Bài giảng Tổng hợp axit nhân và phương pháp PCR

CHƯƠNG XV Tæng hîp axit nh©n vµ PHƯƠNG PHÁP PCR I. Enzyme DNA polymerase và tổng hợp DNA trong ống nghiệm T¸i b¶n DNA trong èng nghiÖm vµ ®Æc tÝnh cña DNA polymerase - Tổng hợp DNA in vitro lần đầu tiên được tiến hành bởi Arthur Kornberg và cộng sự vµo năm 1957, nhờ đó năm 1959 ông được nhận giải thưởng Nobel. Ông đã phân lập được một enzyme từ E.coli lúc đầu gọi là DNA polymerase hay Kornberg enzyme, hiện nay chính là enzyme DNA polymerase I, enzyme này xúc H×nh 1.15. Ho¹t ®éng cña enzyme DNA polymerase cÇn ssDNA nguyªn b¶n ®Ó kÕt g¾n mồi có đầu 3’OH tự do, nhập từng nu một (NTP) vào chuỗi mới theo nguyên tắc bổ sung. Hình 2.15. Sơ đồ tổng quát quá trình tổng hợp DNA trong ống nghiệm và yêu cầu các thành phần phản ứng tác cho quá trình thêm các nucleotide cộng hóa trị vào chuỗi DNA đơn đang kéo dài. - Enzyme này đỏi hỏi C5’ cuả 4 deoxyribonucleotide có gắn trisphosphate (NTP). Enzyme chỉ hoạt động được khi có mặt của ion Mg2+ và sợi DNA có một mạch tiền kéo dài. Sợi DNA này phải có cả 2 chức năng vừa làm mồi và vừa làm khuôn xem h×nh 1.15, 2.15, 3.15 vµ 4.15. Hình 3.15. Tương tác của DNA polymerase 1 với nguyên bản template, đoạn mồi và các dNTPs nhập bổ sung vào chuỗi tổng hợp. - Quá trình tổng hợp yêu cầu cần DNA mồi, vì men DNA polymerase I không thể bắt đầu quá trình tổng hợp kéo dài nếu không có đoạn mồi tạo ra đầu 3’ có nhóm OH. Enzyme này xúc tác việc hình thành liên kết phosphodiester giữa đầu 3’OH của mạch DNA mồi và đầu 5’ phosphate của deoxyribonucleotide đến. - Phản ứng tổng hợp luôn theo hướng từ đầu 5’-3’. DNA khuôn (nguyên bản), DNA polymerase I không chứa đoạn đặc thù tự tạo được mồi như RNA polymerase, bởi vậy nó cần phải có chuỗi DNA khuôn làm mồi để đọc và bổ sung thông qua việc ghép cặp giữa các bazơ. - Trong vivo ®Ó th¸o xo¾n, t¹o m¹ch ®¬n nguyªn b¶n DNA vµ sinh måi ®ßi hái ph¶i cã sù tham gia cña nhiÒu enzyme vµ protein, nh­ng trong èng nghiÖm Arthur Kornberg vµ céng sù ®· dïng 3 nåi c¸ch thñy, ®iÒu chØnh t¹o chÕ ®é nhiÖt cho c¸c b­íc cña chu kú ph¶n øng, thay thÕ c¸c enzyme, protein trªn. Cô thÓ ®Ó th¸o xo¾n dïng nhiÖt ®é cao gÇn ®iÓm s«i, måi ®­îc tæng hîp nh©n t¹o, cho s½n tõ bªn ngoµi vµo vµ khi h¹ thÊp nhiÖt ®é xuèng kho¶ng 35 – 50 ®é th× måi sÏ tù g¾n vµo nguyªn b¶n n¬i cã tr×nh tù bæ sung. §Õn b­íc tæng hîp kÐo dµi sîi míi th× míi cho enzyme DNA polymerase I vµo, v× enzyme nµy cã nhiÖt ®é hoạt động thÝch hîp ë kho¶ng 37 C vµ bÊt ho¹t ë nhiÖt ®é s«i, v× thÕ ph¶i bæ xung enzyme th­êng xuyªn qua mçi chu kú. Nh­ vËy trong ph¶n øng chØ cÇn cã mÆt cña mét enzyme DNA polymerase, ®iÒu nµy rÊt thuËn lîi gióp chóng ta ®iÒu chØnh ®­îc ph¶n øng tèi ­u. Chu kú trªn lÆp ®i lÆp l¹i nhiÒu lÇn sÏ thu ®­îc