Bài giảng Phương pháp lai phân tử

Do cấu tạo phân tử DNA gồm 2 mạch đơn mỗi mạch bao gồm trình tự của 4 nu đối xứng với nu mạch kia theo nguyên tắc A=T (2 liên kết hydro), GC (3 liên kết hydro). Nếu được đun lên một nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nhất định thì 2 mạch đơn sẽ dần tách nhau ra, nhiệt độ này là nhiệt độ nóng chảy DNA (Tm). Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ tại đó có một nửa số phân tử DNA kép được tách ra thành hai sợi đơn. Quá trình chuyển mạch từ kép thành đơn có đặc điểm xảy ra đột ngột, lúc đầu chưa đến Tm thì việc tách sợi kép khó khi nhiệt độ đến gần Tm, do tính cộng hưởng của phản ứng, giống như ta kéo tách sợi dây thừng, lúc đầu tác động một lực vào nhưng vẫn khó tách ra, khi đã tách ra rồi thì lại nhanh và dễ.

doc16 trang | Chia sẻ: haohao89 | Lượt xem: 7060 | Lượt tải: 2download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Bài giảng Phương pháp lai phân tử, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Chương XII Phương pháp lai phân tử Lai phân tử DNA Nhiệt độ nóng chảy của DNA Do cấu tạo phân tử DNA gồm 2 mạch đơn mỗi mạch bao gồm trình tự của 4 nu đối xứng với nu mạch kia theo nguyên tắc A=T (2 liên kết hydro), GºC (3 liên kết hydro). Nếu được đun lên một nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nhất định thì 2 mạch đơn sẽ dần tách nhau ra, nhiệt độ này là nhiệt độ nóng chảy DNA (Tm). Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ tại đó có một nửa số phân tử DNA kép được tách ra thành hai sợi đơn. Quá trình chuyển mạch từ kép thành đơn có đặc điểm xảy ra đột ngột, lúc đầu chưa đến Tm thì việc tách sợi kép khó khi nhiệt độ đến gần Tm, do tính cộng hưởng của phản ứng, giống như ta kéo tách sợi dây thừng, lúc đầu tác động một lực vào nhưng vẫn khó tách ra, khi đã tách ra rồi thì lại nhanh và dễ. Xác định quá trình chuyển từ mạch đôi à mạch đơn bằng cách đo biến đọng giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng 260nm (Hình X.2). Giá trị mật độ quang trồng tăng vọt lên khi mạch đôi chuyển sang mạch đơn. Hiện tượng này là hiệu ứng siêu sắc (hyperchrome effect). Nguyên nhân là do: Các base có đặc tính hấp thụ ánh sáng bước sóng 260nm. Đối với mạch đôi do các nu nằm chồng chéo lên nhau, các nu che khuất nhau khiến chúng hấp phụ không hoàn toàn như ở mạch đơn thẳng không che khuất. YÕu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy DNA Tách sợi kép thành 2 sợi đơn thực chất làm phá vỡ liên kết hidro yếu giữa 2 mạch. Vì thế số lượng các liên kết hydro (tỷ lệ GºC (3), A=T(2) và các yếu tố làm thay đỏi tính ổn định của chúng sẽ làm thay đổi “nhiệt độ nóng chảy” của một phân tử nhất định. a. Thành phần các base trên mạch Phân tử DNA nào có tỷ lệ CºG lớn tức là phân ử đó bền vững và nhiệt độ nóng chảy phải cao và ngược lại. Trong điều kiện chuẩn Tm thường được tính theo công thức: Tm = 69,3 + 0,41 (%GC). Như vậy, các vị trí khác nhau, trình tự GC khác nhau dẫn đến Tm khác nhau, trong cùng một quá trình nơi nào có GC nhỏ thì sẽ denature sớm hơn. b. §ộ dài đoạn DNA Đoạn DNA càng dài thì số cặp base lớn tức số liên kết H2 lớn do đó Tm để tách hoàn toàn 2 sợi đơn càng phải cao. Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA được tính theo công thức sau: DTm = -500/số lượng cặp bazơ. Như vậy, từ công thức chứng tỏ ảnh hưởng của độ dài đến Tm chỉ quan trọng đối với những đoạn DNA ngắn. Điều này chính là kết quả của tính hợp tác khi phân tử DNA dài gây lên. c. §iểm bắt cặp sai lệch Những đoạn có bắt cặp sai lệch như A với C và G với T chẳng hạn sẽ làm mất liên kết hydro dẫn đến làm giảm tính ổn định của phân tử lai. Thường người ta ước tính cứ có 1% bazơ ghép cặp sai thì Tm sẽ giảm đị 10C. Tuy nhiên, bắt cặp sai chỉ có ảnh hưởng trong trường hợp đối với đoạn DNA ngắn. d. Môi trường phản ứng - Nồng độ muối làm thay đổi lực ion, nồng độ muối càng cao thì Tm càng giảm theo tỷ lệ ứng với mỗi logarithme nồng độ thì Tm giảm đi 150C. - Ngoài ra loại cation khác nhau cũng ảnh hưởng đến độ bền vững của phân tử DNA cation hóa trị 2 có tác động mạnh hơn. - Ảnh hưởng bởi Formamide, hóa chất này có khả năng hạ thấp Tm xuống rất nhiều đặc biệt đối với những đoạn dài hơn 100 bp sự giảm Tm có thể ước lượng theo công thức: DTm = 0,6´(% Formamide). Vì formamide thường dùng trong phương pháp lai phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ lai. Nồng độ thường dùng trong lai formamide là 50% tương ứng khi đó chúng ta sẽ giảm được nhiệt độ lai xuống 300C. - Trong thực tế khi tách Tm phải quan tâm tổng hòa đến tất cả các yếu tố trên có thể ước lượng theo công thức: Tm = 81 + 16,6log10C1 + 0,41[%(G+C)] – 0,60 (% formamide) – 600/n – 1,51% mismatch). Trong đó C1 là nồng độ muối ion hóa trị 1, n chiều dài phân tử DNA tính bằng cặp bazơ nitơ. 3. Khái niệm về lai DNA Sau khi 2 mạch đơn của sợi DNA kép đứt tách ra dưới tác dụng của Tm chẳng hạn. Nếu nhiệt độ trở lại trạng thái ban đầu một cách từ từ thì 2 mạch đơn có bazơ bổ sung lại có thể ghép cặp lại với nhau. Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization). Ngược lại nếu nhiệt độ giảm xuống đột ngột khi chúng ta nhúng ngay vào nước đá chẳng hạn thì 2 mạch có thể không ghép cặp trở lại được. Lúc đó phân tử DNA tồn tại dưới dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian vô trật tự. Lai phân tử có 2 đặc điểm sau: Đặc thù tuyệt đối, tức sự bắt cặp trở lại chỉ xẩy ra giữa 2 trình tự hoàn toàn bổ sung, cho dù chúng chỉ có 2 bản sao nằm lẫn lộn giữa hàng triệu trình tự khác. Các trình tự bổ sung có thể là DNA hoặc RNA dẫn đến tạo thành phân tử lại dưới các dạng có thể sau: DNA: DNA; RNA:RNA và DNA: RNA. - Để biết được đoạn lai người ta thường phải dùng mẫu dò (đoạn DNA đơn hoặc RNA đánh dấu) để lai. Sau đó tìm cách nhận biết chúng. 