Bài giảng Các phương pháp tách chiết axit cucleic, định tính và định lượng

Mọi nghiên cứu và ứng dụng của sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc chiết xuất và tinh sạch một lượng đủ lớn DNA hoặc RNA. Yêu cầu của chiết xuất và tinh sạch là: - Có được đủ một lượng axit nucleic mong muốn, còn nguyên vẹn. - Không bị phân huỷ, bị gãy bởi tác động cơ giới, hoặc bị phân giải bởi một số enzyme nội, ngoại bào và hoá chất. - Không hoặc ít lẫn tạp protein, RNA và một số đại phân tử khác như lipid, gluxit và các xác tế bào khác.

doc32 trang | Chia sẻ: haohao89 | Lượt xem: 11309 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Bài giảng Các phương pháp tách chiết axit cucleic, định tính và định lượng, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
CHƯƠNG X CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT AXIT NUCLEIC – ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG I. Các phương pháp tách chiết axit nucleic Mọi nghiên cứu và ứng dụng của sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc chiết xuất và tinh sạch một lượng đủ lớn DNA hoặc RNA. Yêu cầu của chiết xuất và tinh sạch là: Có được đủ một lượng axit nucleic mong muốn, còn nguyên vẹn. Không bị phân huỷ, bị gãy bởi tác động cơ giới, hoặc bị phân giải bởi một số enzyme nội, ngoại bào và hoá chất. Không hoặc ít lẫn tạp protein, RNA và một số đại phân tử khác như lipid, gluxit và các xác tế bào khác. 1. Phương pháp tách chiết DNA Vì DNA là đại phân tử có kích thước lớn, đối với sinh vật tiền nhân thường nằm ở nhiễm sắc thể vòng gồm chứa DNA cấu trúc với protein, ngoài ra ở một số sinh vật tiền nhân còn có thêm DNA phụ nằm trong các thể plasmid. Đối với sinh vật nhân thật DNA phần lớn nằm trong nhiễm sắc thể, trong nhân tế bào, một lượng nhỏ nằm ở trong ty thể và lạp thể. Để đảm bảo tách chiết được DNA đáp ứng các yêu cầu trên thì cần gồm các bước cơ bản sau đây: a. Lấy mẫu để chiết tách DNA Yêu cầu : - Lấy đúng mẫu cần phân tích, lượng mẫu cần nhỏ nhưng lại yêu cầu phải thu được nhiều DNA, thường dùng mô non, nơi tế bào đang phân chia mạnh sẽ có nhiều nhân/ đơn vị thể tích hơn. - Mẫu phải sạch, không bẩn hay bị nhiễm sâu, bệnh. - Bộ phận lấy mẫu, tùy từng sinh vật, nhưng không nên lấy mẫu là các cơ quan dự trữ cã nhiÒu protein, gluxit hoặc lipid vì khi chiết xuất phải tốn công loại bỏ các tạp chất này. Chọn mô nào chứa các tế bào có nhân to, vỏ tế bào mỏng còn non. §èi víi thùc vËt thường lấy lá mô non, lấy vào buổi sáng, tốt nhất trước khi lấy nên che nắng vài ngày. - Mẫu lấy xong cần phải hạn chế ngay hoạt động của các enzyme DNase bằng cách làm lạnh bỏ ngay vào đá lạnh. b. Phá vỡ thành tế bào và nhân Nghiền tế bào (đối với sinh vật đa bào) trong nitơ lỏng hoặc đá lạnh với dung dịch chiết xuất gồm các thành phần như sau: Muối NaCl, Tris-HCl [Tris(hydroxylmethyl) amino methane], EDTA (ethylendiamine tetra acetic acid), SDS (sodium dodecyl sulphate), proteinase K, để phá vỡ màng tế bào và nhân, giải phóng ra DNA. Nhiệt độ lạnh và