mét l­îng lín DNA ®­îc nh©n lªn. 2. C¸c lo¹i DNA polymerase vµ chøc n¨ng Từ sau khi phát hiện ra DNA polymerase I, hiện người ta đã phân lập được nhiều DNA polymerase từ những sinh vật khác nhau. Như DNA polymerase I, II và III được tách ra và nghiên cứu từ E.coli và B.subtilis. Hình 4.15. Kéo dài chuỗi DNA theo hướng đầu 5’ – 3’ bằng cách nhập từng nu vào đầu 3’ OH tự do và hình thành liên kết cộng hoá trị phosphodiester - Tương tự có 3 DNA polymerase là a, b và g được phân tách từ một số loài sinh vật nhân chuẩn và gần đây nhất đã có thêm báo cáo về 1 loại DNA polymerase s mới, nó được tách ra và tìm thấy ở tuyến giáp bê và tủy xương thỏ. Như vậy, hiện có ít nhất 4 loại DNA polymerase tìm thấy ở sinh vật nhân thật. - Ở E.coli và B.subtilis thì 2 enzyme DNA polymerase I và III đóng vai trò chủ đạo, để khẳng định điều này người ta nghiên cứu đột biến poly A. Vi khuẩn nào có đột biến này thì DNA polymerase của nó vẫn giữ được tốc độ tái bản bình thường nhưng mất khả năng sửa chữa những sai hỏng trên phân tử DNA khi bị chiếu UV. Cũng qua nghiên cứu này chứng tỏ chức năng chính của DNA polymerase I là sửa chữa những sai hỏng DNA, một chức năng khác của DNA polymerase I là chịu trách nhiệm cắt bỏ những đoạn mồi RNA mà đã được dùng làm mồi trong quá trình để tổng hợp DNA. - Chức năng của DNA polymerase II chưa rõ, mặc dầu nó có chức năng sửa chữa DNA khi không có mặt của DNA polymerase I và III. Nhưng nó đóng vai trò quan trọng trong tái bản DNA vì ở cơ thể đột biến mất enzyme này nếu sinh trưởng trong điều kiện DNA polymerase III không có, thì quá trình sinh tổng hợp DNA bị dừng. - Hầu hết các DNA polymerase của sinh vật tiền nhân không những có hoạt tính tổng hợp DNA từ đầu 5’-3’ mà còn có hoạt tính phân rã (exonuclease) từ đầu 3’-5’. Exonuclease là enzyme phân rã axit nucleic từ những đầu nhất định, ngược với enzyme endonuclease phân rã axit nucleic bằng cách tạo ra vết cắt bên trong 2 sợi. Hầu hết các enzym DNA polymerase đều có cả 2 hoạt tính tổng hợp và phân rã. Hoạt tính phân rã exonuclease 3’-5’ là hoạt tính xúc tác việc cắt bỏ các nucleotide từng chiếc một từ đầu 3’ của chuỗi polynucleotide. Một số polymerase như pol. I của E.coli cũng có hoạt tính exonuclease 5’-3’, hoạt tính này không tìm thấy ở bất kỳ DNA polymerase của sinh vật nhân thật nào. Hình 5.15. Cơ chế đọc sửa (proofreading) nhờ hoạt tính phân rã 3’-5’ của enzyme DNA polymerase trong quá trình tái bản. Khi mồi có chứa 1 nu ở đầu 3’ ghép lỗi (a); Phản ứng trùng phân không thể tiến hành thay vào đó là hoạt tính phân rã 3’-5’ thực hiện cắt bỏ nu ghép lỗi (b); Sau đó thay thế nu bổ sung đúng và quá trình tổng hợp sợi đơn mới đầu 5’-3’ bắt đầu tiến hành. - Hoạt tính exonuclease là cần thiết giúp tạo độ chính