Bài giảng Sắc ký

22/02/2006 Lê Văn Dăng ĐHSP THỰC HÀNH HÓA HỮU CƠThí nghiệm tổng hợp Hữu CơÏ Ø ÙÙ ÕÕä å ïï õõ 22/02/2006 Lê Văn Dăng ĐHSP SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG É Ù Ä Ø É Ù Û Û 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP II- CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CÁC CHẤT HỮU CƠ A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 1- Sơ lược về sắc kí : Sắc kí là quá trình tách cấu tử của một hỗn hợp dựa vào việc các cấu tử này sẽ phân bố khác nhau giữa pha tĩnh và pha động.  Pha tĩnh có thể là cột nhồi (sắc kí cột), mà pha động là dung môi hữu cơ sẽ di chuyển ngang qua.  Pha tĩnh có thể là một lớp mỏng (sắc kí bảng mỏng) chất hấp phụ được tráng lên một nền phẳng bằng vật liệu thủy tinh, nhôm, lúc đó pha động sẽ được hút thấm lên lớp mỏng nhờ lực hút mao dẫn. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ  Trong sắc kí phân bố pha tĩnh là một lớp chất lỏng thật mỏng được hấp thụ lên bề mặt của một chất mang rắn, trơ, còn pha động là chất lỏng (sắc kí phân bố lỏng - lỏng) hoặc chất khí (sắc kí khí).  Trong cả hai trường hợp, sự tách sẽ tùy thuộc nhiều vào sự phân bố của dung chất giữa hai pha. Trên thực tế, quá trình này rất phức tạp do có sự tác động qua lại giữa việc các cấu tử được hấp thụ lên chất mang và việc tách cấu tử đó ra trong suốt quá trình sắc kí.  Trong sắc kí hấp phụ pha động thường là chất lỏng và pha rắn là chất hấp phụ rắn, nhuyễn; việc tách ở đây dựa vào sự hấp phụ có chọn lọc một số hợp chất nào đó của hỗn hợp lên bề mặt của chất rắn (sắc kí rắn - lỏng : dùng resin trao đổi ion để tách các hợp chất có tính axit hoặc bazơ như aminoaxit hoặc aminophenol). 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ  Ngoài ra còn có sắc kí lọc gel, việc tách các hợp chất dựa vào sự khác biệt về kích thước của các hợp chất. Trong kĩ thuật này, pha tĩnh là những hạt gel có dạng hình cầu, có những lỗ rỗng với kích thước qui định (nhà sản xuất có đủ cỡ để lựa chọn cho phù hợp với chất mình cần tách). Các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ sẽ chui vào trong các lỗ rỗng của các hạt gel và được giữ lại trong hạt gel, nghĩa là được giữ lại trong cột; các hợp chất có khối lượng phân tử lớn hơn nên không thể chui vào trong các lỗ rỗng của các hạt gel sẽ bị đuổi ra khỏi cột sắc kí trước tiên. Kỹ thuật này áp dụng cho các hợp chất có khối lượng phân tử lớn như protein, peptit, enzym, hormon... 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : Sắc kí cột là một phương pháp hiện đại, tinh vi để tách các cấu tử hóa học ra khỏi hỗn hợp chủa chúng. Nếu lựa chọn đúng các điều kiện, người ta có thể tách hầu hết các chất bất kì một hỗn hợp nào. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chúng ra, bao gồm : - Lựa chọn chất hấp phụ. - Sự lựa chọn dung môi giải li. - Kích thước cột sắc kí, khối lượng chất hấp phụ, lượng mẫu chất được dùng. - Vận tốc giải li. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : a) Chất hấp phụ : Lựa chọn chất hấp phụ tùy theo loại mẫu chất cần phân tích bằng sắc kí cột. Xenlulozơ, tinh bột, đường... dùng cho các nguyên liệu nguồn gốc thực vật, có chứa các nhóm chức nhạy cảm với các tương tác axit, bazơ. Silicat magie dùng để tách các chất đường, steroit, tinh dầu ... Silica gel, alumin, florisil là loại được sử dụng rộng rãi áp dụng cho các nhóm chức như hiđrocacbon, ancol, xeton, este, axit cacboxylic, hợp chất azo, amin.... Alumin tính axit có pH = 4 thường dùng để tách các hợp chất có tính chất axit như axit cacboxylic, aminoaxit. Alumin kiềm có pH = 10 để tách các amin. Alumin trung tính để tách nhiều lọai nguyên liệu không có tính axit và cũng không có tính bazơ. