Bài giảng Phân tích công cụ

1MỞ ĐẦU Các phương pháp phân tích bằng công cụ có vai trò đặc biệt quan trọng trong sự phát triển của các ngành khoa học kỹ thuật và công nghệ. Với sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật điện tử và tin học, các máy móc thiết bị phân tích cũng được hiện đại hóa, cho phép xác định nhanh chóng với độ chính xác cao các mẫu chứa hàm lượng rất nhỏ của các chất phân tích. Nhóm các phương pháp phân tích quang học dựa trên các tính chất quang học của chất cần phân tích, có một số phương pháp sau: 1. Phương pháp trắc quang dựa trên phép đo lượng bức xạ điện từ ( bxđt ) do dung dịch phân tích hấp thụ. Ở đây còn kể đến phương pháp hấp đục, dựa trên phép đo lượng bxđt bị hấp thụ bởi các hạt huyền phù (dung dịch keo); Phương pháp khuyếch đục, dựa trên phép đo lượng bxđt bị khuyếch tán bởi các hạt huyền phù. 2. Phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử AES (Atomic Emision Spectrometry), dựa trên sự khảo sát phổ phát xạ nguyên tử của nguyên tử chất phân tích. 3. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS (Atomic Absorption Spectrometry), dựa trên sự khảo sát phổ hấp thụ nguyên tử của nguyên tử của chất phân tích. 4. Phương pháp phát quang, dựa trên phép đo cường độ bức xạ do chất phân tích phát ra, dưới tác dụng của năng lượng bxđt chiếu vào nó. Ngoài ra, thuộc vào các phương pháp quang học còn có phương pháp khúc xạ, dựa trên phép đo chiết suất của chất phân tích; Phương pháp phổ hồng ngoại IR, Phương pháp phổ Rơntgen; Phương pháp phổ Raman… 2CHƯƠNG 1. CÁC VẤN ĐỀ CHUNG 1.1. Bản chất của bức xạ điện từ và các phương pháp phổ 1.1.1. Bản chất của bức xạ điện từ Bức xạ điện từ ( bxđt ) bao gồm từ sóng vô tuyến đến các bức xạ Rơntgen và Gamma đều có bản chất sóng và hạt. Bản chất sóng của bxđt thể hiện ở hiện tượng nhiễu xạ và giao thoa, bxđt là những dao động có hai thành phần là điện trường và từ trường, các sóng này truyền đi trong không gian với vận tốc của ánh sáng theo hình sin có các cực đại và cực tiểu; khoảng cách giữa 2 đầu mút của một sóng được gọi là bước sóng, ký hiệu λ. Cường độ của bxđt tỉ lệ với biên độ của dao động. Những bxđt khác nhau có độ dài bước sóng khác nhau hay bước sóng là đại lượng đặc trưng cho bxđt. Ngoài ra bxđt còn được đặc trưng bằng tần số υ, giữa bước sóng và tần số liên hệ với nhau qua biểu thức: c = λ υ (1.1) hay λ = c / υ (1.2) trong đó c là tốc độ ánh sáng, c = 3.108 m/s Trong các phương pháp phổ, người ta còn dùng đại lượng nghịch đảo của λ ( 1/λ ) gọi là số sóng để đặc trưng cho sóng, đơn vị của số sóng luôn là cm-1 υ = 1/ λ ( 1.3) Với bản chất hạt, bxđt là những phần nhỏ mang năng lượng được gọi là photon, các dạng bxđt từ khác nhau có năng lượng khác nhau. Sự thống nhất giữa bản chất sóng và bản chất hạt của bxđt được thể hiện trong biểu thức: ε = hυ = hc/λ (1.4) trong đó h là hằng số Planc, h = 6,62.10-34J.s 1.1.2. Đơn vị đo và sự phân chia các vùng bxđt Trong biểu thức 1.4 là các đại lượng đặc trưng cho bxđt. Bước sóng λ có thứ nguyên là độ dài. Để đo λ, người ta dùng các đơn vị đo độ dài là mét (m) cùng các ước số của mét, các đơn vị hay dùng là μm; nm và Ao ( 1A = 10-10m ). 