4. Yếu tố ảnh hưởng đến lai DNA a. Nồng độ DNA và thời gian phản ứng - ĐÓ sự tái bắt cặp giữa 2 mạch đơn xẩy ra, các trình tự bổ sung phải đến gần nhau như vậy, cơ hội gặp gỡ giữa 2 trình tự bổ sung sẽ quyết định quá trình tái bắt cặp như vậy ở một nhiệt độ xác định thì tần số tái bắt cặp phụ thuộc vào nồng độ DNA và thời gian để tái bắt cặp. Nồng độ DNA cao nghĩa là trong dung dịch có nhiều trình tự bổ xung nhau thì xác suất chúng tiếp xúc với nhau càng nhiều kết quả là tốc độ phản ứng lại và một độ các phân tử lai trong một thời gian sẽ tăng lên. - Tương tự, thời gian phản ứng càng dài thì xác suất nói trên càng lớn. Nếu cứ kéo dài thời gian lai đến một lúc nào đó tất cả các trình tự bổ sung sẽ lai với nhau. - Hai thông số trên thường được xem xét đồng thời, tích số giữa nồng độ và thời gian được gọi là Cot (Co: concentration nồng độ; t là thời giam). Cot1/2 là giá trị tại đó có 50% số phân tử bổ sung trong dung dịch được lai với nhau. b. Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ của phản ứng lai. Thông thường tốc độ phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính đoạn bæ sung sau đó độ 25%. c.Độ dài của trình tự Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với căn bậc hai của độ dài các đoạn trình tự bæ sung. d.Lực ion Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5-10 lần. Nồng độ NaCl vượt quá 1,2M lại hoàn toàn không còn tác dụng tăng tốc độ phản ứng. II. Các kiểu lai phân tử Các phương pháp lai phân tử rất đa dạng, tạm thời chia chúng thành 3 nhóm lớn: Lai trong pha lỏng Lai trên pha rắn (màng nylon, nitrocellulose) Lai tại chỗ (insitu hybridization) Chúng ta sẽ lần lượt xét từng phương pháp lai một Lai trong pha lỏng a. Nguyên tắc Khi các trình tự bổ sung (các mạch đơn) cùng có mặt trong môi trường lỏng, là dung dịch đệm. Khi nhiệt độ môi trường từ nhiệt độ Tm hạ thấp dần dần thì các đoạn mạch đơn bổ sung nhau nếu gặp nhau thì sẽ bắt cặ trở lại tạo ra phân tử DNA lai. Vấn đề đặt ra là nhiệt độ lai bằng bao nhiêu thì có tần số ghép cặp đoạn bổ sung lai cao nhất. Để xác định nhiệt độ lai thích hợp người ta thường sử dụng dựa vào Tm -150C, hơn nữa trong thực tế người ta thường thêm formamide để giảm nhiệt độ lai, để tạo ra hiệu quả bắt cặp lai đặc thù cao giữa 2 đoạn bổ sung. Thực tế thì mẫu dò và đoạn bổ sung ít bao giờ lai đặc thù 100%. Khi lai, tính phức tạp, nồng độ của hỗn DNA được lai và tính tương đồng giữa mẫu dò với mạch bổ sung có ảnh hưởng to lớn đến hiệu quả lai. Đối với những đoạn ngắn, lai trong dung dịch xảy ra một cách thuận tiện hơn vì tần số tiếp xúc giữa 2 đoạn bæ sung dễ dàng hơn so với đoạn dài. b. Phân tích định lượng phân tử lai Trong nhiều trường hợp rất cần thiết phải biết % tương đồng giữa 2 nguồn DNA khác nhau, thông qua phương pháp lai DNA cũng có thể xác định được. Vì DNA genome sinh vật thường lớn cho nên trước khi xác định nguồn DNA được cắt bằng enzyme giới hạn, sau đó đem biếnt tính tạo 2 mạch đơn đo OD260 nm sau đó cho cùng một lượng mẫu dò vào 2 nguồn rồi đo OD260 cả 2 nguồn. Sự thay đổi về trị số OD260 trước và sau lai của 2 nguồn phần nào kết luận một cách tương đối với sự tương đồng giữa 2 nguồn gen theo mẫu dò. Vì như chúng ta đã đề cập ở phần trên DNA mạch đôi hấp thụ ánh sáng yếu hơn DNA mạch đơn, sự giảm OD tương ứng với sự tăng đoạn lai trong dung dịch. c. Phương pháp sử dụng enzyme Nuclease S1 Như chúng ta đã đề cập ở phần trước, enzym Nuclease S1 có đặc tính phân giải các mạch đơn của DNA và RNA trong một số điều kiện thí nghiệm nhất định, nhưng thường khả năng phân rã ssDNA mạnh hơn ssRNA gấp 5 lần. Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần, phần này đem xử lý nuclease S1. Khi đó các mạch đơn bị phân giải số còn lại đều là phân tử lai DNA:DNA hoặc DNA:RNA. Chúng được thu nhận bằng phương pháp kết tủa rồi đem định lượng sẽ xác định được số lượng DNA lai d. Phương pháp sắc ký trên hydroxyl apatide Hydroxyl apatide là một dạng phosphate canxi tinh thể có khả năng bọc lấy DNA sợi kép ở nồng độ muối cao chỉ những DNA mạch kép mới gắn vào tinh thể này, phân nucleic axit mạch đơn và RNA không gắn vào giá thể được thu nhận riêng. Sau đó nếu tăng nồng độ phosphate lên, các DNA kép được gắn sẽ tách rời giá thể phosphate canxi và được nhu nhận riêng. Hàm lượng DNA gắn (mạch đôi) và không gắn vào giá thể (mạch đơn) được xác định bằng quang phổ từ đó tính ra được % phân tử lai. 2. ứng dụng a. Nghiên cứu tính tương đồng giữa các loài Các loài khác nhau trong cây tiến hoá có thể có nhiều đoạn DNA giống nhau. Nếu càng có nhiều đoạn DNA giống nhau thì càng gần nhau trong cây tiến hoá. Trong công tác chọn tạo giống việc xác định gần xa nhau về genom một cách tương đối có ý nghĩa to lớn. Hai giống, dòng càng xa nhau về genome, thì khả năng khi lai với nhau cho ưu thế lai càng cao hay sẽ tạo được quần thể F2 có mức tăng tiến càng lớn. Phương pháp lai trong pha lỏng có thể cho phép chúng ta xác định được mức độ gần nhau về genom giữa các loài. Để tiến hành người ta chiết xuất DNA tổng số, của 2 giống dòng, sau đó cắt bằng 1 hoặc một vài enzym giới hạn tạo thành các đoạn DNA giíi hạn ngẫu nhiên, hoặc có thể không cần cắt. Sau đó dùng một số đoạn DNA mẫu dò được đánh dấu phóng xạ hoặc mầu, cho lai cùng với 2 genome. Dùng phương pháp xác định những trình tự và nồng độ lai giữa 2 genome với mẫu dò, rồi so sánh giữa 2 genome sẽ biết được mức độ gần xa nhau về mặt di truyền. Để nghiên cứu mức độ phức tạp của genome các loài: Như chúng ta đã biết sau khi các đoạn DNA được biến tính hoàn toàn bằng nhiệt độ gần điểm sôi, nếu gặp điều kiện nhiệt độ quay lại một cách từ từ thì 2 mạch đơn bổ sung lại tái bắt cặp với nhau. Tốc độ tái bắt cặp giữa 2 sinh vật có cấu trúc genom khác nhau sẽ khác nhau. ĐÓ so sánh người ta vÏ thành đồ thị (h×nh 2.12), trục tung là % số phân tử tái bắt cặp (lai) lại, còn trục hoành là thời gian (tính bằng giây) cần thiết để các loại mạch đơn khác nhau tái bắt cặp 100% . 25 50 75 100 10-3 10-2 10-1 1 10 102 103 104 % lai Cot (moles x giây) Trình tự duy nhất Trình tự lặp lại vừa vừa Trình tự lặp lại rất nhiều lần ------ E.Coli ____ Động vật có vú à Cot1/2 Hình 2.12. Đường cong tái bắt cặp của DNA ở động vật có vú và ở vi khuẩn Ở sinh vật tiền nhân, đường biểu diễn tái bắt cặp rất đơn giản là một đường thẳng, chứng tỏ tốc độ tái bắt cặp của tất cả các trình tự trên bộ genome là như nhau, không có nơi nào có trình tự lặp lại khác nhau chủ yếu là trình tự