các hoá chất có tác dụng: - Nhiệt độ lạnh và EDTA làm giảm tối thiểu hoạt tính của men phân giải DNA (DNase). - SDS và proteinase K khi phối hợp với nhau sẽ có tác dụng phân giải và làm biến tính protein liên kết với DNA. Khi SDS bọc lấy protein sẽ làm gẫy tất cả các liên kết không cộng hoá trị. Mecaptoethanol có tác dụng phá vỡ các liên kết disulfide giữa các subunit protein. - NaCl và Tris-HCl có tác dụng tẩy rửa carbohydrate, lipid và tinh bột. c. Hoà tan DNA và loại bỏ các tạp chất - Thành phần trong mẫu DNA khi chiết xuất thường chứa cả protein, RNA, carbohydrate và lipid, do vậy cần phải loại bỏ các tạp chất này ra khỏi dung dịch DNA. Hiện nay người ta thường dùng một số hợp chất để loại bỏ các tạp chất trên như sau: - Dùng phenol/chloroform/isoamyl với tỷ lệ tương ứng là: 25:24:1 để chiết tách DNA và kết tủa các protein, RNA, carbohydrate và lipid. Sau ly tâm sẽ thu được phần dung dịch nước phía trên ống nghiệm chứa DNA hòa tan. Phần kết tủa nằm phía dưới đáy ống nghiệm là các tạp chất lẫn. d. Kết tủa DNA Mục đích của kết tủa là nhằm thu được DNA ở dạng cô đặc, và bảo vệ chúng không bị phân hủy bởi các enzyme DNase và khi cần thì lại hòa tan chúng theo nồng độ tùy ý. Để kết tủa DNA chúng ta có thể dùng 2 hóa chất đó là: - Kết tủa bằng Ethanol lạnh nồng độ 100% với lượng dư thừa từ 2,0 - 2,5 lần thể tích, nhằm kết tủa hoàn toàn DNA, lúc này có thể nhìn thấy DNA kết tủa dưới dạng vẩn đục nhờ. Ethanol còn có tác dụng loại bỏ ra một số muối (trừ NaCl) và nhiều phần tử hữu cơ nhỏ khác. Ngoài ra khi kết tủa bằng ethanol nếu kết hợp với amonium acetate còn có tác dụng loại bỏ những oligonuleotitde (sợi đơn, kép dài <30bp) và những nucleotit tự do khác. - Kết tủa bằng Isopropanol với lượng cho vào bằng với lượng dung dịch mẫu. Phương pháp này có nhược điểm là khó loại trừ được một số muối khó hòa tan trong isopropanol, nên các muối này thường kết tủa cùng với DNA, do vậy cần phải rửa thêm nhiều lần để loại bỏ hết các muối còn lẫn tạp. - Sau bước kết tủa là đến bước ly tâm ta sẽ thu được DNA cô đặc (pellet), sau đó rửa pellet nhiều lần bằng 70% ethanol, làm khô tự nhiên để bay hơi hết ethanol, rồi hòa tan DNA pellet bằng dung dịch TE (thành phần gồm 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1mM EDTA, pH 8.0), cuối cùng bảo quản trong tủ lạnh – 40C hoặc -200C hàng năm. 2. Quy trình chiết tách DNA a. Chiết tách DNA từ genome mô động vật có vú Vật liệu: Nitơ lỏng (liquid nitrogen), dung dịch phân giải (digestion buffer), Ice-cold phosphate-buffer saline. với tỷ lệ 3 hợp chất trên như sau: 25:24:1 (Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol), 7,5M Amonium acetate, 100% và 70% Ethanol, TE Buffer pH 8.0, SDS 0.1%, 1mg/ml DNase-free RNase. Chuẩn bị tế bào Cắt càng nhanh càng tốt lấy mẫu mô động vật bỏ vào ống nghiệm, đặt ngay vào nitơ lỏng. Trường hợp nếu lấy mô gan thì phải bỏ mật ra vì mật chứa nhiều enzym phân rã DNA. Lấy từ 200 mg đến 1 g mô, nghiền trong cối và chày đã được làm lạnh trước trong nitơ lỏng. Hòa tan cứ 100 mg mô nghiền thành bột trên với 1,2 ml dung dịch phân giải. Vừa ủ mẫu và vừa lắc nhẹ ở nhiệt độ 500C từ 12 – 18h, nhớ đậy chặt ống nghiệm, bước này nhằm phá hủy và phân rã màng tế bào. Chiết xuất DNA bằng cách thêm vào mẫu một lượng thể tích tương đương hỗn hợp Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol. Ly tâm trong vòng 10 phút với tốc độ vòng quay là 1700 x g. Tinh lọc DNA, chuyển lớp dung dịch phía trên (chứa DNA) sang ống nghiệm mới, rồi thêm dung dịch 7,5 M amonium acetate với lượng bằng 1/2 dung tích mẫu và 2 lần thể tích ban đầu 100% ethanol. Ngay sau đó DNA sẽ kết tủa. Thu nhận DNA kết tủa bằng cách quay ly tâm với tốc độ 1700 x g trong 2 phút. Khâu này nếu nồng độ muối trong mẫu cao sẽ làm giảm lượng RNA trong dung dịch DNA. Để bảo quản lâu dài cần ngâm DNA cô đặc trong ethanol để tránh làm gẫy DNA đồng thời không nên tiến hành tinh chiết tiếp thªm từ bước 7 – 9 nữa. Rửa pellet bằng cồn 70%, để bay hơi làm khô ethanol cần đặt ống nghiệm trong bình hút chân không hoặc úp ngược ống nghiệm để khô tự nhiên trong phòng. Hòa tan DNA trong TE bufer, có thể lắc nhẹ ở nhiệt độ trong phòng hoặc ở nhiệt độ 65 0C trong vài giờ. Bảo quản ở nhiệt độ 40C, pha nồng độ để có khoảng 1mg/ml DNA, nồng độ này được sử dụng trong nhiều nghiên cứu. Như vậy, cứ 1 g mô mẫu động vật chúng ta có thể chiết xuất được khoảng 2mg DNA. Thành phần dung dịch phân giải chứa: 100mg NaCl, 10mM Tris-HCl pH 8,0, 25mM EDTA pH 8,0, 0,5%SDS, 0,1mg/ml proteinase K. Chú ý proteinase K dễ bị biến tính nên cần pha mới trước mỗi lần dùng. b. Chiết xuất DNA từ genome mô thực vật Tế bào thực vật thường bị phá vỡ bởi chất tẩy rửa sarkosyl, sau đó phân giải bằng proteinase K. Sau khi loại bỏ hết cặn bã không hòa tan, DNA được kết tủa và tinh sạch bằng CsCl gradient. Hóa chất cần: Nước cất lạnh; nitơ lỏng, dung dịch chiết xuất, 10% (wt/vol) N-Lauryl sarkosyl, Isopropanol, dung dịch TE, Cesium Chloride, 10mg/ml Ethidium Bromide, CsCl-Saturated isopropanol, ethanol, 3M Sodium acetate pH 5.2, ống nghiệm 5ml, chày cối khử trùng. Gồm các bước * Chuẩn bị mô thực vật Thu lấy từ 10-50 g mô cây tươi, cây nên trồng trong tối 1-2 ngày trước khi lấy mẫu để giảm hàm lượng tinh bột trong mô, nên dùng cây non vì có hàm lượng polysacharide thấp. Rửa mô bằng nước lạnh vô trùng để loại bỏ bụi bẩn rồi thấm khô. Bỏ vào cối, đổ dung dịch nitơ lỏng vào rồi nghiền kỹ thành bột bằng chầy, chú ý giữ mô luôn trong trạng thái băng lạnh, bằng cách thường xuyên đổ thêm nitơ lỏng vào trong khi nghiền. * Phá vỡ và phân giải tế bào Chuyển bột nghiền đông lạnh vào ống li tâm dung tích 250ml, ngay lập tức đổ dung dịch chiết xuất vào với lượng cứ 5-10ml dung dịch chiết xuất đổ vào 1g mẫu cây tươi rồi khuấy trộn đều. Thêm lượng xấp xỉ dung dịch 10% (wt/vol) Sarkosyl để có được nồng độ cuối cùng là 1% vào mẫu. Chú ý cần đổ sarkosyl vào mẫu sau khi đã trộn đều với dung dịch chiết xuất, nếu cho cùng với dung dịch chiết sẽ làm gãy DNA. Ủ ở nhiệt độ 550C trong 1- 