Bài giảng chương 1: Hóa học protein

Chương 1HÓA HỌC PROTEIN GV.Nguyễn Thị Kim Lang MỤC TIÊU Viết được công thức của 20 acid amin thường gặp trong phân tử protein. Phân tích được các dạng ion,đẳng điện và sự di chuyển trong điện trường của AA.. Liệt kê một số peptid có chức năng sinh học. Mô tả các dạng liên kết trong cấu trúc của protein. Mô tả 4 bậc cấu trúc và phân loại enzym. Trình bày được tính chất của protein:Khuếch tán, tích điện, hòa tan, kết tủa và biến tính. NỘI DUNG Protid là hợp chất hữu cơ quan trọng của cơ thể sống, nó tham gia vào các quá trình chuyển hóa (enzym, hormon), sinh sản (gen)...là cơ sở cấu trúc tế bào và mô. Danh từ protid dùng để chỉ 3 loại chất :Acid amin, peptid và protein. 1. Acid amin 1.1 Công thức chung Acid amin là hợp chất hữu cơ mà phân tử chứa 2 nhóm: Amin (-NH2) và carboxyl (-COOH). Công thức chung của các acid amin thường gặp là : - Gốc R: Riêng cho từng acid amin - Phần còn lại : Phần chung cho mọi acid amin *Vì nhóm amin và nhóm carboxyl gắn vào carbon  nên acid amin tương ứng được gọi là acid amin  (một số acid amin có nhóm amin không gắn vào carbon , mà lại gắn vào carbon , .... (thí dụ : . Alanin). * Mặc dù có độ 300 acid amin hiện diện trong tự nhiên nhưng chỉ có 20 acid amin hiện diện trong các phân tử protein. Các acid amin thường gặp trong tự nhiên đa số đều thuộc loại acid amin . 2 Phân loại acid amin Các acid amin hiện diện trong protein có thể được chia làm 2 nhóm nếu dựa trên nền tảng phân cực (polar) hay không phân cực (Nonpolar) của gốc R gắn vào carbon . * Xếp loại các L.  - acid amin hiện diện trong protein dựa trên nền tảng liên quan đến tính phân cực của gốc R. 1.3 Hóa học lập thể của acid amin Trừ glycin, các acid amin gặp trong protein đều có ít nhất 1 carbon bất đối do đó đều có hoạt tính quang học, hoạt tính quang học được biểu thị bằng góc quay đặc hiệu . Tùy theo sự sắp xếp của 4 nhóm liên kết với carbon bất đối mà acid amin có cấu hình L hay cấu hình D-acid amin L-acid amin Các dạng D và L đó là các dạng đồng phân lập thể của acid amin, trong tự nhiên thường gặp các acid amin dạng L. 1.4 Tính chất Acid - Base của acid amin 1.4.1 Sự phân ly của acid - Base: Theo quan niệm hiện đại thì: Acid là chất có khả năng giải phóng proton ( tức ion hydro H+) hay chất cho proton HA A- + H + Trong đó A- là baz liên hợp(có khả năng nhận proton) . B + H+ BH+ Trong đó BH+ lại là acid vì có khả năng nhả proton (theo phản ứng nghịch). Vì vậy ta có thể viết phương trình tổng quát: Acid Baz + H+ Thí dụ: NH4+ NH3 + H+ Acid Baz liên hợp 1.4.2 Sự phân ly của acid amin: Acid amin có nhóm carboxyl (-COOH) thể hiện tính acid (nhả proton) đồng thời có nhóm amin (-NH2) thể hiện tính baz (nhận proton) vì vậy acid amin có tính lưỡng tính. tùy theo pH của môi trường hòa tan acid amin mà acid amin có thể tích điện dương hay điện âm. Ở môi trường kiềm: Acid amin phân ly như một acid và trở thành anion: Ở môi trường acid: Acid amin hoạt động như một baz và trở thành cation: .Trong dung dịch nước: Acid amin bao giờ cũng có 3 dạng ion: Cation, ion lưỡng cực, anion. Khi thay đổi pH của môi trường sẽ dẫn đến sự thay đổi số lượng ( nồng độ) các dạng ion, có 3 trường hợp: Ở pH của môi trường trong đó acid amin có dạng ion lưỡng cực chiếm nhiều nhất, 2 dạng cation và anion chiếm ít nhất và bằng nhau thì tổng diện tích của acid amin bằng không. Acid amin không di chuyển trong điện trường. pH của môi trường đó được gọi là pH đẳng điện (pHi). Ở pH của môi trường lớn hơn pHi (tức pH kiềm so với pHi) acid amin vẫn có 3 dạng ion, nhưng