Bài giảng Điều tra rừng - Chương VII: Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào

Chương VII. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào 7. Môi trường nuôi cấy. 7.1. Môi trường hóa học. (môi trường chứa trong ống nghiệm, bình tam giác) 7.1.1. Chức năng của loại môi trường này. - Là môi trường dinh dưỡng cho mẫu cấy và cây mô (thay cho đất ngoài tự nhiên) - Là giá thể để cấy mẫu - Để điều tiết quá trình sinh trưởng và phát triển của mẫu theo ý muốn của con người. 7.1.2. Thành phần của môi trường. 7.1.2.1. Chất dinh dưỡng: bao gồm 05 yếu tố Chương VII. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào * Đường: - Chức năng: + Cung cấp cacbon để cho mẫu cấy tổng hợp các chất hữu cơ tạo nên chất nguyên sinh của tế bào => tế bào sinh trưởng => tế bào sinh sản (phân hoá) => mô hay mẫu cấy sinh trưởng. (trong tự nhiên cây tự tổng hợp được đường bằng quá trình quang hợp) + Nguồn nguyên liệu cho quá trình hô hấp để sản sinh năng lượng cho mẫu cấy thực hiện các phản ứng trao đổi. - Chủng loại và liều lượng: có thể dùng đường sacarose hay glucose với nồng độ 20 – 30g/lít dung dịch môi trường Chương VII. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào * Các nguyên tố đa lượng. - Chức năng: Tham gia cấu tạo nên các chất hữu cơ trong tế bào => tạo chất nguyên sinh => sinh trưởng và phát triển. - Chủng loại và liều lượng: đó là các chất hữu cơ như N, P, K, Ca, Mg, S với liều lượng ≥ 30mg/lít dung dịch môi trường. * Các nguyên tố vi lượng. - Chức năng: tham gia vào cấu tạo của enzym phức (đóng vai trò nhóm ngoại của enzym) => xúc tác các phản ứng trao đổi chất trong tế bào => tế bào sinh trưởng và phát triển. - Chủng loại và liều lượng: đó là các nguyên tố Fe, Cu, Mn, Zn, Bo, I, Co với liều lượng < 30mg/lít. Chương VII. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào * Các vitamin. - Chức năng: là tiền chất để tạo nên các coenzym, mà coemzyn là loại nhóm ngoại điển hình của enzym phức => vitamin tham gia vào hoạt động xúc tác các phản ứng trao đổi chất của emzym phức. - Các loại và hàm lượng sử dụng trong nhân giống in vitro: + Nhóm B (B1, B2, B6): được sử dụng với hàm lượng 0,01 – 0,1mg/lít môi trường. + Myo-inositol (chất này bền với nhiệt độ cao): được sử dụng với hàm lượng 50 – 500mg/lít môi trường. + Vitamin C: được sử dụng với hàm lượng 1 - 10mg/lít môi trường. Lưu ý: Các loại vitamin cần phải được bảo quản lạnh trước khi sử dụng. Chương VII. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào * Các chất tự nhiên. Đó là các hợp chất hữu cơ tự nhiên, dịch chiết từ nẫm men, nước ép hoa quả có vai trò cung cấp các chất hữu cơ cho môi trường nuôicấy Chương VII. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào 7.1.2.2. Các chất điều hoà sinh trưởng. - Chức năng: Điều hoà sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy theo ý định của con người. Trong đó: + Môi trường giàu Auxin: kích thích mẫu cấy hình thành rễ + Môi trường giàu Cytokinin: kích thích hình thành chồi - Thành phần và liều lượng: + Auxin: chức năng là kích thích sự phát sinh và sinh trưởng rễ (vì vậy được sử dụng trong giâm hom và chiết cành). Cụ thể: kích thích sinh trưởng tế bào (tác dụng chính), kích thích phân chia (sinh sản) tế bào. Các loại và hàm lượng sử dụng trong nhân giống in vitro: IAA (auxin tự nhiên, được chiết xuất từ chóp rễ của cây trồng). NAA, IBA và 2,4D là các loại auxin nhân tạo, chúng có hoạt tính cao hơn nhiều so với IAA. Auxin được sử dụng với nồng độ 0,1 – 10 mg/lít môi trường. + Cytokinin: chức