xác cao trong quá trình sao chép DNA. H×nh 5.15 diễn giải khi có 1 bazơ đầu mồi ghép không bổ sung sẽ bị hoạt tính exonuclease của enzyme cắt bỏ rồi thay thế vào đó một bazơ bổ sung, sau đó enzyme DNA polymerase lại tiếp tục kéo dài kết thúc gắn nucleotide vào đầu 3’ của mạch mới cho đến khi hết mạch gốc. Chức năng này vô cùng quan trọng trong tái bản nguyên vẹn ®Ó tạo ra 2 phân tử DNA giống hệt như ban đầu. II. Tæng hîp vµ tinh läc oligonucleotide 1. Tæng hîp - §Ó tæng hîp thµnh c«ng một chuçi oligonucleotide th× ®Çu tiªn mçi nucleotide nguyªn liÖu ph¶i ®­îc b¶o vÖ ®Ó tr¸nh bÞ ph©n hñy trong qu¸ tr×nh ph¶n øng tæng hîp vµ c¸c nucleotide ®­îc nhËp vµo chuçi theo chiÒu tõ 3’ - 5’. VÊn ®Ò đặt ra lµ nªn chän nhãm chÊt b¶o vÖ nµo mµ sau nµy chóng ta dÔ dµng lo¹i bá ®Ó c¸c nucleotide trë l¹i tr¹ng th¸i b×nh th­êng. Cã 3 vÞ trÝ cña nucleotide cÇn ®­îc b¶o vÖ lµ gèc amin (N-2, N-6 vµ N-4) cña các baz¬ nit¬ lÇn l­ît là Guanine, Adenine, Cytidine vµ gèc 5’ OH vµ 3’ OH cña ®­êng deoxyribose H×nh 6.15. ChÊt b¶o vÖ vµ vÞ trÝ b¶o vÖ c¸c baz¬ nit¬ - H×nh 6.15 tr×nh bÇy ph­¬ng ph¸p dïng isobutyryl g¾n vµo N-2 cña Guanine vµ benzoyl g¾n vµo N-6 cña adenine vµ N-4 cña cytidine, c¸c gèc nµy sau khi tæng hîp xong oligonucleotide cã thÓ ®­îc lo¹i bá b»ng ph¶n øng ph©n gi¶i amino. Gèc 5’ OH cña ®­êng deoxyribose cã thÓ ®­îc b¶o vÖ bëi dimethoxytrityl(DMT) hoÆc monomethoxytrityl (MMT), hai chÊt nµy ®­îc lo¹i bá bëi axit trung tÝnh cø sau mçi hai chu kú tæng hîp. Cßn gèc 3’ OH cña ®­êng ®­îc b¶o vÖ b»ng c¸ch g¾n gèc phosphoramidine. Oxy trong gèc phosphate cña phosphoramidine ®­îc che khuÊt bëi methoxy hoÆc beta-cyanoethoxy. H×nh 7.15. C¸c b­íc trong chu kú tæng hîp oligonucleotides - Mét chu kú tæng hîp gåm 4 b­íc (h×nh 7.15): + Baz¬ ®Çu tiªn sau khi g¾n vµo cét th× ®­îc xö lý b»ng axit dichloroacetic (DCA) trong chloromethane ®Ó lo¹i bá DMT ra khái ®Çu 5’ OH cña ®­êng, sau ®ã gèc OH nµy trë thµnh ho¹t hãa vµ cho phÐp baz¬ thø 2 g¾n vµo ®ã, tiÕp theo chÊt DCA ®­îc lo¹i bá khái cét b»ng dung dÞch acetonitrile ®Ó ng¨n c¶n viÖc h×nh thµnh detritylation sím víi phosphoramidite c¹nh. NÕu qu¸ tr×nh nµy xÈy ra kh«ng hoµn toµn sÏ cã thÓ h×nh thµnh lªn mét nucleotide dimer, kÕt qu¶ sÏ t¹o ra mét tr×nh tù oligo cã n + 1 nu, trong ®ã cã 2 nu ®ång thêi ®­îc nhËp vµo cét cïng mét lóc. + Khi cã mÆt cña chÊt phosphoramidite kÕt hîp víi mét chÊt ho¹t ®éng m¹nh lµ tetrazole (pH = 4,8) th× gèc OH cña baz¬ ®­îc b¶o vÖ tiÕp theo sÏ ®­îc g¾n vµo vÞ trÝ diisopropyl t¹o thµnh liªn kÕt phosphate kh«ng bÒn, chÊt nµy rÊt dÔ dµng bÞ ph©n c¾t bëi axit hoÆc baz¬. §Ó ph¶n øng tiÕn hµnh hoµn toµn thµnh c«ng th× ng­êi ta th­êng cho l­îng tetrazole vµo d­ thõa. + §èi víi nh÷ng chuçi kh«ng kÐo dµi ®­îc ë b­íc 2, ®Ó tr¸nh