3Đại lượng nghịch đảo của bước sóng là số sóng chỉ đo bằng một loại đơn vị là cm-1. Tần số υ được định nghĩa là số dao động mà bxđt thực hiện trong một giây, nên có thứ nguyên là s-1. Đơn vị đo của υ là hec ( hertz ) được ký hiệu là Hz và các bội số của nó là kHz ( kilohec ); MHz ( megahec ). Để có thể gây hiệu ứng quang phổ, năng lượng của bxđt phải phù hợp với hiệu số mức năng lượng ∆E tương ứng với các trạng thái năng lượng của nguyên tử hay phân tử, nghĩa là bước sóng λ của bxđt phải phù hợp với hệ thức: ∆E = ε = hυ = hc/λ hay λ = hc/∆E ( 1.5) Tùy theo bản chất của bxđt tương tác với nguyên tử hay phân tử của chất phân tích mà ta có các phương pháp quang phổ khác nhau, cụ thể là: - Miền sóng vô tuyến, viba cho phương pháp phổ cộng hưởng từ. - Miền sóng tia Rơntgen và tia γ cho các phương pháp phổ Rơntgen và phổ tia γ . - Miền sóng ánh sáng quang học cho các phương pháp phổ nhìn thấy - phổ tử ngoại ( UV - VIS ); phổ hồng ngoại ( IR ). - Trong miền sóng ánh sáng quang học cũng có các phương pháp phổ phát xạ nguyên tử; phổ hấp thụ nguyên tử và phổ huỳnh quang. Dưới đây là các vùng sóng chia theo chiều dài bước sóng. Bảng 1.1. Phân loại các vùng bức xạ điện từ Bức xạ λ , cm E, eV Tia γ Tia Röntgen Tử ngoại và khả kiến Hồng ngoại Vi sóng Sóng vô tuyến 10-11 - 10-8 10-8 - 10-6 10-6 - 10-4 10-4 - 10-2 10-1 - 10 > 10 ~ 107 ~ 105 ~ 10 ~ 10-1 ~ 10-3 < 10-6 1.2. Sự tương tác giữa vật chất và bxđt 4 Khi chiếu một chùm bxđt vào một môi trường vật chất, sẽ xảy ra hiện tượng các phân tử hay nguyên tử của vật chất hấp thụ năng lượng hay phát xạ năng lượng. Năng lượng mà phân tử hay nguyên tử phát ra hay hấp thụ vào là: ∆E = E2 - E1 = hυ ( 1.6 ) Trong đó E1 và E2 là mức năng lượng ở trạng thái đầu và trạng thái cuối; υ là tần số của bxđt bị hấp thụ hay phát xạ ra. Nếu năng lượng ở trạng thái cuối cao hơn trạng thái đầu ( ∆E > 0 ) thì xảy ra sự hấp thụ bxđt, phổ sinh ra trong quá trình này là phổ hấp thụ; Còn nếu năng lượng ở trạng thái đầu cao hơn trạng thái cuối ( ∆E < 0 ) thì xảy ra sự phát xạ năng lượng, phổ sinh ra trong quá trình này là phổ phát xạ. Các phương pháp phân tích dựa vào phổ nguyên tử thực hiện trên các máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS hay máy quang phổ phát xạ nguyên tử AES. Các phương pháp phân tích dựa vào phổ phân tử thì phong phú hơn, thực hiện trên các máy đo quang UV-VIS; máy quang phổ hồng ngoại IR. 1.3. Trạng thái năng lượng của phân tử, phổ phân tử Một phân tử dù là đơn giản nhất cũng có các chuyển động sau: - Chuyển động của các điện tử quanh các hạt nhân: các điện tử hóa trị và các điện tử không tham gia tạo liên kết hóa học - gọi chung là chuyển động điện tử. - Chuyển động thay đổi tuần hoàn các vị trí của các hạt nhân so với nhau - gọi là chuyển động dao động của phân tử. - Chuyển động thay đổi phương hướng của toàn phân tử trong không gian - gọi là chuyển động quay của phân tử, chuyển động này chỉ có ở các phân tử các chất ở trạng thái khí và hơi. Như vậy, năng lượng toàn phần Etf của phân tử có thể biểu diễn: Etf = Ee + Ev + Er ( 1.7 ) trong đó: Ee là năng lượng liên quan đến chuyển động của điện tử - gọi là năng lượng điện tử. Ev là năng lượng liên quan đến chuyển động dao động của hạt nhân ( vibration ) - gọi là năng lượng dao động. 5 Er là năng lượng liên quan đến chuyển động quay của phân tử ( rotation ) - gọi là năng lượng quay. Lý thuyết và thực nghiệm