Bài giảng công nghệ gen và tế bào

CAO ĐẲNG ĐỨC TRÍ BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM Bài giảng công nghệ gen và tế bào CBGD: ThS. NGÔ THÁI BÍCH VÂN SỐ LƢỢNG KIẾN THỨC: 3 TÍN CHỈ ( 45 TIẾT) MỤC TIÊU MÔN HỌC: Cung cấp cho sinh viên các khái niệm cơ bản về gene, các phƣơng pháp để thu nhận DNA, RNA và một số kĩ thuật thao tác trên DNA. Đồng thời giới thiệu những ứng dụng của công nghệ gene trong y dƣợc và nông nghiệp. Bên cạnh đó, môn học này trang bị cho sinh viên khái niệm về tế bào gốc, một đối tƣợng đang đƣợc quan tâm trong lĩnh vực nghiên cứu tế bào. NHIỆM VỤ SINH VIÊN -Đến lớp học và thảo luận. -Tham gia làm bài tập -Tham dự kiểm tra giữa kì và thi kết thúc học phần CÁCH ĐÁNH GIÁ: vChuyên cần: 10 % vBài tập : 10 % vKiểm tra giữa kì: 30% vKiểm tra cuối kì: 50% CHƢƠNG TRÌNH M N HỌC Chƣơng 1: CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN (3 tiết) 1.1. C c đại ph n tử sinh học 1.2. Học thuyết trung t m của Sinh học ph n tử Chƣơng 2 CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID. CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN (3 tiết) 2.1. C c phương ph p t ch chiết nucleic acid 2.2. C c phương ph p định t nh v định lượng cơ bản Chƣơng 3 CÁC ENZYME TH NG DỤNG TRONG C NG NGHỆ GEN (2 tiết) 3.1. C c enzyme giới hạn (RE) 3.2. C c enzyme th ng dụng kh c Chƣơng 4 4.1.Các vector  CÁC VECTOR VÀ SỰ TẠO D NG (4 tiết) 4.2.Sự tạo d ng CHƢƠNG TRÌNH M N HỌC Chƣơng 5: PHƢƠNG PHÁP PCR (4 tiết) 5.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR 5.2. Thực nghiệm 5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 5.4.Các hạn chế của phương pháp PCR Chƣơng 6: CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEIC ACID (4 tiết) 6.1. Phương pháp Maxam-Gilbert 6.2. Phương pháp của Sanger Bài tập (2 tiết) Thi giữa kì. Chƣơng 7: CÁC PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN VẬT LIỆU DI TRUYỀN VÀO TẾ BÀO (4 tiết) 7.1. Các phương pháp biến nạp 7.2. Các phương pháp tải nạp nhờ vector là virus. 7.3. Kĩ thuật tái tổ hợp tương đồng 7.4. Phương pháp tiêm DNA vào trứng thụ tinh. CHƢƠNG TRÌNH M N HỌC Chƣơng 8: C NG NGHỆ GEN TRONG Y DƢỢC (4 tiết) 8.1.Chẩn đo n phân tử 8.2. Liệu pháp gen Chƣơng 9: C NG NGHỆ GEN TRONG N NG NGHIỆP (4 tiết) 9.1. Công nghệ gen trong chăn nuôi 9.2. Công nghệ gen trong trồng trọt Chƣơng 10: TẾ BÀO GỐC VÀ VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC SINH HỌC (8 tiết) 10.1. Khái niệm tế bào gốc 10.2. Ứng dụng của công nghệ tế bào gốc trong trị liệu 10.3. Các vấn đề của đạo đức sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO • Slide b i giảng • Hồ Huỳnh Th y Dương, Sinh học ph n tử, NXB Gi o dục • B i Ch Bửu v Nguyễn Thị Lang, Di truyền ph n tử, NXB N ng nghiệp • Trần Thị X , Nguyễn Thị Lan, Cơ sở di truyền v c ng nghệ gen, NXB Khoa học v kỹ thuật Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN 1. CÁC ĐẠI PHÂN TỬ SINH HỌC 1.1. AXIT NUCLEIC Là vật chất mạng thông tin di truyền của c c hệ thống sống, l một polymer hình th nh từ c c monomer là nucleotide. Nucleotide gồm: nhóm phosphate + đường ribose (5C) + base hữu cơ. Liên kết giữa các nucleotide là liên kết phosphodisester (giữa nhóm đường và phosphate). Các base: purine (Adenin và Guanine); pyrimidine (Thymine , Cytosin và Uracil) Chƣơng 1 1.1. AXIT NUCLEIC CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN q Deoxyribonucleic acid (DNA) - - Chuỗi xoắn kép gồm 2 mạch đơn, liên kết nhau bằng liên kết hidro. Mỗi mạch đơn l một tr nh tự c định hướng Qui ước: 5’-P à 3’- OH - Hướng 2 mạch đơn ngược nhau => hai mạch đối song song. Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN q Deoxyribonucleic acid (DNA) Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN v Sự kh c nhau giữa DNA của Prokaryote v Eukaryote? q Ribonucleic acid (RNA) - Sự kh c nhau giữa RNA v DNA? 1. Ph n tử RNA l mạch đơn 2. Đường pentose của RNA l ribose thay v deoxyribose. 3. Thymine được thay thế bằng Uracil. Chƣơng 1 Ø RNA thông tin (mRNA): CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN Đ ng vai trò trung gian chuyển thông tin di truyền trên phân tử DNA đến bộ máy giải mã thành các protein tương ứng. Chƣơng 1 Ø RNA vận chuyển (tRNA) CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN Vận chuyển các amino acid cần thiết đến bộ máy dịch mã để tổng hợp protein từ mRNA tương ứng. Cấu trúc: dạng cỏ ba lá, ổn định nhờ các liên kết bổ sung. Hai vị trí không liên kết: có vai trò quan trọng - Trình tự anticodon - Vị trí gắn amino acid (nối CHT với amino acid đặc trưng) Chƣơng 1 Ø RNA ribosome (rRNA) CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN Chiếm lượng lớn RNA trong tế b o (khoảng 80 %) l một th nh phần của bộ m y dịch mã. Gồm 1 tiểu đơn vị nhỏ v 1 tiểu đơn vị lớn . Chƣơng 1 1.2. Protein Cấu trúc: CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN - Đơn vị cơ sở : amino acid - Có 20 loại amino acid chính. - Phân loại amino acid(aa): do nhánh bên R qui định üaa có tính kiềm üaa có tính axit üaa trung tính kị nước üaa trung tích phân cực - Các aa liên kết nhau = liên kết peptide Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN Mức độ tổ chức của protein: 4 mức độ. Bậc 1: chuỗi polypeptide Bậc 2: sự uốn c c phần của chuỗi polypeptide à cấu tr c đều đặn trong kh ng gian (xoắn alpha, phiến beta). Bậc 3: sự kết hợp của cấu tr c protein bậc 2 (dạng 3 chiều) Bậc 4: kết hợp nhiều chuỗi polypeptide à ph n tử protein Chức năng của protein trong tế b o? 1.3. Lipid Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN - Nh n tố h nh th nh c c m ng sinh học. - Đơn vị cấu tr c: acid béo (mạch hidrocacbon + nh m carboxyl có tính acid) - L ph n tử lưỡng cực. Chƣơng 1 1.4. Polysaccharide CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN - Tham gia cấu tạo tế b o v l nguồn dự trữ năng lượng chủ yếu. - Đơn vị cấu tr c: c c đường đơn giản, liên kết với nhau = nối glycosidic. - Ở tế b o động vật, nguồn dự trữ: glycogen. - Ở tế b o thực vật, nguồn dự trữ: tinh bột. Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN Sự kết hợp chặt chẽ giữa c c đại ph n tử Cấu tạo m ng tế b o Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN II./ CẤU TRÚC CỦA GEN 1./ Phân loại gen: - C c gen cấu tr c hay cistron, thường gọi tắt l gen, mang th ng tin cho tổng hợp c c chuỗi polypeptid hoặc c c RNA cấu tr c. C c gen điều ho đặc trưng của prokaryote do đ cũng thuộc loại n y - C c gen mang th ng tin cho tổng hợp RNA vận chuyển (gen tRNA), RNA ribosom (gen rRNA) - C c v ng điều ho đặc th ở prokaryote - Các vùng đệm (spacer) giữa các gen. - C c v ng mã ho c c t n hiệu khởi đầu v kết th c phiên mã 2./ Tổ chức phức tạp của bộ gen a./ Cấu trúc phân đoạn của gen ở sinh vật nhân chuẩn (Exon-Intron) b./ Cấu trúc gen ở sinh vật nhân sơ (procaryote) Một phần bản đồ Gen không hoàn chỉnh bao gồm các operon ở vi khuẩn Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN 2. HỌC THUYẾT TRUNG TÂM - F.Crick (1956) DNA RNA  PROTEIN SAO MÃ  PHIÊN MÃ  DỊCH MÃ Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN • Quá trình sao chép (replication) Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN • Quá trình phiên mã (transcription) V ng promoter ở Prokaryote  Trình tự kết th c không phụ thuộc nh n tố Rho Nh n tố Rho Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN • Quá trình dịch mã (translation) Giai đoạn khởi động dịch mã Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN • Quá trình dịch mã (translation) Giai đoạn kéo d i Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN • Quá trình dịch mã (translation) Giai đoạn kết th c Chƣơng 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC – CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN 1. Một số thiết bị thông dụng v PIPETMAN Các loại kích cỡ: 1-10 µl 10 -100 µl (hoặc 10 – 200 µl) 100 – 1000 µl 1000 – 5000 µl 1. Một số thiết bị thông dụng (tt) v Týp (đầu côn) Các loại týp tƣơng ứng với từng loại pipetman. Hấp khử trùng đƣợc. v Eppendorf Đƣợc làm bằng nhựa chịu nhiệt Có các loại: 0,5 ml; 1,5 ml; 2 ml v MÁY LI TÂM v Phƣơng pháp li tâm: phân tách các phần tử dựa vào khối lƣợng của chúng Chƣơng 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC – CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN 2. PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC v Mục đích: thu nhận lƣợng lớn acid nucleic v Yêu cầu: DNA nguyên vẹn, nồng độ cao. v Lƣu ý: cần tiến hành tách chiết ở điều kiện nhiệt độ thấp. •TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Chƣơng 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC – CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN • Phƣơng pháp tách chiết DNA Các bƣớc cơ bản: 3 bƣớc 1. Phá màng tế bào và (màng nhân) 2. Loại bỏ protein 3. Tủa DNA Chƣơng 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC – CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN q Phá màng tế bào: Phƣơng pháp vật lý: sóng siêu âm Phƣơng pháp cơ học: xay, nghiền Phƣơng pháp hóa học: các chất tẩy, các proteinase (protein K) Chƣơng 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC – CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN • Các chất tẩy: Trixton X 100 Chƣơng 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC – CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN • Dung dịch Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% Chƣơng 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC – CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN q Loại bỏ protein - Sử dụng các hóa chất có khả năng biến tính protein - Thƣờng sử dụng dung dịch phenol (pH=8):chloroform à Biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid - Qua ly tâm, tách DNA và protein thành 2 lớp. q Tủa DNA: Mục đích: - Thu nhận DNA dƣới dạng cô đặc. - Bảo vệ DNA tránh sự phân hủy của enzyme. Có 2 phƣơng pháp tủa thông dụng: Tủa trong ETHANOL Cần bổ sung muối (Na+) Vethanol : V DNA= 2-2,5:1  Tủa trong ISOPROPANOL Không cần bổ sung muối Visopropanol : V DNA= 0,8-1:1 Quá trình tủa cần thực hiện ở nhiệt độ thấp để tăng hiệu suất. DNA sẽ thu nhận lại bằng li tâm. Sau đ , cần quá trình rửa tủa DNA bằng Ethanol 70 % à loại bỏ muối (hoặc các dấu vết của isopropanol) còn lại trên DNA KẾT QUẢ TỦA DNA 3. Phƣơng pháp tách chiết RNA toàn phần • RNA không bền , dễ bị phân hủy bởi enzyme ribonuclease (Rnase). • Rnase có mặt khắp nơi, có hoạt tính cao, bền nhiệt, rất khó phân hủy. à Tách chiết RNA đ i hỏi những điều kiện nghiêm ngặt hơn. Qui trình tách chiết RNA: tƣơng tự tách chiết DNA - Dung dịch Trizol (gồm: SDS, guanidinium thiocyanate, phenol pH=4) à phá màng, ức chế hoạt động của Rnase. - Protein đƣợc loại bỏ qua xử lí phenol:chloroform và li tâm. - Tủa RNA: tƣơng tự nhƣ tủa DNA. Chƣơng 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN 4. Phƣơng pháp định lƣợng bằng quang phổ kế Mục đích: định lƣợng tƣơng đối nồng độ nucleic acid. Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại (λ=260 nm) của các base. Qui ƣớc: 1 đơn vị OD 260 = 50 µg/ml DNA sợi đ i = 40 µg/ml DNA sợi đơn hoặc RNA 4.Phƣơng pháp định lƣợng bằng quang phổ kế (tt) v Kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid xác định giá trị OD ở 280 nm xác định giá trị OD ở 260 nm OD260/ OD280= 1,8 – 2 àdung dịch nucleic acid sạch. Công thức tính nồng độ DNA sợi đ i C= n* giá trị OD* 50 (µg/ml) n: độ pha loãng dung dịch DNA 5.Phƣơng pháp điện di Nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Các phân tử tích điện âm dƣới tác động của điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển về cực (+) Tính linh động của phân tử dựa vào các yếu tố: - Khối lƣợng phân tử - Cấu hình của phân tử - Nồng độ của chất cấu thành gel. 5.Phƣơng pháp điện di (tt) Thiết bị điện di Loại gel: v Gel agarose: loại gel thông dụng nhất, thƣờng dùng để phân tách những đoạn có kích thƣớc khoảng 0,5-20 kb. Agarose – polysaccharide Nồng độ agarose và thời gian điện di àKhả năng phân tách các phần tử vật chất (độ phân giải) • Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dƣới tia UV nhờ Ethidium bromide (EtBr) • Ethidium bromide (EtBr) Chất phát huỳnh quang. Khi nhận kích thích của ánh sáng tử ngoại (UV), phát ra ánh sáng nhìn thấy đƣợc Sự gắn xen EtBr vào DNA • Yếu tố đánh dấu trọng lƣợng phân tử (molecular weight marker-MWM): Tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thƣớc đã biết (thang DNA). Tùy thuộc vào kích thƣớc của đoạn gene mục tiêu, sử dụng nhiều loại thang khác nhau. Thang DNA λ-Hind III v Gel polyacrylamide: Phân tách các đoạn có kích thƣớc nhỏ dƣới 1000 bp. Đƣợc sử dụng cho những mục đích đặc hiệu: - Xác định trình tự DNA - Tách các đoạn DNA nhỏ Ví dụ: Kết quả điện di Chương 3 CÁC ENZYME THÔNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ GEN I. Các enzyme giới hạn (restriction enzyme – RE) v Tên gọi: - Chữ đầu viết hoa (in nghiêng) là chữ đầu tên