2h, chú ý từ bước này cần thao tác nhẹ nhàng để tránh làm gãy DNA, không được voltex và ly tâm mạnh. Ly tâm mẫu trong 10 phút với tốc độ 5500 x g vòng phút ở nhiệt độ 40C để kết tủa toàn bộ lắng cặn bã, hút lấy phần dung dịch DNA phía trên ống nghiệm, chuyển sang ống nghiệm khác rồi ly tâm tiếp nếu cần thiết để loại bỏ hết xác cặn bã không tan. * Kết tủa DNA Thêm vào 0,6 thể tích Isopropanol vào dung dịch DNA, trộn nhẹ, axit nucleic kết tủa lóc nµy có thể nhìn thấy, nếu chưa thấy kết tủa thì đặt vào tủ -200C trong 30 phút. Ly tâm 15 phút với tốc độ 8000 vòng phút (7500 x g) ở nhiệt độ 40C. Sau đó đổ bỏ phần trên , không được để kết tủa axit nucleic khô, nếu để khô thì khó hòa tan. * Tinh sạch DNA Hòa tan pellet với 9 ml dung dịch TE, ủ nhiệt độ 550C để hòa tan tiếp nếu cần, thêm 9,7g CsCl đặc rồi trộn nhẹ đến khi hòa tan xong. Ủ mẫu trong đá 30 phút, ly tâm 10 phút với tốc độ 8000rpm ở nhiệt độ 40C, rồi thu lấy phần dung dịch phía trên. Sau li tâm có thể có 1 lớp tồn dư sarkosyl trên bề mặt dung dịch, có thể bỏ đi bằng cách lọc dung dịch phía trên qua 2 lớp Cheesecloth. Thêm 0,5ml dung dịch 10mg/ml ethidium bromide vào rồi ủ trong đá 30 phút. Chú ý ethidium bromide là tác nhân gây đột biến, cần đeo găng tay khi tiếp xúc. Ly tâm với tốc độ 8000 vòng phút ở nhiệt độ 40C trong 10 phút. Bước này có tác dụng làm kết tủa RNA, protein và carbohydrate. Chuyển dung dịch phía trên sang 2 ống nghiệm dung tích 5 ml có thể ly tâm và bịt miệng được. Nhớ rằng 2 ống nghiệm cần được đổ đầy, với lượng bằng nhau rồi bịt kín miệng lại. Ly tâm trong 4 tiếng với tốc độ 80.000 vòng phút ở 20 0C hoặc ly tâm qua đêm với tốc độ 60.000 vòng phút ở nhiệt độ 20 0C. Thu nhận băng DNA, có thể sử dụng kim tiêm xi lanh lớn 15G, tạo một lỗ ở nắp ống nghiệm, sau đó đưa kim tiêm xi lanh vào qua thành ống nghiệm trực tiếp ngay sau dưới vệt băng. Nếu chỉ có một vệt băng xuất hiện thì có thể nhìn thấy qua đèn UV. Loại bỏ ethidium bromide bằng cách chiết tách lặp lại mẫu DNA thu được với isopropanol. Thêm 2 thể tích nước và 6 thể tích ethanol vào dung dịch chứa DNA, trộn đều rồi ủ 1 h ở nhiệt độ – 200C. Ly tâm 10 phút với tốc độ 8000 vòng phút ở nhiệt độ 40C. Hoà tan kết tủa pellet trong dung dịch TE và kết tủa lại bằng cách đổ 1/10 thể tích dung dịch 3M sodium acetate và 2 phần thể tích ethanol. Nếu chưa nhìn thấy kết tủa thì ủ lại tại nhiệt độ – 200C đến khi có kết tủa thu được. Làm khô pellet, hoà tan trong TE. Dung dịch chiết tách gồm: 100 mM Tris-Cl, pH 8,0; 100 mM EDTA; 250 mM NaCl và 100 mg/ml proteinase K. Trên đây là 2 phương pháp tách chiết DNA từ động vật và thực vật tiêu biểu. Tuy nhiên, tuỳ từng đối tượng và mục đích sử dụng DNA khác nhau mà có các phương pháp tách chiết DNA khác nhau đang được cải tiến ứng dụng. II. Phương pháp tách chiết RNA toàn phần và mRNA 1. Nguyên tắc của việc chiết tách RNA - Cần phải được nhiều RNA, sạch, toàn phần không bị gãy mới có ý nghĩa trong quá trình nhân gen và nghiên cứu biểu hiện của gen. Muốn vậy cần phải làm