đã chứng minh Ee >> Ev >> Er , nếu năng lượng đo bằng đơn vị kcal/mol thì Ee khoảng 60 ÷ 150 kcal/mol; Ev khoảng 1 ÷ 10 kcal/mol; Er khoảng 0,01 ÷ 0,1 kcal/mol. Trong điều kiện bình thường, các phân tử tồn tại ở trang thái cơ bản, có năng lượng thấp nhất Eotf, khi phân tử nhận năng lượng, ví dụ khi hấp thụ bức xạ, có thể chuyển lên mức năng lượng cao hơn. Khi phân tử nhận năng lượng đủ lớn, ví dụ bxđt có năng lượng đủ lớn, phân tử chuyển lên trạng thái có năng lượng cao hơn E*tf gọi là trạng thái kích thích và: E*tf = E*e + E*v + E*r (1.8 ) Sự thay đổi trạng thái của phân tử do có sự thay đổi về năng lượng của phân tử. ∆Etf = E*tf - Eotf = ∆Ee + ∆Ev + ∆Er ( 1.9 ) ∆Etf là bước chuyển năng lượng toàn phần của phân tử; ∆Ee là bước chuyển năng lượng điện tử; ∆Ev là bước chuyển năng lượng dao động; ∆Er là bước chuyển năng lượng quay. Như vậy do hiện tượng hấp thụ bxđt của phân tử gây nên các bước chuyển năng lượng điện tử, năng lượng dao động, năng lượng quay của phân tử, là nguồn gốc các loại phổ hấp thụ phân tử: phổ quay, phổ dao động - quay, phổ điện tử - dao động - quay.... Ngoài ra, để phân tử có thể hấp thụ các bxđt gây nên các bước chuyển năng lượng, ngoài việc cần có điều kiện năng lượng phù hợp theo hệ thức ( 1.5 ) còn có các yêu cầu khác, gọi là theo quy tắc chọn lọc. Có hai loại quy tắc là quy tắc cho phép và quy tắc cấm: quy tắc cho phép quy định các điều kiện cho phép xảy ra các bước chuyển; Quy tắc cấm nêu các điều kiện mà với các điều kiện đó bước chuyển năng lượng không xảy ra được. Chính vì bản chất như vậy mà phổ phân tử có cấu trúc rất phức tạp, chúng ta thường nói là có cấu trúc đám. Với các máy quang phổ có độ tán sắc không lớn, phổ phân tử hầu như là miền bức xạ liên tục; Với các máy quang phổ có độ tán sắc lớn phổ phân tử gồm vô số vạch sít nhau. 6Mỗi phân tử của một chất thì có cấu trúc khác nhau nên có các bước chuyển năng lượng khác nhau, sẽ có phổ hấp thụ phân tử đặc trưng và khác nhau, mặt khác với các kỹ thuật phù hợp, người ta tạo phổ điện tử, phổ dao động, phổ quay của phân tử của chất nghiên cứu, đó chính là cơ sở của các phương pháp phân tích định tính. Còn để phân tích định lượng, người ta dựa vào định luật về sự hấp thụ bxđt Lambert-Beer . 1.4. Phổ hấp thụ nguyên tử và phổ phát xạ nguyên tử Ở trên ta đã xét sự tạo thành phổ của phân tử, tạo bởi sự liên kết của ít nhất là hai nguyên tử. Còn khi là nguyên tử ở trạng thái hơi tự do thì sẽ đặc trưng bởi phổ hấp thụ hoặc phổ phát xạ nguyên tử, cơ chế tạo thành có thể giải thích như sau: Trong điều kiện bình thường nguyên tử ở trạng thái cơ bản, không thu và cũng không phát năng lượng dưới dạng các bức xạ. Đây là trạng thái bền vững và nghèo năng lượng. Nếu nguyên tử nhận năng lượng dưới dạng nhiệt thì nguyên tử sẽ chuyển lên trạng thái có năng lượng cao hơn, gọi là trạng thái kích thích, trạng thái kích thích này không bền, chỉ khoảng 10-8 ÷ 10-9 s, sau đó nguyên tử có xu hướng trở về trạng thái có mức năng luợng thấp hơn, khi này nguyên tử sẽ giải phóng năng lượng dưới dạng bxđt bao gồm nhiều tia đơn sắc có bước sóng khác nhau nằm trong dải phổ quang học ( 190 - 1100nm ). Nếu thu, phân li và ghi chùm tia đó ta sẽ được dải phổ gồm các vạch phát xạ của nguyên tử hoặc ion. Trong tập hợp các vạch phổ thì mỗi nguyên tử hoặc ion lại có những vạch đặc trưng riêng. Một đặc điểm quan trọng là các nguyên tử tự do có khả năng hấp thụ những tia bức xạ mà nó có thể phát ra trong quá trình phát xạ của nó. Nếu nguyên tử nhận năng lượng dưới dạng bxđt ứng đúng với những tia mà nó phát ra trong quá trình phát xạ thì nguyên tử chuyển lên trạng thái kích thích. Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử. Nếu gọi năng lượng của bxđt đã bị nguyên tử hấp thu là ε = hυ thì ta có: ε = hυ = ∆E = Em - Eo ( 1.10 ) hay ∆E = h.c/λ (1.11 ) 7Trong đó Em và Eo là năng lượng ở trạng thái kích thích và trạng thái cơ bản của nguyên tử; h là hằng số Planck; c là tốc độ ánh sáng; λ là bước sóng của vạch phổ hấp thụ. Vậy phổ hấp thụ nguyên tử cũng là phổ vạch. Nhưng nguyên tử không hấp thụ tất cả các bức xạ mà nó có thể phát ra được trong quá trình phát xạ. Quá trình hấp thụ chỉ xảy ra với các vạch phổ nhạy, các vạch phổ đặc trưng và các vạch phổ cuối cùng của nguyên tố. Cho nên đối với các vạch phổ đó quá trình hấp thụ và phát xạ là hai quá trình ngược nhau. Trong phương trình ( 1.10 ), nếu giá trị ∆E là dương ta có quá trình phát xạ, nếu giá trị ∆E là âm ta có quá trình hấp thụ. Như vậy tùy theo từng điều kiện cụ thể để nguyên tủ hóa mẫu và kích thích nguyên tử mà quá trình nào xảy ra là chính, cụ thể là: - Nếu kích thích nguyên tử bằng năng lượng nhiệt ta có phổ phát xạ nguyên tử. - Nếu kích thích nguyên tử bằng chùm tia đơn sắc ta có phổ phát xạ nguyên tử. Phương pháp phân tích dựa trên phổ phát xạ nguyên tử gọi là phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử AES (Atomic Emision Spectrometry ) với máy phân tích tương ứng. Phương pháp phân tích dựa trên phổ hấp thụ nguyên tử gọi là Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS ( Atomic Absorption Spectrometry ) với các máy phân tích AAS. 8Chương 2. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỦ UV-VIS (Phương pháp trắc quang phân tử) Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử hay còn gọi là phương pháp đo quang, phương pháp phân tích trắc quang phân tử là một trong những phương pháp phân tích công cụ thông dụng với rất nhiều thế hệ máy khác nhau, từ các máy đơn giản của thế hệ trước còn được gọi là các máy so màu đến các máy hiện đại được tự động hóa hiện nay, gọi là máy quang phổ hấp thụ phân tử UV- VIS. Các máy đo quang làm việc trong vùng tử ngoại (UV) và khả kiến (VIS) từ 190nm đến khoảng 900nm. 2.1. Cơ sở lí thuyết của phương pháp 2.1.1. Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu Dung dịch có màu là do bản thân dung dịch đã hấp thụ một phần quang phổ ( một vùng phổ ) của ánh sáng trắng, phần còn lại ló ra cho ta màu của dung dịch, chính là màu phụ của phần ánh sáng trắng đã bị hấp thụ (vùng quang phổ còn lại). Ví dụ: dung dịch Fe(SCN)3 ta nhìn thấy màu đỏ là do khi ánh sáng chiếu vào dung dịch, dung dịch này hấp thụ mạnh bức xạ đơn sắc màu xanh và xanh lá cây, vùng quang phổ còn lại ló ra cho ta màu đỏ. Sự hấp thụ của dung dịch theo màu được trình bày trong bảng 2.1 Bảng 2.1. Sự hấp thụ màu của các dung dịch màu TIA SÁNG ĐƠN SẮC BỊ HẤP THỤ MÀU CỦA DUNG DỊCH 400nm ÷ 450nm: vùng tím lục ánh vàng 450nm ÷ 480nm: vùng chàm vàng 480nm ÷ 490nm: vùng chàm lục da cam 490nm ÷ 510nm: vùng lục chàm đỏ 510nm ÷ 560nm: vùng