kh«ng t¹o ra chuçi cã n – 1 nu th× ng­êi ta ph¶i tiÕn hµnh b­íc 3 nµy, lµ b­íc ®éi mò tøc g¾n gèc acetyl vµo gèc OH cña baz¬ kh«ng kÐo dµi thµnh c«ng ë b­íc 2, thêi gian tiÕn hµnh kho¶ng 2 phót, chuçi cã ®Çu baz¬ ®éi mò nµy sÏ kh«ng ®­îc tiÕp tôc tham gia vµo ph¶n øng kÐo da× tiÕp n÷a. + B­íc 4, b­íc cuèi cïng cña chu kú lµ tiÕn hµnh oxy hãa liªn kÕt phosphate kh«ng bÒn v÷ng b»ng 0,1 M iodine t¹o thµnh liªn kÕt phosphate bÒn v÷ng. TiÕp ®Õn chu kú tiÕp theo l¹i lµ ph¶n øng lo¹i bá 5’ DMT khái baz¬ võa míi nhËp vµo råi lËp l¹i c¸c b­íc cña chu kú míi. - ViÖc hoµn thµnh tæng hîp xong c¸c nu muèn tæng hîp, ®­îc thùc hiÖn qua m¸y tæng hîp oligonucleotide ®· ®­îc lËp tr×nh s½n. KÕt thóc viÖc tæng hîp, th× trityl cÇn ®ùîc c¾t bá b»ng c¸ch röa cét b»ng axit. Sau ®ã oligonucleotide ®­îc t¸ch rêi khái cét b»ng c¸ch röa b»ng ammonium hydroxide ®Ëm ®Æc. 2. Tinh läc - Hßa tan pellet kÕt tña mµu tr¾ng víi n­íc sau ®ã thªm MgCl2 ®Ó ®­îc nång ®é 10 mM råi trén lÉn. KÕt tña b»ng ethanol víi thÓ tÝch gÊp 5 lÇn, råi ®Ó l¹nh mét lóc ë nhiÖt ®é – 20 ®Õn – 70C sau ®ã quay ly t©m råi l¹i röa l¹i b»ng ethanol vµ hßa tan vµo n­íc hoÆc dïng ngay cho c¸c môc ®Ých kh¸c nhau. - Cã thÓ ph©n t¸ch c¸c oligonucleotide theo kÝch th­íc b»ng ph­¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel polyacrylamid biÕn tÝnh (PAGE) chøa mét l­îng nhá phenol hoÆc urea. Ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ ph©n t¸ch ®­îc c¸c ®o¹n oligonucleotide dµi tõ 2 ®Õn 300 baz¬ tïy nång ®é polyacrylamide sö dông. §iÖn di xong tiÕn hµnh c¾t lÊy b¨ng DNA trªn gel r«i ¸p dông ph­¬ng ph¸p th«i DNA ra khái b¨ng gel. III. Ph­¬ng ph¸p PCR 1. Khái niệm về PCR Hiện nay người ta dùng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) để có thể nhân bất kỳ một đoạn gen nào trong cơ thể sinh vật, chỉ cần sử dụng 2 đoạn nucleotide mồi ở đầu 5' và đầu 3' của đoạn đó, nếu gen đó đã biết trước được trình tự sắp xếp các nucleotide của nó hoặc có thể dùng một đoạn mồi bất kỳ nào để nhân ngẫu nhiên bất kỳ một đoạn DNA nào. Sau đó phân tách bằng điện di trên gel agarose rồi thanh lọc và nạp vào plasmid vector rồi nhập vào E.coli, nhân nhiều lên, khảo sát và chọn lọc . Hình 6.15. Phương pháp thiết kế mồi nhân đoạn gen cần quan tâm khi đã biết trình tự PCR là một kĩ thuật nhằm nhân bản phân tử DNA hoặc đoạn DNA nhất định, lặp đi lặp lại qua nhiều chu kì trong ống nghiệm cho đến khi thu được một khối lượng mong muốn. Phương pháp này do nhà hoá sinh kiêm nhà thơ tên là Kary Mullis phát hiện vào năm 1984 và sau đó đã được tặng giải thưởng Nobel. Thành công chính của phương pháp là việc phát hiện ra enzyme DNA polymerase hoạt động tốt ở nhiệt độ cao tới 100oC nhưng không có khả năng đọc sửa. 2. Nguyên lý phuơng pháp PCR