năng là kích thích sự phát sinh và sinh trưởng chồi. Cụ thể nó kích thích phân chia (sinh sản) tế bào. Các loại và hàm lượng sử dụng trong nhân giống in vitro: bao gồm Zeatin (là auxin tự nhiên, rất đắt nên ít được sử dụng), kinetin và BAP (Benzylamino purin) là các auxin nhân tạo chúng được sử dụng với nồng độ 0,1 – 5 mg/lít. Nếu tỷ lệ A/X > 1 thì sẽ kích thích hình thành rễ mạnh hơn hình thành chồi (trong môi trường nuôi cấy bao giờ cũng sử dụng cả 2). Còn nếu tỷ lệ A/X < 1 thì kích thích sự hình thành chồi mạnh hơn rễ, thậm chí chỉ hình thành chồi mà không tạo rễ (trong giai đoạn nhân nhanh). Còn khi tỷ lệ A/X = 1 thì sẽ tạo ra mô sẹo. Chương VII. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào 7.1.2.3. Chất làm đông đặc môi trường hoá học. Bổ sung vào môi trường hoá học 1 lượng Agar (6 – 12 g/lít) thì môi trường hoá học sẽ trở thành giá thể để cấy mẫu. 7.1.2.4. pH của môi trường. Phải chỉnh pH của môi trường hoá học tới 5,6 – 5,8 (nhỏ thêm axít vào). Đây là môi trường mà hoạt tính của đại bộ phận enzym được biểu hiện rõ nhất (hoạt động mạnh nhất). Chương VII. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào 7.2. Môi trường vật lý. Là môi trường của phòng nuôi, bao gồm nhiệt độ, ánh sáng. - ánh sáng: Có tác dụng làm cho cây mô thực hiện quá trình quang hợp => tạo đường => chuyển hoá thành các chất hữu cơ khác => tạo chất nguyên sinh của tế bào. + ánh sáng với cường độ 2000 – 4000 Lux, được tạo ra từ giàn đèn huỳnh quang đặt cách các bình nuôi 30 cm. (có thể dùng ánh sáng tự nhiên thay thế). + Thời gian chiếu sáng : 8 – 12 h/ngày. - Nhiệt độ: + Chức năng: các emzym chỉ có hoạt tính cao nhất trong một ngưỡng nhiệt độ nhất định. + Nhiệt độ phòng nuôi thường phải là 25 – 280 C vào ban ngày và từ 17 – 200C vào ban đêm, nó được điều chỉnh bằng máy điều hoà nhiệt độ 2 chiều. - Chu kỳ chiếu sáng và thời gian chiếu sáng tùy loài - Thời gian chiếu sáng 8 –12 giờ. Chương VII. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào 8. Thiết bị nuôi cấy: bao gồm - Thiết bị khử trùng - Máy cất nước 1 lần - Thiết bị để chuẩn bị môi trường hoá học - Thiết bị cấy - Thiết bị nuôi cấy Chương VII. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào 9. Triển vọng của ứng dụng nuôi cấy mô tế bào trong sản xuất nông nghiệp. (Tham khảo giáo trình). - Dần dần sẽ trở nên phổ biến vì có nhiều ưu điểm (như đã trình bày). - Hiện nay phương pháp này chưa được phổ cập vì giá thành cây giống tạo ra cao (so với cây hạt và cây con). Trong đó người sản xuất chưa có hiểu biết đúng về vai trò của giống tốt đối với sản xuất. Chỉ có những ai và ở những nơi nào hiểu biết được vai trò của giống tốt trong sản xuất và có điều kiện kinh tế thì mới dám đầu tư dùng cây giống được tạo ra bằng phương pháp này. Vd: Như đối với Bạch đàn cao sản: cây giống từ hạt đủ tiêu chuẩn xuất vườn (cao ≥ 40cm) có giá trung bình là 150đ/cây, trong khi cây giống tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy mô có giá trị từ 700 - 800đ/cây. Ngay cả giá của cây mầm (xuất bình) có chiều cao khoảng 5cm cũng có giá vào thời điểm hiện tại là 350đ/cây (bán tại Viện Sinh thái rừng & Môi trường - ĐHLN). Vd: Trong khoảng thời gian từ 21/10/2008 – 20/1/2009 tại Viện Sinh thái rừng & Môi trường - ĐHLN đã mở lớp đào tạo kỹ thuật viên về nhân giống cây nông – lâm nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy mô - tế bào cho các nơi từ Hà Tĩnh trở ra Bắc. Bộ NN & PTNT chi cho mỗi lớp như vậy là 250 triệu đồng. Các lớp như thế này sẽ được mở liên tục từ nay đến 2010.