bất hoạt enzyme endonuclease như RNase và ngăn cản sự xâm nhập của enzyme RNase từ bên ngoài vào. - Điều khó khăn là phần lớn các RNA ®Òu không bền, dễ bị phân huỷ bởi các enzyme ribonuclease, vì thế bước đầu tiên của quy trình chiết tách là phân rã tế bào trong môi trường hoá học có khả năng làm biến tính RNase. - Các enzyme này lại rất bền vững và hoạt động mạnh không cần có sự tham gia của yếu tố cộng nhân tố, thậm chí nhiều khi xử lý ở nhiệt độ 900C trong một giờ vẫn không làm bất hoạt được men này. Chúng tồn tại ở khắp nơi, ở rất nhiều trên đầu ngón tay, chính vì thế mọi dụng cụ đều phải dùng mới hoặc sử dụng một lần. - - Khi thao tác phải đeo găng tay, khẩu trang, các dung dịch, nước hoặc muối khi sử dụng để chiết xuất RNA đều phải xử lý bằng hoá chất Diethylpysocarbonate (DEPC), hoá chất này làm bất hoạt men RNase bằng cách làm biến đổi liên kết cộng hoá trị phosphodiester. - Tất cả các dung dịch dùng để chiết xuất RNA tuyệt đối không được lẫn tạp RNase, muốn thế thì tất cả các dung dịch trừ dung dịch TES vì chứa Tris-Cl chất này làm bất hoạt DEPC, sau khi thêm dung dịch Guanidium đều phải được xử lý DEPC. 2. Các bước chiết xuất cơ bản - Tế bào, mô (nơi có gen mục tiêu hoạt động) được lấy mẫu và nghiền trong dung dịch có chứa các chất tẩy mạnh như SDS và Sarkosyl ở nồng độ cao kết hợp với 2 tác nhân gây biến tính protein mạnh và hiệu quả là: Guanidinium thiocyanate và 2 mercaptoethanol, 2 chất này có tác dụng ức chế hoạt động của các RNase nội bào và tách các protein liên kết ra khỏi RNA. - Loại bỏ các protein ra khỏi mẫu bằng cách xử lý Phenol:Chloroform rồi quay li tâm, để kết tủa protein và cặn bã còn nucleic axit sẽ hòa tan ở phần trên. - Kết tủa nucleic axit (RNA và DNA) bằng thêm lượng ethanol dư thừa. Tách DNA ra khỏi RNA nếu cần thiết, trong nhiều trường hợp không cần thiết tách, bằng cách dùng 8M LiCl với lượng thêm vào bằng 1/2 thể tích của mẫu để có nồng độ làm việc của LiCl là 2M, để kết tủa qua đêm ở nhiệt độ 40C. - Như chúng ta đã biết, có 3 loại RNA nồng độ mỗi loại khác nhau tùy theo từng tế bào, mô và giai đoạn sinh trưởng phát triển. Nhìn chung, rRNA chiếm 80-85%, tRNA từ 15-20%, hai loại này có kích thước và trình tự xác định đặc biệt tRNA nhỏ, có thể tách riêng ra một cách dễ dàng bằng li tâm hoặc điện di. Vì mục đích chiết tách RNA chủ yếu là chiết tách được nhiều và được nguyên vẹn mRNA, loại này chỉ chiếm từ 1-5% tổng RNA. Tất nhiên, hàm lượng này còn phụ thuộc vào mô tế bào. Đặc điểm của mRNA ở sinh vật nhân thật phần lớn đều có đầu 3’ đính poly A, tuỳ mRNA có thể lên tới 100A. Dựa vào đặc tính này và đặc tính liên kết bổ sung A=T của nucleic axit người ta có thể tách riêng mRNA ra khỏi hỗn hợp RNA tổng số bằng phương pháp sắc ký ái lực trên cột oligo dT cellulose. Hiện nay, trên thương trường người ta bán những bộ KIT, thay bằng cột oligo dT là các viên bi từ có mang oligo dT trên bề mặt. Đổ các viên bi này vào dung dịch RNA tổng số, sau đó các viên bi này được thu nhận lại và rửa bằng