lục đỏ tía 5600nm ÷ 575nm: vùng lục ánh vàng tím 9575nm ÷ 590nm: vùng vàng chàm 590nm ÷ 640nm: vùng da cam chàm lục 640nm ÷ 720nm: vùng đỏ lục chàm 720nm ÷ 800nm: vùng đỏ tía lục Sự hấp thụ bức xạ đơn sắc (bxđs) của dung dịch còn phụ thuộc vào nồng độ của chất hấp thụ. Ở ví dụ trên, dung dịch Fe(SCN)3 có nồng độ càng lớn thì sự hấp thụ càng mạnh, biểu hiện ở màu của dung dịch càng đậm. 2.1.2. Các định luật cơ bản về sự hấp thụ ánh sáng Định luật Bugơ - Lambe (Bourguear - Lambert): Khi chiếu một chùm bxđs có cường độ I0 qua một lớp vật chất có bề dày l, thì cường độ bxđs ló ra I bao giờ cũng nhỏ hơn I0 . Có thể biểu diễn bằng biểu thức: I0 = I + Ia + Ir (2.1) Trong đó: Ia là phần cường độ bị hấp thụ Ir là phần cường độ bị phản xạ lại I là phần cường độ ló ra Dựa vào vô số thực nghiệm, hai nhà bác học đã đưa ra định luật hấp thụ ánh sáng, biểu diễn bằng biểu thức: I = I0 . e-kl (2.2) Trong đó k là hệ số hấp thụ, giá trị của k phụ thuộc vào bản chất của vật chất và vào bước sóng λ của bxđs. Định luật Lambe - Bia ( Lambert - Beer): Khi áp dụng định luật Bugơ - Lambe cho trường hợp vật chất là dung dịch có độ dày l ( dung dịch đựng trong cuvét có độ dày l ) chứa chất hấp thụ có nồng độ C. Nhà bác học Bia đã đưa ra định luật Lambe - Bia: - Nội dung: Với cùng bề dày của lớp dung dịch, hệ số hấp thụ k tỉ lệ với nồng độ của chất hấp thụ của dung dịch. - Biểu thức: k = ε*.C (2.3) hay I = I0 . e-ε*C.l (2.4) 10 Nếu đổi logarit tự nhiên về logarit thập phân thì biểu thức của định luật Lambe - Bia có thể biểu diễn bằng biểu thức: I = I0 . 10-ε.l.C (2.5) Trong đó: C- là nồng độ dung dịch, đo bằng mol/l l - là bề dày của cuvét đựng dung dịch, đo bằng cm ε - được gọi là hệ số tắt phân tử hay hệ số hấp thụ phân tử. ε là đại lượng xác định, phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thụ, vào bước sóng λ của bxđs và vào nhiệt độ. 2.1.3. Các đại lượng hay sử dụng Biểu thức ( 2.5 ) chính là cơ sở cho phương pháp phân tích định lượng. Tuy nhiên, quan hệ giữa cường độ ánh sáng và nồng độ của dung dịch thông qua hàm logarít, để thuận tiện cho sử dụng, chúng ta thường sử dụng các đại lượng sau: Độ truyền quang T: là tỉ lệ giữa cường độ chùm sáng đơn sắc sau khi đi qua dung dịch I với cường độ chùm sáng đơn sắc chiếu vào I0. T = I/I0 = 10-ε.l.C (2.6) Nếu l = 1cm thì T gọi là hệ số truyền quang. Trên các máy phân tích, T thường được biểu diễn bằng %, Thang đo T từ 0 ÷ 100 Mật độ quang D (Dentisity) hay độ hấp thụ A (Absorption) hay độ tắt E (Extinction): được định nghĩa theo biểu thức sau D = A = E = - lg T = lg(I0 /I) = ε.l.C Với các dung dịch chứa chất hấp thụ xác định, đựng trong các cuvét có kích thước như nhau thì ε và l là không đổi, khi này có thể biểu diễn: D = A = K.C (2.7) Hay nói cách khác, sự phụ thuộc giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch là tuyến tính, đó chính là cơ sở của phương pháp phân tích định lượng trắc quang phân tử. Như vậy nguyên tắc chung của phương pháp đo quang để xác định một chất X nào đó, ta chuyển nó thành một chất có khả năng hấp thụ ánh 11 sáng ( bxđs ) rồi đo sự hấp thụ ánh sáng của nó và suy ra hàm lượng chất cần xác định. Tuy nhiên để có thể áp dụng biểu thức này đòi hỏi phải đề cập đến các yếu tố ảnh hưởng. 