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : a) Chất hấp phụ : Cần biết rằng khi cho bột alumin hoặc silicagel vào một dung dịch có chứa một hợp chất hữu cơ, thì các phân tử của hợp chất hữu cơ đó sẽ bị hấp thu hoặc bị dính vào các hạt alumin. Có nhiều loại lực hút làm cho các phân tử hữu cơ dính vào hạt alumin, các lực hút này thay đổi tùy loại. Phân tử không phân cực sẽ gắn vào hạt alumin bởi lực hút Van-Đec-Van (Van-Der-Waasl) là loại lực hút yếu; thường thì phân tử không phân cực sẽ không gắn chặt vào alumin ngoại trừ khi chúng có khối lượng phân tử cực lớn. Các tương tác không tác thông dụng là các tương tác thường thấy trong các phân tử phân cực. Lực giảm dần của các lọai nối được xếp như sau : Sự thành lập muối > liên kết phối trí > liên kết hiđro > tương tác lưỡng cực > Van-Đec-Van. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : a) Chất hấp phụ : Lực nối thay đổi tùy loại hợp chất. Hợp chất mang các nhóm Định chức có tính phân cực càng mạnh sẽ càng bám chặt vào silica gel hoặc alumin. Về nguyên tắc, những hợp chất không phân cực sẽ đi ngang qua cột mau hơn những hợp chất phân cực là do nó có ái lực yếu đối với chất hấp phụ. Nếu chất hấp phụ gắn chặt tất cả các phân tử của dung chất, thì các chất đó sẽ không thể di chuyển xuống cột; ngược lại, nếu chọn phải một dung môi quá phân cực dùng để dung li, thì dung môi này sẽ giải li tất cả các dung chất (kể cả chất phân cực và chất không phân cực) ra khỏi cột và như thế thì không thể thực hiện được sự tách li bằng sắc kí cột 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : a) Chất hấp phụ : Có nhiều lọai chất hấp phụ dùng cho sắc kí cột, được phân loại tùy theo khả năng bám của chúng vào các phân tử phân cực; được sắp xếp theo mức độ tăng dần như sau : Giấy, xenlulozơ, tinh bột, đường, Na2 CO3 , CaCO3 , Ca3 (PO4 )2 , MgCO3 , Ca(OH)2 , silica gel, florisil (MgSiO3 ), MgO, alumin (kiềm, axit, trung tính), than hoạt tính. Các loại thường dùng có bán sẵn là alumin, hoặc silica gel với kích cỡ hạt gel 50-239m sẽ giúp cho việc nhồi cột tương đối chặt chẽ và đạt được vận tốc giải li vừa phải dưới tác động của sức hút trọng lực 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : b) Lựa chọn dung môi giải li : Lựa chọn dung môi nào có thể hòa tan được mẫu chất sắc kí. Nếu mẫu chất ở dạng dung dịch thí dụ dung dịch trích li từ cây cỏ, phải làm bay hơi dung dịch này đến khô dưới áp suất thấp rồi hòa tan mẫu chất trở lại với một lượng tối thiểu dung môi lọai ít phân cực nhất nếu có thể được. Dung dịch càng đậm đặc thì sẽ tạo thành một dãy băng sắc mỏng trong cột giúp quá trình tách li được hiệu quả. Thông thường, dùng dung môi kém phân cực nào có thể tan mẫu thì được chọn làm dung môi để nạp chất hấp phụ vào cột và dĩ nhiên đây cũng là dung môi đầu tiên của quá trình giải li. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : b) Lựa chọn dung môi giải li : Thử nghiệm chọn dung môi giải li thích hợp : với một mẫu chất mới chưa có tài liệu tham khảo, thì phải lựa chọn chất hấp phụ và dung môi giải li. Muốn vậy, phải nhờ kỹ thuật sắc kí bảng mỏng (xem phần sắc kí bản mỏng) với bảng alumin hoặc silica gel, nếu không tách tốt mới phải tìm loại chất hấp phụ khác. Thiết lập một loạt thử nghiệm với những bình triển khai sắc kí bảng mỏng trong mỗi bình chứa một trong các dung môi với độ phân cực tăng dần : hexan, benzen, clorofom, ete etylic, axetat etyl, axeton, metanol. Các tấm bảng mỏng có chấm mẫu chất như nhau rồi nhúng mỗi tấm vào mỗi bình chứa dung môi khác nhau như đã chuẩn bị. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : b) Lựa chọn dung môi giải li : Ghi nhận độ di dộng của của các cấu tử trong mẫu : Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử mằm lại tại chỗ mức xuất phát hoặc di chuyển hết lên mức tiền tuyến dung môi thì dung môi đó không phù hợp. Nếu qua quá trình triển khai mà nhận thấy hệ thống đơn dung môi như vừa làm nêu trên không cho những vết gọn, rõ, sắc nét thì cần triển khai hệ thống gồm hỗn hợp dung môi, thí dụ như hỗn hợp toluen- metanol, hoặc hexan-etyl axetat..... 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : b) Lựa chọn dung môi giải li : Cần hiểu kết quả phân tích trên sắc kí bảng mỏng sẽ tốt, đẹp hơn trên sắc kí cột. Toluen là loại dung môi có độ phân cực trung bình và có thể áp dụng để tách nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau. Nếu mẫu nguyên liệu đầu là các hiđrocacbon thì nên dùng hexan, ete dầu hỏa, benzen, toluen. Các hỗn hợp ete dầu hỏa-toluen; hexan-toluen; ete dầu hỏa-ete etylic; hexan-ete etylic;....có độ phân cực trung bình và thường rất thích hợp để tách nhiều lọai hợp chất thông dụng khác nhau. Các mẫu nguyên liệu có tính phân cực nên dùng etyl axetat, axeton, metanol, etanol. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : b) Lựa chọn dung môi giải li : Dung môi dùng để giải li phải là dung môi tinh khiết, nếu không tinh khiết phải chưng cất lại trước khi sử dụng, đặc biệt các dung môi hiđrocacbon là loại dễ cho nhiều cặn hơn các loại dung môi khác. Các dung môi thường dùng để sắc kí cột được trình bày theo thứ tự tăng dần về độ phân cực mà khả năng mà dung môi đó có đối với những nhóm chức phân cực như sau : Ete dầu hỏa, hexan, xiclohexan, cacbon tetraclorua, benzen, toluen, điclometan, clorofom, ete etylic, etyl axetat, axeton, piriđin, propanol, etanol, nước, axit axetic. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : b) Lựa chọn dung môi giải li : Thường thường, nên bắt đầu bằng một dung môi không phân cực để loại một cách tương đối các hợp chất không phân cực ra khỏi cột và kế đó dung môi giải li sẽ được tăng dần độ phân cực để đuổi các hợp chất có tính phân cực hơn. Muốn thay đổi một dung môi có tính phân cực hơn, thì phải thay đổi từ từ bằng cách cho thêm vào mỗi lần vài phần trăm một lượng dung môi có tính phân cực hơn vào dung môi đang giải li. Thí dụ đang giải li với hexan, sau đó muốn đổi sang toluen thì phải thêm từ từ theo tỉ lệ 99 : 1 ( nghĩa là 99 ml hexan và 1 ml toluen); 98 : 2; 95 : 5; 90 : 10; 70 : 30; 50 : 50; 10 : 90; 0 : 100. Nếu cho thêm vào vội vã, đột ngột thì sẽ làm gãy cột do alumin hay silica gel được trộn với dung môi sẽ tạo ra nhiệt, nhiệt này khiến cho dung môi bốc hơi một cách cục bộ, hơi sinh ra sẽ tạo bọt khí và làm nứt gãy cột ; cột gãy thì khả năng tách của cột kém đi. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : b) Lựa chọn dung môi giải li : Thông thường, hợp chất không phân cực di chuyển nhanh và được giải li ra khỏi cột trước; còn các hợp chất phân cực sẽ di chuyển chậm hơn, lưu ý là khối lượng phân tử cũng có liên quan đến thứ tự các chất được giải li : một hợp chất không phân cực và có khối lượng phân tử lớn sẽ di chuyển chậm hơn một hợp chất không phân cực và có khối lượng phân tử nhỏ. Thứ tự tương đối các hợp chất được giải li ra khỏi cột là : 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : b) Lựa chọn dung môi giải li : Lọai chất được giải li ra khỏi cột Mức độ giải li Thứ tự giải li Ankan Anken, ankin xicloankan, xicloanken Hiđrocacbon thơm (aren)Xeton Anđehit Este Ancol, thiol Amin Phenol, axit