môi trường pH kiềm thì các mRNA sẽ được tách rời ra. Nhờ kỹ thuật này đã cho phép chúng ta thu được chỉ mRNA từ những mẫu, mô tế bào nhỏ. + Sau khi có mRNA thì bước tiếp là phải tinh sạch bằng phương pháp kết tủa, điện di hay sắc ký. Cuối cùng là định tính và định lượng mRNA. 3. Phương pháp phenol/SDS chiết xuất RNA thực vật a. Quy trình chiết tách Gồm 2 công đoạn: 1/ Phân rã tế bào và loại bỏ protein bằng phương pháp chiết xuất Phenol/SDS 2/ Tách RNA khỏi DNA và tạp chất bằng cách kết tủa có chọn lọc sử dụng LiCl b. Hóa chất dụng cụ Diethylpyrocarbonate (DEPC), nitơ lỏng, dung dịch nghiền mẫu (grinding buffer), phenol hòa tan với dung dịch TLE, chloroform 8M và 2M LiCl, 3M sodium acetate, 100% ethanol, máy polytron (Prinkmann PT10/35) máy li tâm Beckman JA-10, JA-20 và JA-14rotor, ống nghiệm Oakridge 50ml, ống nghiệm Sarstedt. Sodium acetate, nước, và dung dịch LiCl cần phải xử lý với DEPC để loại trừ hoạt tính của enzym RNase. DEPC là một chất có khả năng gây ung thư cần chú ý khi tiếp xúc. c. Nghiền mô và chiết tách protein 1. Làm lạnh cối, chày bằng cách đổ một ít nitơ lỏng vào. 2. Cân 15 gam mô thực vật đựng trong tủ đá lạnh, nếu dùng mẫu tươi thì sau khi thu cần bỏ ngay vào nitơ lỏng, làm càng nhanh càng tốt. 3. Nghiền mô cây trong cối để tạo thành bột mịn, trong quá trình nghiền thường xuyên đổ thêm nitơ lỏng vào và nghiền tiếp. 4. Ngay sau đó chuyển sang một cốc mỏ vịt có dung tích 500ml đang chứa 150ml dung dịch nghiền mẫu, thêm 500ml TLE và phenol lượng tương đương. 5. Nghiền hỗn hợp bằng máy polytron trong 2 phút với tốc độ vừa phải (chỉnh ở tốc độ từ 5-6) 6. Thêm 50ml Chloroform, dùng máy nghiền polytron với tốc độ thấp nhằm trộn đều Chloroform mới thêm vào với mẫu. Chú ý không cần thiết phải thêm Isoamyl alcohol vào với Chloroform ở các bước chiết xuất tiếp theo. 7. Đổ mẫu vào lọ li tâm Nalgene có dung tích 500ml rồi đun nóng ở nhiệt độ 500C trong 20 phút. Tất cả các công đoạn chiết tách có liên quan đến TLE-Phenol và Chloroform đều cần phải được tiến hành trong những ống nghiệm có khả năng đậy được nắp và chịu được những hóa chất này. 8. Li tâm hỗn hợp mẫu với tốc độ 10.000 vòng/phút tương đương với 17700xg trên máy JA-10 rotor trong 20 phút ở 40C. 9. Hút lấy càng nhiều càng tốt lớp dung dịch phía trên. Chú ý tránh làm vỡ lớp màng ngăn cách rồi chuyển nó sang lọ Nalgene dung tích 500ml. Đổ thêm 50ml TLE-equilibrated phenol vào, lắc lọ để trộn đều phenol với dung dịch sau đó thêm 50ml Chloroform. 10. Lấy lớp dung dịch còn lại cùng với bề mặt phân cách từ phần chiết tách phenol ban đầu rồi chuyển sang ống nghiệm Oakridge dung tích 50ml. Li tâm trong 20 phút với tốc độ 10.000 vòng phút ở nhiệt độ 40C trên máy JA-20 rotor. 