đơn. Trong khi đó, ở sinh vật nhân thật đường biểu diễn là một hình cong phức tạp, gồm nhiều đoạn đơn ghép lại. Chúng có thể được phân ra 3 vùng: 1/ vùng trình tự DNA có khả năng bắt cặp tức thời có Cot<10-3, đó là vùng chứa các trình tự lặp lại nhiều lần, 2/ vùng trình tự DNA tái bắt cặp chậm hơn nằm trong khoảng 10-3 <Cot < 10, tương ứng với trình tự lặp lại vừa, và 3/ gồm các trình tự DNA tái bắt cặp lại chậm, đó là các trình tự có các vùng duy nhất một lần trong genome. Nếu như hai genome có một số trình tự tương đồng giống nhau, khi trộn vào nhau, với tỷ lệ nồng độ khác nhau khá lớn, sẽ xÈy ra hiện tượng là hầu hết các phần tương đồng của genome có nồng độ thấp sẽ được lai với trình tự bæ sung của genome có nồng độ cao. Tất nhiên, mặc dù lai được với nhau nhưng giữa chúng không tuyệt đối có trình tự giống nhau hoàn toàn. Nếu một trong hai genome được đánh dấu, nếu chúng ta phát hiện và đo được phân tử lai sẽ dự đoán được mức độ giống nhau giữa 2 genome. b. Phân tích trình tự lặp lại Trong hỗn hợp dung dịch DNA, nếu một trình tự nào đó có tần xuất lặp lại nhiều lần thì sẽ có nhiều cơ hội gặp mạch bổ sung để lai nhanh hơn so với trình tự duy nhất. Tốc độ lai càng lớn thì trình tự đó có độ lặp lại trong genom càng cao và ngược lại. Khi chúng ta dùng đoạn lặp lại đó làm mẫu dò, thì nồng độ hay mật độ phân tử lai đo được theo thời gian lai là một chỉ tiêu dùng để xác định tần số lặp lại của đoạn đó. c. Nghiên cứu kích thước genome của sinh vật không có trình tự lặp lại Ở sinh vật tiền nhân do không có trình tự lặp lại nên tốc độ lai của tất cả các trình tự là như nhau. Giá trị Cot1/2 chỉ phụ thuộc vào kích thước dài ngắn của bộ genom. Do vậy nếu chúng ta đo được Cot1/2 giữa 2 loài sinh vật tiền nhân thì chúng ta có thể suy đoán được một cách tương đối bộ genom của nó. 3. Lai trên pha rắn a. Nguyên tắc Lai trên pha rắn tuân thủ nguyên tắc giống hoàn toàn với cơ chế lai trên pha lỏng. Điểm khác biệt ở đây là một trong hai trình tự bổ sung, thường là trình tự đích, tức trình tự cần tìm được cố định trên một giá thể rắn. Phương pháp này do E.M Southern đề xuất vào năm 1975 khi ông phát hiện thấy khả năng di chuyển qua mao dẫn của đoạn phân tử DNA từ gel agarose hoặc polyacryalamide lên màng. Những đoạn DNA sau khi được biến tính sẽ tách thành 2 sợi đơn có thể chuyển rời khỏi gel và bắm chặt được vào màng nitrocellulose hoặc nylon trong điều kiện nồng độ muối cao. Kích thước của đoạn DNA có ảnh hưởng rất lớn đến sự di chuyển. Đoạn có kích thước nhỏ thường bị phân tán và lai không hiệu quả nên khó phát hiện được trong quá trình lai. Ngược lại đoạn DNA quá lớn thì quá trình di chuyển lại chậm và gặp khó khăn. Thuận lợi của việc sử dụng giá thể rắn là thao tác thực hiện rất dễ dàng, chúng ta có thể tách được những trình tự không lai được ra khỏi trình tự lai được. Đồng thời còn tránh được quá trình tái bắt cặp lại giữa các mạch của cùng một trình tự. Tuy nhiên việc định lượng số phân tử lai thì lại không chính xác và hiệu quả lai thấp. Vận tốc lai trên pha rắn thấp hơn 