cacboxylic Giải li ra sớm (với dung môi không phân cực) Giải li ra chậm (cần dung môi phân cực) 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : b) Lựa chọn dung môi giải li : Cần hiểu thêm khi dùng các chất hấp phụ là alumin hay silica gel; nhất là khi môi trường có điều kiện axit hoặc kiềm với họat tính cao, dung môi axeton sẽ cho phản ứng anđol hóa để tạo thành ancol đixeton. Còn khi dùng dung môi là etyl axetat và có thêm một ancol khác nữa để làm dung môi thì sẽ có thể có hỗn hợp của các este do sự trao đổi este. Khi dùng các dung môi có dạng hoạt động cao như piriđin, metanol, nước, axit axetic... chúng có thể hòa tan và giải li một số chất hấp phụ..... 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : c) Kích thước cột sắc kí và lượng chất hấp phụ : Kích thước cột sắc kí và lượng chất hấp phụ cần được lựa chọn thích đáng để có thể tách tốt các mẫu cần sắc kí. Thông thường, khối lượng phân tử chất hấp phụ phải nặng gấp 25 -50 lần khối lượng mẫu chất cần sắc kí và cột sắc kí và cột sắc kí cần có kích cỡ là chiều cao phần chất hấp phụ trong cột sắc kí cần thỏa tỉ lệ chiều cao 8 : 1. Tuy nhiên, đối với các hợp chất khó tách thì có thể dùng cột lớn hơn và lượng chất hấp phụ nhiều hơn. Mẫu sắc kí (gam) Khối lượng chất hấp phụ (gam) Đường kính cột (mm) Chiều cao cột (mm) 0,01 0,3 3,5 30 0,1 3,0 7,5 60 1,0 30,0 16 130 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : d) Vận tốc giải li : Mẫu chất cần phân tách bằng sắc kí cột cần lưu lại trong cột một thời gian vừa đủ lâu để đạt được sự cân bằng giữa pha động và pha tĩnh; nhờ thế các chất khác nhau trong một hỗn hợp mới có thể được tách riêng nhau ra : trong thời gian này tùy thuộc vào vận tốc giải li. Nếu vận tốc giải li quá nhanh, các dung chất trong hỗn hợp mẫu chưa đủ thời gian để tạo cân bằng với chất hấp phụ khi chúng đi ngang cột. Nếu vận tốc giải li ra chậm, các hợp chất riêng biệt của hỗn hợp sẽ phân tán lẫn vào nhau trong dung môi giải li, việc phân tán sẽ nhanh hơn là việc chúng được làm di chuyển xuống dưới cột, và như thế, các dãy băng phân li sẽ rộng hơn, có thể làm cho dãy này trùng chập vào dãy kia, làm cho việc tách các chất ra khó hơn. Nếu vận tốc giải li quá chậm, hoặc ngưng quá trình giải li lại một thời gian hoặc ngưng lại qua đêm, thì các dung chất sẽ bị phân tán khắp mọi hướng, làm xấu đi việc tách. Đa số các trường hợp, vận tốc giải li nằm trong khoảng 5-50 giọt/ phút. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : e) Kỹ thuật nhồi cột : Cần tuân theo các kỹ thuật hướng dẫn để có được cột nhồi chặt chẽ, đồng đều, không bọt khí, không nứt gãy. Cột sắc kí là một ống thủy tinh dưới đáy có một robinet khóa; cột được bắt vào giá ở vị trí thẳng đứng, dưới cột có một bese hứng, dưới đáy cột có đặt một lớp bông gòn mỏng khoảng 2-3 mm, lớp bông gòn này có tác dụng giữ cho chất hấp phụ không tuột ra khỏi cột. Cho một loại dung môi không phân cực như benzen vào 1/2 cột rồi để đó, chuẩn bị chất hấp phụ để nạp vào cột theo hai phương pháp; phương pháp khô và phương pháp sệt. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : e) Kỹ thuật nhồi cột : Phương pháp sệt : Tức là chất hấp phụ được nạp vào cột ở dạng sệt, dạng sệt này được chuẩn bị như sau : một bese có chứa sẵn một lượng dung môi có khối lượng gấp 5-10 lần khối lượng chất hấp phụ sẽ dùng (dung môi là lọai dung môi ít phân cực nhất, sẽ được dùng cho phần thực hành sắp làm); cho chất hấp phụ ở dạng khô vào bese từ từ mỗi lần một ít và khuấy đều, đến khi cho hết chất hấp phụ vào bese. Tiếp tục khuấy đều đến khi hỗn hợp đồng nhất và tương đối hết bọt khí. Không đư