11. Lấy lớp dung dịch phía trên và kết hợp với phần dung dịch đã được phân tách ở bước 9. Bước 10 và 11 tiến hành nhằm mục đích thu được thể tích lớn nhất của dung dịch mẫu mà khó tách khỏi giữa bề mặt phân cắt ở lọ 500ml. 12. Lắc mạnh lọ dung tích 500ml chứa lớp dung dịch kết hợp nhằm trộn đều TLE-equilibrated phenol và chloroform với lớp dung dịch. Sau đó li tâm hỗn hợp trên 15 phút với tốc độ 10.000 vòng phút ở 40C trên máy JA-10 rotor rồi thu lấy lớp dung dịch rồi chuyển vào lọ dung tích 500ml khác. 13. Tiếp tục chiết xuất phần dung dịch với TLE-equilibrated phenol và chloroform cho đến tận khi không còn lớp ngăn cách giữa 2 trạng thái dung dịch (thường phải làm như vậy 3 lần). 14. Chiết tách phần dung dịch lần cuối cùng với chloroform. Bước này nhằm loại bỏ những vệt TLE-equilibrated phenol lẫn trong lớp dung dịch, nếu còn lẫn có thể sẽ gây lên những khó khăn khi kết tủa bằng LiCl. Thu nhận kết tủa RNA, bước này nhằm loại bỏ DNA ra khỏi RNA. Trong trường hợp không cần loại bỏ DNA thí dụ khi muốn chiết tách mRNA có đuôi poly A thì chỉ cần kết tủa đơn giản bằng Ethanol là đủ. 15. Chuyển lớp dung dịch lỏng sang lọ Nalgene dung tích 250ml, sau đó thêm dung dịch 8M LiCl với lượng bằng 1/2 thể tích mẫu để có được dung dịch mẫu có nồng độ làm việc là 2M LiCl. Kết tủa qua đêm ở nhiệt độ 40C. 16. Thu phần kết tủa bằng li tâm trong 20 phút với tốc độ 10.000 vòng phút (15300xg) ở nhiệt độ 40C trên máy JA-14 rotor. Rửa pellet với dung dịch 2M LiCl 17. Hòa tan pellet trong 5ml nước rồi chuyển sang ống nghiệm Sarstedt dung tích 15ml. Thêm dung dịch 8M LiCl với lượng đủ để được nồng độ LiCl trong mẫu là 2M rồi kết tủa RNA ở nhiệt độ 40C trong thời gian ít nhất 2h. 18. Thu nhận RNA bằng cách li tâm trong 20 phút tốc độ 10.000 vòng phút (12100xg) ở nhiệt độ 40C trên máy JA-20 rotor, tiếp tục rửa pellet bằng 2M LiCl. 19. Hòa tan RNA pellet trong 2ml nước, rồi thêm 200ml dung dịch 3M Sodium acetate và 5,5 ml dung dịch 100% Ethanol để kết tủa RNA ở nhiệt độ -200C qua đêm hoặc trong đá khô hay Ethanol khô trong thời gian 30 phút. RNA có thể được bảo quản trong Ethanol ở nhiệt độ -200C hoặc -700C. 20. Phục hồi RNA bằng cách li tâm 15 phút với tốc độ 10.000 vòng phút (17700xg) ở nhiệt độ 40C trên máy JA-20 rotor. Hòa tan RNA trong 1ml nước. Pha loãng từ 10ml thành 1ml rồi đo nồng độ RNA ở bước sóng A260 và A280 . Lúc này 1OD260 = 40mg/ml RNA. * Dung dịch nghiền mẫu (Grinding buffer) gồm: 0,18M Tris, 0,09M LiCl, 4,5mM EDTA, 1% Sodium dodecyl Sulfate (SDS), chỉnh pH đến 8,2 bằng HCl. Dung dịch này tương đương với dung dịch TLE nếu được thêm vào 1 lượng bằng 1/10 thể tích dung dịch 10% SDS. * Dung dịch TLE gồm: 0,2M Tris, 0,1M LiCl, 5mM EDTA, chỉnh pH đến 8,0 bằng HCl. * Phenol: Cân bằng phenol mới tan với lượng cứ 250ml dùng cho 15 gam mô mẫu với dung dịch TLE tiến hành trong cùng ngày chiết xuất. Cách thức làm đầu tiên chiết xuất với một thể tích tương đương dung dịch TLE, sau đó thêm 0,5ml dung dịch NaOH 0,15M để pH dung dịch » 8,0. Sau đó chiết tách thêm 2 lần nữa với dung dịch TLE như trên. d. Tách lọc poly(A)+RNA từ RNA tổng số Như chúng ta đã biết hầu hết các mRNA của sinh vật nhân thật đều có đuôi 3’ tận cùng poly A+ trong khi đó rRNA và tRNA thì không có. Trong số các RNA được tách ra ở trên t
Tài liệu liên quan