a. Nguyên lý PCR là phuơng pháp dựa trên cơ sở khả năng tái bản phân tử DNA ở ngoài cơ thể sinh vật. Về nguyên tắc, để tái bản, phân tử DNA cần có một số yếu tố sau: Men DNA polymerase; 4 deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs); MgCl2; 2 hoặc một đoạn nucleotide mồi; và trong môi tr­ờng muối đệm. Tất cả được trộn lẫn với một l­ợng nhỏ DNA nguyên bản. Sau một số chu kì phản ứng nhiệt, có thể nhân được một lượng lớn DNA từ nguyên bản DNA ban đầu. Hình 7-15 trình bầy nguyên lý nhân bản DNA bằng phương pháp PCR. Để nhân bất kì một đoạn DNA nào nếu biết trước được trình tự sắp xếp các nucleotide trên mạch của nó, thì việc đầu tiên là phải thiết kế và tổng hợp hai đoạn mồi thường dài từ 20 đến 30 nucleotide đối xứng với các bazơ ở đâù 5' và đầu 3' của đoạn DNA định nhân. Trình tự chu kì phản ứng bắt đầu từ việc tách sợi DNA kép thành 2 sợi đơn bằng nhiệt độ cao gần với nhiệt độ điểm sôi của nước thường là 94oC trong vòng 5 phút, sau đó khi nhiệt độ giảm xuống còn 30-60o C thì hai đoạn mồi sẽ tiếp cặp với 2 đầu đối xứng 5 'và 3' của đoạn DNA đơn nguyên bản gọi là quá trình annealing kéo dài 3 giây. Khi nhiệt tăng lên 65-750C, men Taq polymerase xúc tác, quá trình tổng hợp sợi đơn DNA mới từ đầu 3' đến đầu 5' kéo dài 2-5 phút. Sợi mới này được kéo dài đến hết sợi đơn đầu 3' của DNA nguyên bản. Lúc này sợi DNA kép có 2 sợi đơn,1 nguyên bản, 1 mới được tổng hợp lên, nh­ vậy hoàn thành xong 1 chu kì. Tiếp đến chu kì H×nh 7.15. S¬ ®å nguyªn lý cña ph¶n øng PCR thứ hai, sợi DNA mới tổng hợp trên được đun nóng thì hai đôi lại tách ra, 1 nguyên bản và 1 sợi đơn mới gọi là quá trình denature và sẽ có 4 vị trí để hai đoạn mồi tiếp cặp, tại 2 vị trí ở 2 sợi đơn nguyên bản còn 2 vị trí còn lại nằm ở 2 sợi đơn mới (d). Để đơn giản hoá sơ đồ chúng ta bỏ qua từ bước (b) đối với 2 sợi đơn nguyên bản. Giai đoạn từ tiếp cặp ở chu kì 2 của hai sợi mới tổng hợp sẽ diễn biến nh sau: khi trở lại nhiệt độ thích hợp thì quá trình tổng hợp sợi DNA đơn mới lại được tiến hành nhờ enzyme Taq polymerase, nhưng việc kéo dài của chuỗi mới này sẽ dừng lại tại một vị trí chính xác tuỳ thuộc vào chiều dài đoạn gen cần nhân (c). Hai sợi mới được kéo dài và dừng một cách chính xác đúng tại đầu bên kia, nơi mà đoạn mồi khác tiếp cặp. Tiếp đến chu kì 3 lại bắt đầu từ việc tách sợi kép DNA, có cả 2 sợi đơn đều mới tổng hợp, 4 vị trí để các đoạn mồi tiếp cặp đã cố định ở hai đầu của 2 sợi DNA mới (f). Khi DNA bước vào giai đoạn tổng hợp kéo dài sẽ tạo ra 2 sợi DNA mới có chiều dài bằng đúng chiều dài đoạn DNA cần nhân. Lượng DNA genome ban đầu dùng cho PCR cần rất ít thường ít hơn 1mg, thậm trí về lí thuyết kỹ thuật PCR chỉ cần 1 phân tử DNA là đủ và cũng không cần phải tách đoạn DNA cần nhân ra