2.1.4. Tính chất của mật độ quang và ứng dụng trong hóa phân tích Biểu thức D = A = ε.l.C cũng có thể coi là nội dung của định luật Lambe - Bia. Nếu ta đo mật độ quang của dung dịch có nồng độ 1mol/l đựng trong cuvet có bề dày 1cm thì giá trị mật độ quang đo được chính là hệ số hấp thụ phân tử, ε = D, đây chính là ý nghĩa vật lý của hệ số hấp thụ phân tử của một chất nhất định; ε phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thụ ánh sáng và vào bước sóng của bxđs được hấp thụ. Đo mật độ quang của dung dịch bằng một cuvét (l, C = const) ở các bước sóng khác nhau thì ta được đường cong biểu diễn phổ hấp thụ của dung dịch, D = f(λ) hay ε = f(λ). Hình 2.1. Dạng đường cong hấp thụ D = f(λ) 12 Đo mật độ quang của một dãy dung dịch có nồng độ khác nhau bằng một cuvét tại một bước sóng λ nhất định ( l, λ = const ) thì đường biểu diễn D = f(C) sẽ là đường thẳng. Hình 2.2. Dạng đường biểu diễn D = f(C) Một đặc tính rất quan trọng của mật độ quang đó là tính cộng tính, có thể chứng minh như sau: Giả sử có một chùm bxđs có cường độ I0 đi qua 2 dung dịch có bề dày l1 và l2 tương ứng với các nồng độ C1, hệ số tắt ε1 và C2, hệ số tắt ε2 D = lg(I0 /I2 ) = lg(I0 /I1 ) + lg(I1 /I2 ) = D1 + D2 = ε1.l1.C1 + ε2.l2.C2 Như vậy mật độ quang chỉ phụ thuộc vào số các phần tử hấp thụ ánh sáng nằm trên đường ánh sáng truyền qua. Trong dung dịch có nhiều chất tan hấp thụ bxđs thì mật độ quang đo được chính là tổng các mật độ quang của các chất có trong dung dịch, D = Σ Di. Khi muốn đo mật độ quang của chất phân tích ở trong dung dịch có nhiều chất thì phải loại trừ mật độ quang của các thành phần còn lại, đó chính là mật độ quang của dung dịch trống hay dung dịch so sánh. Dung dịch trống hay dung dịch so sánh là dung dịch chứa tất cảc các thành phần trong dung dịch phân tích trừ chất phân tích. Trong thực tế, nhiều khi độ hấp thụ của dung dịch so sánh rất nhỏ, không đáng kể thì người ta có thể thay bằng nước cất. D6 D5 D4 D3 D2 D1 C1 C2 C3 C4 C5 C6 Mật độ quang Nồng độ 13 2.2. Các điều kiện tối ưu cho một phép đo quang Ta biết D = f(λ,l,C) và theo định luật Lambe - Bia khi 2 đại lượng λ,l không đổi thì sự phụ thuộc D = f(C) là tuyến tính, phải có dạng y = ax là một đường thẳng, đây cũng chính là cơ sở của phương pháp phân tích định lượng. Như vậy những yếu tố ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng là bước sóng của ánh sáng tới và các yếu tố gây ảnh hưởng tới nồng độ C có thể làm sai lệch định luật Lambe - Bia gây sai số cho phép phân tích, vì vậy ta phải đặc biệt chú ý đến các yếu tố này. 2.2.1. Sự đơn sắc của nguồn bxđt Giả sử chùm sáng tới có cường độ I0 không phải là tia sáng đơn sắc mà là một chùm tia có cường độ I01, I02, I03 và chất phân tích chỉ hấp thụ tia thứ 2 còn không hấp thụ tia 1 và tia 3, khi này D = lg( I0 /I) = lg( I01+ I02+ I03)/I01+I2+ I03) Nếu tăng nồng độ C thì I2 sẽ giảm còn I01 và I03 vẫn không bị hấp thụ, khi tăng C đến một mức nào đấy thì I2 = 0, lúc đó: D = lg( I01+ I02+ I03)/(I01+ I03) = const Lúc này D = f(C) không tuyến tính nữa. Việc tạo được chùm tia bxđs có tính đơn sắc cao lại phụ thuộc vào thiết bị, tùy theo các máy phân tích mà bộ phận tạo bức xạ đơn sắc có thể là kính lọc màu; hệ lăng kính hay cách tử với độ phân giải cụ thể, khi này sẽ quy định tính chính xác của phép đo. 2.2.2. Bước sóng tối