giống vi khuẩn từ đó enzyme được li trích. - Hai chữ kế (in nghiêng) không viết hoa tương ứng với loài của vi khuẩn nói trên. - Chỉ số la mã chỉ thứ tự enzyme được phát hiện. Một số trường hợp có thêm chữ viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng. Ví dụ: enzyme  EcoRI Escherichia  coli  Ry13 Enzyme đầu tiên I. Các enzyme giới hạn (restriction enzyme – RE) (tt) v Phân loại: - -  Enzyme giới hạn là các endonuclease có khả năng phân cắt DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí xác định. Gồm 3 loại: Ø Loại 1: phân cắt tại vị trí cách trình tự nhận biết một khoảng từ 1000-5000 Nu Ø Loại 2: phân cắt ngay tại vị trí nhận biết. Ø Loại 3: phân cắt tại vị trí cách trình tự nhận biết khoảng 20 Nu. 1. Các loại enzyme giới hạn loại 2 v Trình tự nhận biết: - Mỗi enzyme nhận biết một trình tự nucleotide đặc hiệu. - Gồm 4 – 8 nucleotide. Một số enzyme có trình tự nhận biết không chuyên biệt (những Nu có thể thay thế được kí hiệu là N) - Có cấu trúc palindrome: trình tự trên 2 mạch hoàn toàn giống nhau khi đọc cùng một chiều. Ví dụ: trình tự nhận biết của enzyme BamHI là 5’ G G A T C C 3’ 3’ C C T A G G 5’ trình tự nhận biết của enzyme 1. Các loại enzyme giới hạn loại 2 (tt) v Các kiểu cắt của enzyme giới hạn loại 2 - Cắt tạo đầu bằng (blunt ends): cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm, tạo 2 đầu bằng. Ví dụ: - Cắt tạo đầu dính (cohesive ends): cắt tại vị trí lệch nhau trên hai mạch DNA, tạo 2 đầu dính (đầu so le). Ví dụ: EcoRI G C T T A A A A T T C G 2. Thiết lập phản ứng cắt v Thành phần phản ứng cắt: - DNA cần phân cắt. - Dung dịch đệm. - Enzyme - Dung dịch BSA (bovine serum albumin) - Nước cất 2 lần đã hấp khử trùng v Lưu ý: - Venzyme ≤ 1/10 tổng thể tích phản ứng. - Sử dụng dung dịch đệm (buffer) phù hợp với enzyme. - Ủ phản ứng cắt ở nhiệt độ hoạt động tốt nhất của enzyme. - Bổ sung enzyme vào sau cùng. II. Các enzyme thông dụng khác 1. Các polymerase: gồm 2 loại v DNA polymerase: xúc tác tổng hợp DNA, hoạt động theo chiều (5’ à 3’), cần có mồi. -  DNA polymerase III: có hoạt tính 5’- 3’ polymerase và 3’- 5’ exonuclease. -  DNA polymerase I: sửa sai trong quá trình sao chép ở vi khuẩn, có hoạt tính exonuclease 5’- 3’ và 3’- 5’. - Reverse transcriptase: tổng  hợp  mạch  DNA bổ  sung (complementary DNA - cDNA) từ RNA theo chiều 5’- 3’ v RNA polymerase: xúc tác tổng hợp RNA từ mạch một mạch DNA theo chiều 5’ – 3’, không cần mồi. Enzyme này thường được sử dụng để: - Tổng hợp mẫu dò RNA. - Nghiên cứu bản phiên mã của RNA từ DNA. 2. Các ligase - Xúc tác hình thành liên kết nối hai đoạn DNA hay RNA - Các enzyme thuộc nhóm này: T4 DNA ligase, T4 RNA ligase, alkaline phosphatase, T4 polynucleotide kinase… 3. Các nuclease: nhóm enzyme phân cắt các nucleic acid. v Dnase 1: xúc tác phản ứng phân cắt liên kết nằm ngay sau một pyrimidine trên DNA mạch đơn hoặc đôi. v Rnase A: phân cắt liên kết phosphodiester ngay sau một pyrimidine của RNA. Enzyme này bền nhiệt, có hoạt tính cao. v Rnase H: loại bỏ RNA trong phân tử lai RNA:DNA Bài toán 1: Thiết lập phản ứng cắt (V=20µl) 1,5µg DNA (0,5 mg/ml) bằng EcoRI. (biết EcoRI-12u/µl. Buffer phản ứng 10X-để cắt hết 1µg DNA cần 4 unit enzyme EcoRI).