khỏi hỗn hợp DNA genome. Vì rằng cặp đoạn mồi đã tìm đúng đoạn đối xứng và xác định một cách chính xác giới hạn của nó. Phản ứng được lặp đi lặp lại khoảng 30 đến 60 chu kì và số phân tử DNA nhân được lên tính theo công thức sau: N=2(A-2), trong đó N là số đoạn DNA sẽ được nhân lên, A là số chu kì phản ứng trừ đi 2 vì ở 2 chu kì đầu không nhân được một phân tử DNA nào. Có thể tóm tắt các bước của chu kì phản ứng chuỗi PCR theo sơ đồ sau: Tách 2 sợi đơn từ sợi DNA kép (940C,5 phút) Giai đoạn tách 2 sợi đơn từ sợi DNA kép (940C,30 giây) Tiếp cặp giữa đoạn mồi với đoạn bổ sung của sợi DNA đơn (30-650C, trong 3 giây) Tổng hợp sợi DNA đơn mới (65-750C, trong 2-5 phút) b. Thành phần của phản ứng PCR - Nước vô trùng:100 mM MgCl2; 10 x dung dịch đệm (10 x amplication bufer); hỗn hợp 2 mM của 4dNTP(ATP,GTP,CTP,TTP). - 50mM đoạn mồi 1 và 2, đoạn mồi thường dài từ 15 đến 30 nucleotide. - 15mg DNA nguyên bản trong 1 ml dung dịch phản ứng. - 2,5 đơn vị hoạt tính enzyme Taq polymerase trong 1ml dung dịch phản ứng. - Số chu kì thường là 30 đến 40, nh­ vậy số phân tử DNA được nhân lên sau A chu kì sẽ là N = 2(A-2). c.Vai trò enzyme TAQ polymerase Trước khi ch­a phát hiện ra enzyme Taq polymerase, người ta đã phải dùng enzyme DNA polymerase của vi khuẩn E.coli để tổng hợp DNA ngoài ống nghiệm. Enzyme này có nhựơc điểm là rất mẫn cảm với nhiệt độ cao, cần thiết cho việc tách sợi kép DNA. Do vậy trong quá trình phản ứng người ta phải thêm thường xuyên enzyme này vào đúng thời điểm sau tách sợi, khi nhiệt độ đã hạ thấp. Đây là việc làm rất vất vả và tốn công sức, đặc biệt nếu nh tiến hành cùng một lúc nhiều phản ứng và qua nhiều chu kì. Một trong những tiến bộ trong sinh học phân tử là người ta đã phát hiện ra loài vi khuẩn có tên là Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng có nhiệt độ 750C. Enzyme DNA polymerase của vi khuẩn này có tên là Taq polymerase (Taq là chữ viết tắt của tên vi khuẩn) giữ được hoạt tính ở nhiệt độ cao, nhiệt độ tối ­u là 720C và tương đối bền vững ở nhiệt độ 940C. Như vậy chỉ cần cho Taq polymerase vào một lần cùng với hỗn hợp phản ứng thì hoạt tính của enzyme vẫn được duy trì trong suốt mấy chục chu kì phản ứng. Điều này đã cho phép tự động hoá tất cả các bước nhân DNA nhờ tạo ra một máy tự động có khả năng điều khiển được các công đoạn cả về nhiệt độ và thời gian. Một ­u điểm nữa là Taq polymerase có khả năng chuyên hoá và mẫn cảm cao, enzyme DNA polymerase của E.coli hoạt động ở nhiệt độ thấp, mà tại nhiệt độ thấp này các đoạn mồi có sai khác một chút so với sợi đơn nguyên bản thì vẫn có khả năng tiếp cặp. Chính những sai lầm trong khi tiếp cặp ban đầu này đã dẫn đến việc tổng hợp sai đoạn gen mong muốn, khi dùng enzyme Taq mọi bước đều tiến hành