dạng anion chiếm tỷ lệ lớn, acid amin di chuyển trong điện trường về phía cực dương. Ở pH của môi trường nhỏ hơn pHi (tức pH acid so với pHi) acid amin vẫn có 3 dạng ion, nhưng dạng cation chiếm tỷ lệ lớn, acid amin di chuyển trong điện trường về phía cực âm. Dựa vào tính chất tích điện của acid amin trong môi trường có pH nhất định được ứng dụng trong kỹ thuật điện di acid amin. 5 Tính chất lý học và những ứng dụng Nói chung các acid amin dể tan trong nước, ít tan trong alcol và không tan trong este; prolin và hydroxyprolin tan trong alcol và este. các acid amin thường tan trong acid và kiềm loãng tạo thành các muối của acid amin. Các acid amin thường có vị ngọt kiểu đường (Gly, Ala, val, Ser...) Muối Natri của acid glutamic có vị ngọt kiểu đậm nên thường được dùng làm gia vị (bột ngọt). Phổ hấp phụ: Có 3 acid amin là tyrosin, tryptophan, phenylalanin hấp thu mạnh ở vùng cực tím 240nm - 290 nm, các acid amin khác hấp thụ tia cực tím 220nm. Phần lớn protein đều chứa tyrosin nên người ta sử dụng tính chất trên để định lượng protein ở bước sóng 280nm. Trong Y khoa người ta dùng dịch Moriamin (gồm toàn acid amin để truyền cho bệnh nhân thay cho chế độ ăn uống bằng đường tiêu hóa, trong sinh hoạt gia đình ta dùng nước mắm để nêm (thực chất đây là dung dịch chứa acid amin). 6 Tính chất hóa học Các acid amin có những tính chất hóa học chung cho các nhóm -COOH và -NH2 quyết định, đồng thời cũng có những tính chất hóa học riêng do gốc R quyết định. 6.1 Những phản ứng của nhóm  - amin Phản ứng của aldehyt: các aldehyt kết hợp với những amin bậc nhất tạo nên baz Schiff. Sorensen dùng phản ứng này(với aldehyt formic) trong việc định lượng acid amin. . Phản ứng với 2,4 dinitroflorua benzen viết tắt ( DNFB) hay phản ứng Sanger. Trong môi trường kiềm yếu DNFB tác dụng với amin tự do tạo nên các dẫn xuất màu vàng 2,4 dinitrophenyl acid amin . F.Sanger đã dùng phản ứng này để xác định acid amin N - tận của chuỗi peptid. . Phản ứng với phenylisothiocynat (PITC) hay phản ứng Edman. PITC phản ứng với các acid amin và tạo thành dẫn xuất phenythiocarbonyl - acidamin, chất này ở môi trường acid hay trong dung môi nitrometan đóng vòng thành phenylthiohydantoin tương ứng. Những dẫn xuất phenylthiohydantoin không màu dễ dàng tách biệt và phân định bằng sắc ký. Phản ứng Edman được sử dụng rộng rãi để xác định acid amin N tận của chuỗi peptid. 6.2 Những phản ứng của nhóm  - carboxyl Nhóm  - carboxyl của mỗi acid amin đều có thể tham gia nhiều phản ứng. ở đây chỉ giới thiệu phản ứng thường được dùng trong phân tích acid amin và polypeptid đó là phản ứng khử nhóm carboxyl tạo thành alcol  amin (tác nhân khử NaBH4) 1.6.3 Phản ứng với ninhydrin: Có sự tham gia của hai nhóm  - carboxyl và  amin. Ninhydrin tác dụng với acid amin trong điều kiện đun nóng tạo thành CO2, NH2, aldehyt và ninhydrin bị khử, sau đó ninhydrin bị khử ngưng tụ với ninhydrin không bị khử tạo nên sản phẩm màu xanh tím. Riêng prolin, OH prolin cho màu vàng. + Ninhydrin Sản phẩm xanh tím Phản ứng trên được áp dụng rộng rãi trong nhiều kỹ thuật (sắc ký, điện di) để xác định acid amin. 6.4 Phản ứng của gốc R Do gốc R có những hóa chức khác nhau, nên chúng có thể cho những phản ứng hóa học khác nhau: oxy hóa khử (do nhóm - SH của cystein) tạo muối (do nhóm -NH2 của acid amin kiềm, -COOH của acid amin acid...) 7 Phân tích một hỗn hợp acid amin Sự tách biệt và định lượng từng acid amin trong hỗn hợp có rất nhiều phương pháp khác nhau để sử dụng. ở đây giới thiệu vắn tắt về phép sắc ký acid amin trên giấy. Cách tiến hành