10 lần so với pha lỏng, một phần do các nucleic acid được cố định trên giá thể bị che khuất không tiếp xúc được với trình tự bæ sung. b. phương pháp lai cã 3 ph­¬ng ph¸p; + Southern blot là phương pháp lai giữa phân tử ssDNA và ssDNA. + Northern blot là lai giữa mRNA và RNA còn + Western blot là phản ứng kết tủa giữa protein kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody). c. Kỹ thuật lai - Southern blot + Phương pháp này được sử dụng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA genom sinh vật bậc cao hoặc DNA của plasmide và phage. Cơ sở khoa học của phương pháp là kỹ thuật di chuyển DNA từ gel sang màng lai (nitrocellulose hoặc nylon). Gồm các bước sau: + Chiết tách DNA sau đó cắt thành các đoạn có kích thước khác nhau bằng cách sử lý một hay vài enzyme cắt giới hạn. Các đoạn này sau đó được phân tách theo kích thước bằng cách điện di trên nền gel agarose. + DNA được làm biến tính (tạo thành 2 mạch đơn) ngay trên gel, bằng cách ngâm gel vào dung dịch HCl nồng độ 0,2N trong 10 hoặc 20 phút tuỳ đoạn cần phân tích có chiều dài là bao nhiêu, nếu đoạn có chiều dài > 1Kb thì ngâm dài. Sau đó các đoạn đơn này được chuyển sang màng lai bằng phương pháp thẩm thấu hoặc dùng dòng điện đÓ di chuyÓn (h×nh 3.12). Hình 3.12. Chuyển DNA từ gel lên màng theo phương pháp thẩm thấu + DNA sẽ bám chặt vào màng lai và cố định tại đó theo đúng vị trí như ở trên gel. Có thể đem lai ngay hoặc sấy khô dự trữ dùng sau này. + Đem lai với mẫu dò đánh dấu phóng xạ hoặc hoá chất phát màu. Sau khi lai rửa màng lai để loại bỏ các đoạn không lai và các mẫu dò không bắt cặp đặc thù với DNA trên màng. + Cuối cùng dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) đÓ định vị các phân tử lai (DNA bộ gen với mẫu dò). Trong kỹ thuật này người ta đặt một phim nhạy cảm với tia phóng xạ áp sát vào màng lai, các phân tử lai chứa một nửa mạch đánh dấu phóng xạ sẽ tác động lên phim, kết quả thu được các vệt đen trên phim. Do tính nguy hiÓm và bất tiện của phương pháp đánh dấu phóng xạ, hiện nay người ta thường dùng phương pháp quang hoá với nguyên tác là gắn một chất nào đó có khả năng phát quang hoặc phát sáng khi tương tác với enzym hay hoá chất vào một trong các nucleotide trong mẫu dò. Đó là hệ thống Biotin-streptavidin; Digoxigenin và Horseradish peroxydase với chất quang hoá (chemiluminescence). Chi tiết về cơ chế sẽ trình bầy ở chương XIII. - Ứng dụng + Lập bản đồ c¾t giới hạn của một gen. + Phát hiện tính đa hình của trình tự cùng một gen ở các loài, chủng hay giữa các cá thể khác nhau, b»ng viÖc so sánh bản đồ c¾t giới hạn giữa chúng. + Phát hiện các thÓ đột biến, mất đoạn, đột biến điÓm, hay tái tæ hợp trên một gen. + Xác định họ hàng, tội phạm con ngoài dã thú. + Nghiên cứu liên kết gen với từng tính trạng nông sinh học phục vụ công tác chọn tạo giống, lập bản đồ liên kết giữa chúng. d. Phương pháp lai Northern blot Phương pháp này dựa trên cơ sở khả năng kết cặp bæ sung giữa RNA với RNA và giữa RNA với ssDNA. Kỹ thuật này được sử dụng đÓ xác định kích thước và hàm lượng