Bài giảng Lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Phần I : Cơ sở lý thuyết HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển . Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích .Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thuốc . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng . Phần I : Cơ sở lý thuyết 1 - Khái niệm : Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chât lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn ,hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) . 2- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột : Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký . Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo . Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion . Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết . Phần I : Cơ sở lý thuyết Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử . Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột ,chúng ta cần có một pha động . Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C .. Vào cột phân tích ,kết quả các chất A,B,C.. Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột .Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác . F2 F3 F1 Phần I : Cơ sở lý thuyết Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) .và ngược lại . Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi 03 lực F1,F2,F3 .Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định .còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn . Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột .F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột . Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau ,Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột ( như hình dưới đây ) Phần I : Cơ sở lý thuyết Phần minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ký Thời gian A B Pha động Phần I : Cơ sở lý thuyết 3 - Phân loại sắc ký : Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loai như sau : 3.1 Sắc ký hấp phụ : Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải ( phản hấp phụ ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột .Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ . Trong trường loại này có 02 loại hấp phụ : + Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực . + Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cực ,pha động phân cực . Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau .... Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này mà thôi. Phần I : Cơ sở lý thuyết Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP ) Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau : L1 : RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m L7 : RP 8 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m L3 : Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m Và còn một số loai cột khác như cột Diol , Cột NH2,CN . . vv Phần I : Cơ sở lý thuyết 4 - Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ như hình trên Phần I : Cơ sở lý thuyết to t’r2 t’r1 tr1 tr2 To : Thời gian lưu chết t’r1 : Thời gian lưu thực chất A t’r2 : Thời gian lưu thực chất B tr1 : Thời gian lưu chất A tr2 : Thời gian lưu chất B Phần I : Cơ sở lý thuyết Từ các thông số của các peak trên đây ,nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký .Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lơi cho quá trình phân tích sắc ký. 4.1 Thời gian lưu thực t’r : Retention time Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn .Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất. Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố : + Bản chất sắc ký của pha tĩnh. + Bản chất ,thành phần,tốc độ của pha động + Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan + Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động . Trong một phép phân tích nếu tr nhỏ quá thì sự tách kém ,còn nếu tr quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của Peak rất kém ,thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi,hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên đã trình bày . 4.2 Hệ số dung lượng K’ : Capacity Factor Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng . K’ = ( tR - t0)/ t0 Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém . Nếu K’ lớn thì Peak bị doãng . Trong thực tế K’ từ 1- 5 là tối ưu . Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.3 - Độ chọn lọc : Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký ,khi 02 chất A ,B có K’A va K’B khác nhau thì mới có khả năng tách .,mức độ tách biểu thị ở Độ chọn lọc . = K’B / K’A Với điều kiện K’B > K’A với  càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.2 Số đĩa lý thuyết N: Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định .Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H ,Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động . Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố : + Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh + Tốc độ và độ nhớt ( độ phân cực )của pha động + Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột . Vì vậy với một điều kiên sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định. Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.2 Số đĩa lý thuyết N: Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau : N = 5,54 ( tR / W0,5)2 Trong đó : tR : Thời gian lưu của chất phân tích . W0,5 : Độ rộng tại điểm 1/2 của Peak . Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ . Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.3 Độ phân giải R : ( Resolution ) Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của 02 Peak cạnh nhau phải được tính theo công thức sau : R= 2( t’RB - t’RA)/ (wa + wB) Trong thực tế nếu các Peak cân đối ( Gass) thì độ phân giải tối thiểu để 02 Peak tách là R =1.0 .Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp + Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn ,việc tính toán diện tích Peak sẽ không chính xác ,lúc này phải tìm cách tăng R theo 03 cách sau: * Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động ( Thay đổi độ phân cực nếu là RP - HPLC ,thay đôi cường độ ion nếu là IE - HPLC ....) * Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có kích thước nhỏ hơn . Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.3 Độ phân giải R : ( Resolution ) * Làm tăng độ chọn lọc  băng cach dung cột khac phu hợp hơn với qua trình tach hoặc thay đổi thanh phần pha động . + Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu,tốn nhiều pha động ,độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình Gradient dung môi . Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các Peak ta phân tích . Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầu trong quá trình phân tích . Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.4 Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor) Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của Peak trên sắc ký đồ thu được . T được tính bằng tỷ số độ rộng của 02 nửa Peak tại điểm 1/10 chiều cao Peak : Peak dạng đôi xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T, Phần I : Cơ sở lý thuyết 4.4Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor) * Khi T  2.5 thì phép định lượng được chấp nhận * Khi T > 2.5 thì điểm cuối của Peak rất khó xác định ,vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để lầm cho Peack cân đối hơn theo các cách sau : + Làm giảm thể tích chết tức là đoạn nối từ cột đến Detector . + Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên + Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm thể tích tiêm mẫu . Phần I : Cơ sở lý thuyết 5 Phân loại sắc ký và ứng dụng : + Theo cơ chế chia tách của sắc ký ,người ta phân ra các loại sau đây : Sắc ký hấp phụ ( NP - HPLC va RP - HPLC); sắc ký phân bố - sắc ký chiết ( LLC); sắc ký trao đổi ion ( IE - HPLC) ; sắc ký rây phân tử - sắc ký gel ( IG - HPLC) .Nhưng thực tế hiện nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu . 5.1 Sắc ký hấp phu : * Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) cuả pha động để kéo chất tan ra khỏi cột .Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ .Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ: Phần I : Cơ sở lý thuyết + Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực . + Sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC): Pha tĩnh không phân cực pha động phân cực . Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi ,thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực ,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, các thuốc hạ hiệt giảm đau ....... Phần I : Cơ sở lý thuyết I- Máy HP:C gồm các bộ phận cơ bản được tóm tắt trên sơ đồ sau : Degasse Pump Tiêm mẫu Column Detector Phần II : Hệ thống HPLC Trong đó : 1- Bình chứa dung môi pha động 2- Bộ phận khử khí 3- Bơm cao áp 4-Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample) 5-Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong bộ điều nhiệt ) 6- Detector ( nhận tín hiệu ) 7-Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC. 8- In dữ liệu . Phần II: Hệ thống HPLC II.1 - Bình đựng dung môi - Hiện tại máy HPLC thường có 04 đường dung môi vào đầu bơm cao áp .Cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rưa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 04 đường là 100 % . Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 04 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 03và 02 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn,hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định . Hiện 04 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradial dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn . Phần II: Hệ thống HPLC Lưu ý : - Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC Hay dung môi tinh khiết phân tích . - Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích . Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền,tạo ra các Peak tạp trong quá trình phân tích . Phần II: Hệ thống HPLC II.2 Bộ khử khí Degasse : Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động . Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra - Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của Peak thay đổi . - Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi (Bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động . Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai . Phần II: Hệ thống HPLC II.3- Pump Cao áp : - Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký .Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar) và pump phải tạo dòng liên tục .Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút .(hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar) - Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tôi đa 412 Bar. Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút . - Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt . Hiện tại bơm có 2 Pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục . Phần II: Hệ thống HPLC II.4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection): Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy . Với dung tích của loop là 5 - 100l . Có 02 cach lấy mẫu vao trong cột : Băng tiêm mẫu thu công( tiêm băng tay ) va tiêm mẫu tự động( Autosample) . II.5 Cột sắc ký : Cột chứa pha tĩnh được coi la trái tim của hệ thống sắc ký long hiêu năng cao . - Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ ,chiều dài cột khoảng 10 -30cm ,đường kính trong 1-10mm ,hạt chất nhồi cỡ  = 5-10 m.(ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt vê kích thước và kích cỡ hạt....) Phần II: Hệ thống HPLC -Với chất nhồi cột cỡ  = 1.8 -5 m có thể dùng cột ngắn ( 3-10 cm ) và nhỏ ( đường kính trong 1-4.6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao. - Chất nhồi cột tùy theo loại cột va kiểu sắc ký ( trong các dược điển USP 23 ,24 có tiêu chuẩn hóa các loại cột ) - Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ ( pha đảo ) ,ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khac như :Nhôm Oxit,Polyme xốp ,chất trao đổi ion. * Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điêu nhiêt (Oven column) Phần II: Hệ thống HPLC II.6 - Detector : - Là bộ phận Phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng .Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loai Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích A=k.C Trong : A là tín hiệu đo được C Nồng độ chất phân tích k là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn Tín hiệu này có thể là : độ hấp thụ quang ; Cường độ phát xạ ,cường độ điện thế ,độ dẫn điện ;độ dẫn nhiệt ;chiết suất .. Phần II: Hệ thống HPLC Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau : + Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV + Detector quang phổ tử ngoại khả kiến ( UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang .đây là loại thông dụng nhất +Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang .Là loại Detector có độ chọn lọc cao nhất . +Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod Array ,ELSD (Detector tán xạ bay hơi ) các Detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất . Phần II: Hệ thống HPLC - Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là : + Detector điện hóa : Đo dòng ,cực phổ ,độ dẫn ,điện lượng ..) + DetectorChiết suất vi sai : Detector khúc xạ ( thông thường dùng cho đo các chất đường ) + Detector đo độ dẫn nhiệt ,hiệu ứng nhiệt .. II.6 - Bộ phận ghi tín hiệu - Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang . + Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ,thời gian lưu,diện tích của Peak ,chiều cao .. Phần II: Hệ thống HPLC + Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số,phổ đồ và các thông số của Peak như tính đối xứng,hệ số phân giải .... trong quá trình phân tích đồng thời sử lý ,tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như : Nồng độ,RSD, ... II.7 In kết quả : + Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ . Phần II: Hệ thống HPLC Phần III : CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ Muốn có một kết quả tách tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu ; Các điều kiện đó bao gồm : Pha tĩnh : - Loại pha tĩnh - Kích thước cột Pha động : Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ ... Nếu là chương trình rửa giải Isocratic Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình dung môi ... Nếu là chương trình rửa giải Gradient. Hệ thống trang bị: - Loại Detector: - Van tiêm mẫu,thể tích tiêm - Hệ đường dẫn Các yếu tố khác : nhiệt độ ,độ nhạy của detector bước sóng phân tích Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký III.1 : Lựa chọn pha tĩnh - Dựa vào các tài liệu ,Dược điển ,thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích .....ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hay các loại cột khác nhau ... Chúng ta thông thường dùng 02 loại cột pha thuận ( NP) và cột pha đảo ( RP) Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác như cột CN ,cột NH2 ,.... Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký Cột pha thuận ( NP): Silicagel trung tính Pha tĩnh :Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực .Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước . Ví dụ cột Lichrosorb Si 40,Si 60... Cấu tạo cột như sau : OH OH OH - O - Si - O - Si - O - Si - O - OH OH OH Pha động : dùng cho loai này là các dung môi không phân cực hay ít phân cực như : Methanol,Benzen,Acetonitril,Chlorofoc ... Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký III.1 : Lựa chọn pha tĩnh Cột pha đảo ( RP) : ( Silicagel đã Alkyl hóa ) Dùng để tách các chất không phân cực ,ít phân cực ,các chất phân cực có thể tạo cặp Ion .Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch Carbon thẳng ( C8 hay C18 tương đương RP 8 hay RP 18) hay các mạch Carbon vòng( Phenyl- tương đương cột Phenyl ) vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít . Ví dụ như cột Lichrosor -Lichrospher RP 8 ...... ODS , Cột Nucleosil C18........ Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký Pha Động : Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực như :Methanol ,Acetonitril,,nước hay các loại dung dịch đệm ,hỗn hợp của các dung môi-đệm . Sự tách của chất nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó được ứng dụng chủ yếu trong phân tích Dược phẩm . Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu . Hiện nay pha tĩnh trên nền Silicagel đã có hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vào nhóm thế của nguyên tử H ,ngoài ra còn có các lọai pha tĩnh trên nền Oxid Nhôm,trên nền chất hữu cơ cao phân tử,trên nền mạch các bon...... Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký III.2 : Lựa chọn pha động - Dựa vào các tài liệu ,Dược điển ,thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích .....ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tich phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi,hóa chất,thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị . - Pha động có thể làm thay đổi : + Độ chọn lọc  + Thời gian lưu Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký - Pha động có thể làm thay đổi : + Hiệu năng tách của cột + Độ phân giải + Tính đối xứng của Peak Do đó ,Trong một pha tĩ