đại thể như sau: lấy 1 giọt hỗn hợp acid amin chấm lên trên một tờ giấy lọc đặc biệt, vết chấm cách mép tờ giấy vài cm (vết chấm gọi là điểm xuất phát). Sau đó nhúng mép tờ giấy gần điểm xuất phát vào dung môi bão hòa nước (butanol ,phenol...) đựng trong máng, giấy và dung môi đều được để trong một bình kín (gọi là buồng sắc ký) nhiệt độ không thay đổi. Khi dung môi thấm qua vết chấm hỗn hợp acid amin thì các acid amin được rút ra và kéo đi với tốc độ khác nhau (tốc độ này phụ thuộc đặc điểm cấu tạo, tính chất lý hóa, trọng lượng phân tử của acid amin). Khi dung môi thấm gần hết tờ giấy thì lấy tờ giấy ra, do tốc độ di chuyển khác nhau nên các acid amin được phân bổ thành từng vùng riêng biệt trên tờ giấy lọc theo chiều di chuyển của dung môi. Nhuộm tờ giấy bằng thuốc thử Ninhydrin rồi sấy nóng, các vùng phân bố acid amin thể hiện dưới dạng các vết màu tím xanh. Vị trí của mỗi vết (ứng với một acid amin nhất định) được xác định bằng chỉ số Rf, Rf là tỷ số khoảng cách a từ điểm xuất phát tới trung tâm của vết acid amin với khoảng cách b từ điểm xuất phát tới tiền tuyến của dung môi. Mỗi acid amin có một Rf tương ứng vì vậy có thể dựa vào tỷ số Rf để xác định từng acid amin một. 2. Peptid Peptid là những protid gồm từ 2 đến vài chục acid amin nối với nhau và có trọng lượng phân tử 0,001 micro mét, khuếch tán rất chậm trong dung dịch và không qua được các màng thẩm tích, protein có trọng lượng phân tử trên 6000. Có nhiều phương pháp xác định trọng lượng phân tử của protein. Áp suất thẩm thấu: protein hòa tan trong nước tạo nên dung dịch keo có áp suất thẩm thấu (gọi là áp suất keo) thấp hơn áp suất thẩm thấu của dung dịch thật nhiều (thí dụ dung dịch glucose) Áp suất keo đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển nước cùng các chất dinh dưỡng và cặn bã qua thành mạch. Sự khuếch tán: Protein khuếch tán chậm trong dung dịch và do kích thước lớn nên protein không đi qua được màng bán thấm như màng celophan, màng tế bào... Nếu cho dung dịch protein vào một túi làm bằng màng bán thấm rồi nhúng vào cốc nước thì các phân tử nhỏ, thí dụ Nacl có thể qua màng bán thấm ra khu vực nước, còn protein không qua được vẫn ở lại trong túi. Đó là sự thẩm tích, màng bán thấm khi đó được gọi là màng thẩm tích. Người ta dùng phương pháp thẩm tích để loại muối khỏi dung dịch protein. 3.4.2 Tính chất acid- Base của protein: Phân tử protein gồm rất nhiều acid amin nối với nhau thành một hay nhiều chuổi polypeptid, phân tử protein có nhóm  - NH2 tự do,  - COOH tự do, nhóm - NH2 và - COOH tự do của các acid amin kiềm và các acid trong chuỗi polypeptid. Vì vậy protein có tính chất lưỡng tính và ở 3 dạng ion trong dung dịch anion, cation, ion lưỡng cực. Và tùy theo pH của môi trường so với pHi mà ta có sự di chuyển của phân tử protein sang cực dương hay cực âm, pHi của protein phụ thuộc vào thành phần acid amin của nó. Người ta sử dụng tính tích điện của protein ở những pH ngoài pHi và sự di chuyển trong điện trường của protein để tách riêng biệt những protein khác trong hỗn hợp gồm nhiều protein. pHi của một số protein 3.4.3 Sự hòa tan và kết tủa protein Ở trạng thái hòa tan, protein được hydrat hóa (các phân tử nước bám vào các nhóm ưa nước như - NH2 - COOH... của phân tử protein) lớp áo nước bao quanh phân tử protein là một trong các yếu tố làm vững bền dung dịch protein. Có 4 yếu tố ảnh hưởng đến độ tan. Ảnh hưởng của pH đến độ tan của protein: Độ tan của protein thấp ở pH bằng pHi của nó, độ tan tăng ở pH lớn hơn hay nhỏ hơn pHi. Thí dụ: ở bất kỳ nồng độ Nacl nào, độ tan của  lactoglobulin cũng thấp nhất ở pH bằng pHi của nó ( 5,2 - 5,3) Sở dĩ có hiện tượng trên là vì ở pH = pHi phân tử protein không tích điện nên chúng không có sức đẩy tĩnh điện và chúng dễ dính vào nhau tạo thành tủa, ở pH lớn hơn pHi các phân tử protein đều tích điện âm, ở pH nhỏ hơn pHi các phân tử protein đều tích điện dương. Như vậy ở pH khác pHi các phân tử protein tích điện cùng dấu và chúng đẩy nhau nên không kết hợp với nhau thành tủa được: Độ tan tăng lên. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên độ tan của protein: Muối trung tính có ảnh hưởng rõ tới độ tan của protein cầu: Với nồng độ thấp chúng làm tăng độ tan của nhiều protein, khi tăng đáng kể nồng độ của muối thì độ tan của protein bắt đầu giảm và nồng độ muối rất cao, protein có thể tủa hoàn toàn. Các protein khác nhau tủa ở những nồng độ muối trung tính khác nhau. Người ta sử dụng tính chất này để chiết xuất và tách riêng protein khỏi hỗn hợp. Đó là phương pháp diêm tích. Thí dụ: Dung dịch Amonisulfat 50% (bán bảo hòa ) tủa globulin và dung dịch Amonisulfat bão hòa tủa albumin huyết \tương. * Ảnh hưởng của dung môi lên độ tan của protein: Khi thêm các dung môi hữu cơ trung tính (etanol, aceton....) vào dung dịch protein thì độ tan của protein giảm tới có thể kết tủa do giảm mức độ hydrat hóa của các nhóm ion hoá của protein, lớp áo nước bị mất, các phân tử protein kết hợp với nhau thành tủa. *Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ tan của protein: Trong khoảng nhiệt độ từ 0 - 400C, độ tan của đa số protein tăng khi nhiệt độ tăng, ở khoảng 40-700c đa số protein mất tính vững bền, và bắt đầu có sự biến tính . 3.4.4 Sự biến tính của protein Dưới tác dụng của nhiều yếu tố (nhiệt độ cao, tia X, acid, kiềm, kim loại nặng) protein dễ bị mất tính chất ban đầu. Thí dụ: Độ hòa tan giảm, tính chất sinh học bị mất... Các aa và peptid đơn giản không bị biến tính. Sự biến tính không làm đứt các liên kết peptid mà làm đứt các liên kết hydro, liên kết muối...Nối các khúc của chuỗi polypeptid, hoặc các chuỗi polypeptid với nhau, vì vậy cấu trúc của protein bị đảo lộn, các nhóm kỵ nước quay ra phía ngoài, các nhóm ưa nước quay vào trong, sự hydrat hóa protein bị giảm, các phân tử protein dễ bị kết hợp với nhau, độ tan giảm và kết tủa. Sự biến đổi cấu trúc khiến protein bị biến tính dễ được tiêu hóa hơn là protein nguyên thủy. Người ta phân biệt 2 dạng biến tính: Biến tính thuận nghịch: Protein trở lại trạng thái ban đầu với các cấu trúc, tính chất và chức năng nguyên thủy của nó. Biến tính không thuận nghịch: Protein không trở lại dạng ban đầu của nó. Lòng trắng trứng luộc là một thí dụ về biến tính không thuận nghịch. Còn biến tính thuận nghịch thì ta thấy ở trypsin: Đun nóng dung dịch trypsin ở pH bằng 3 tới 900C, cấu trúc protein bị biến đổi (biến tính) nhưng sau khi làm lạnh một thời gian nhất định trypsin trở lại cấu trúc ban đầu và lại có hoạt tính enzym. 3.4.5 Chức năng sinh học của protein: Chức năng sinh học của protein rất phong phú và đa dạng, không phải toàn bộ phân tử protein có giá trị như nhau đối với hoạt tính sinh học của nó, có bộ phận trực tiếp quyết định hoạt tính sinh học, có bộ phận làm nhiệm vụ giữ khung không gian của bộ phận trên....Có sự liên quan chặt chẽ giữa cấu trúc và chức năng sinh học của protein. Sự thay đổi các liên kết, nhóm hóa học hoặc acidamin nhất định trong phân tử protein dặc biệt bộ phận trực tiếp quyết định hoạt tính sinh học của nó dẫn đến sự thay đổi hoạt tính sinh học của protein. Bảng Phân loại protein theo chức năng sinh học