của một mRNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA, hoặc dùng để tìm gen tương ứng sinh ra mRNA đó. Phương pháp này gồm các bước: + Tách chiết RNA tổng số. + Biến tính RNA rồi phân tách bằng điện di trên gel agarose có chứa các chất làm biến tính. Các chất làm biến tính có tác dụng khiến các liên kết yếu quy định cấu trúc bậc 2 của RNA không thể hình thành trở lại sau khi bị biến tính. Do đó không làm cản trở và phân tách RNA trong gel. + Sau đó chuyển RNA sang màng lai. + RNA cố định trên màng lai được lai với mẫu dò đã được đánh dấu. + Phát hiện phân tử lai tuỳ theo sử dụng phương pháp đánh dấu nào. e. Phương pháp Western blotting (Immunoblotting và Immunodetection) Western blotting là phương pháp được sử dụng đÓ nhận diện một kháng nguyên đặc hiệu nhờ các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng tương ứng. Trước khi tiến hành phương pháp này chúng ta cần nắm một số khái niệm và cơ sở khoa học của phương pháp. - Các khái niệm và cấu trúc + Kháng nguyên (antigen) là một chất khi được đưa vào cơ thể sinh vật sẽ kích thích sản sinh ra một kháng thể (antibody) hay là một phân tử mà hình thể của nó kích thích sản sinh ra những kháng thể (immunoglobulin) có khả năng bọc lấy kháng nguyên. + Kháng thể là một protein được sinh ra từ hệ thống miễn dịch của cơ thể có khả năng nhận biết và giúp chống lại sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây bệnh và chất ngoại lai khác xâm nhập vào cơ thể. H×nh 4.12. CÊu t¹o kh¸ng thÓ + Kháng thể là một loại protein có cấu tạo hình chữ Y nằm trên bề mặt tế bào B được tiết vào máu hay vào tế bào Lymph khi phản ứng với sự kích thích của kháng nguyên như vi khuẩn, virus, ký sinh hoặc cơ quan cấy ghép tạng. Kháng thể làm trung hoà kháng nguyên bằng cách bọc đặc thù với nó. + Cấu tạo một kháng thể (h×nh 4.12) gồm 2 chuỗi nhẹ, trọng lượng phân tử 17000 Dalton và 2 chuỗi nặng trọng lượng phân tử 35000 Dalton, liên kết với nhau bằng liên kết disulfide. Có 5 loại chuỗi nặng là μ, δ, γ, ε và α và 2 loại chuỗi nhẹ là κ và λ tương ứng mỗi loại lần lượt là IgM, IgD, IgG, IgE và IgA. Mỗi chuỗi lại bao gồm một vùng biến đổi VL và VH nằm ở đầu tận cùng gốc amin, vùng này khác nhau ở mỗi kháng thể và nhiều vùng ổn định ký hiệu là CL và CH, vùng này ít khác nhau. Chuỗi nhẹ chứa một vùng ổn định trong khi đó chuỗi nặng chứa tới 3 vùng ổn định và một nơi gấp khớp (hinge), giúp phân tử kháng thể có thể có khả năng linh động cấu hình hơn. Tính đặc thù bọc kháng nguyên được xác định bởi trình tự axit amin của các vùng V chuỗi nặng và nhẹ, vì thế mỗi phân tử kháng thể bọc được với 2 phân tử kháng nguyên. + Kháng thể là một protein được tìm thấy ở trong máu, có đặc tính phản ứng đặc thù với kháng nguyên tương ứng. Kháng thể đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại bệnh tật, phản ứng gây dị ứng, trong quá trình chuyền trộn máu, kháng thể được sử dụng trong nhiều phép thử tìm kháng nguyên đặc hiệu hoặc dự đoán khả năng miễn dịch. Kháng thể thường chưa có ở những cá thể lúc mới được sinh ra, chỉ trừ mộ