôn hòa: quá trình sinh học ít ảnh hƣởng so với quá trình hóa học • Tính đặc hiệu: 1 enzyme chỉ 1 hoặc 2 cơ chất xúc tác • Tính hiệu lực: enzyme xúc tác nhanh, mạnh so với chất xúc tác khác • Các tài nguyên có thể đổi mới • Công nghệ DNA tái tổ hợp: hỗ trợ việc chọn lọc dòng/giống Các ƣu điểm • Điều kiện nuôi cấy có thể đƣợc kiểm soát và có thể đƣợc tối ƣu cho việc sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. • Tế bào có thể đƣợc chọn lọc và cải thiện bằng cách nhân dòng in vitro • Có thể dễ dàng nghiên cứu chuyển hóa các chất trong tế bào và cơ chế sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Các nhƣợc điểm • Các hỗn hợp sản phẩm phức tạp: xác định khó khăn và khó tách chiết • Các môi trƣờng nƣớc loãng: nhỏ và đắt tiền • Sự nhiễm bẩn: dễ bị lấn át bởi các VSV ký sinh /cộng sinh. • Khuynh hƣớng hay biến đổi: do môi trƣờng hay đột biến 5/17/2013 24 KẾT THÚC CHƢƠNG I THANK YOU FOR YOUR ATTENTION!