ở nhiệt độ cao nên đã loại trừ hoàn toàn được những sai lệch khi tiếp cặp. Ngoài Taq ra hiện nay người ta còn phát hiện thêm 2 enzyme polymerase nữa là Vent và Pfu, cũng là enzyme chịu nhiệt như Taq nhưng lại có thêm khả năng đọc sửa. d. Độ tin cậy của PCR Cũng nh­ tất cả các quá trình sinh học khác, tái bản DNA là một quá trình không tuyệt đối hoàn hảo, thỉnh thoảng enzyme DNA polymerase cũng nhận nhầm một vài nucleotide không bổ sung vào chuỗi đang kéo dài của mình, tỷ lệ này trong tự nhiên là 1/106. Rất may trong tế bào sinh vật sống có một bộ máy nhằm loại bỏ những bagzơ không bổ sung, còn ở trong in vitro, Taq polymerase không có khả năng sửa chữa do nhận nhầm này. Do vậy cứ tổng hợp 2 x 104 nucleotide bằng PCR thì có 1 nucleotide không chính xác Tuy nhiên sai sót này không trầm trọng lắm vì trong ống nghiệm cùng một lúc xẩy ra tập hợp nhiều phản ứng, cùng nhân một đoạn DNA giống nhau cho nên số DNA có 1 nucleotide sai sót là không nhiều. Tuy vậy nếu dùng DNA này làm vật liệu ban đầu để nhân tiếp qua plasmid véctơ trong vi khuẩn E.coli thì có thể cũng gây nguy hiểm. Vì mỗi dòng vô tính plasmide chứa một đoạn DNA được nhân qua PCR, nếu đoạn DNA đó có chứa một vài nucleotide nhầm lẫn thì tát cả các mẩu khác từ dòng này đều có chung một đột biến tương tự. Để khắc phục cần dùng một lượng lớn DNA nguyên bản và giảm số chu kì nhân xuống để chỉ cần thu được it số phân tử DNA nhân. e. Nguồn DNA cho PCR DNA dùng cho PCR chủ yếu được chiết xuất từ mô tế bào sống, PCR không đòi hỏi DNA tinh khiết, có thể dùng DNA được thải ra khi luộc mô tế bào và đoạn DNA cần nhân không cần phải tách lọc ra trước khi nhân PCR. cDNA cũng có thể dùng làm nguyên liệu cho PCR. Để nhân đoạn gen ngoại ch­a biết bất kì nào trong vectơ tái tổ hợp, thì chỉ cần có 2 đoạn mồi ở 2 đầu mép của vùng nhân gen của vectơ, rồi chạy PCR. Các vectơ bán trên thị trờng hiện nay đều biết rất rõ bản đồ trình tự nucleotide trên phân tử DNA của nó, cho nên việc thiết kế 2 đoạn mồi là đơn giản hoặc được thiết kế trước và bán kèm sẵn. Chính vì thế mà PCR được ứng dụng rộng rãi trong việc xác định các vectơ tái tổ hợp, và đoạn DNA nào của genome được lồng vào vectơ và nó dài bao nhiêu. DNA rất bền vững nếu không có mặt của men DNase, người ta có thể dùng DNA từ nhiều nguồn khác nhau. Ví dụ có thể dùng DNA virut papilloma của người được tách từ mô ung th­, virut này đã lồng vào parafin và cất giữ trên 40 năm. Những mẫu bảo quản khô bộ phận người, trong xương người, động vật và thực vật. Thậm trí người ta đã dùng DNA của cả những sinh vật đã hoá thạch nhiều báo cáo cũng cho biết có kết quả. 3. Những điểm chú ý khi tiến hành nhân gen bằng phương pháp PCR - Nhiệt độ kết gắn mồi nếu quá thấp, mồi sẽ kết gằn nhầm nhiều nơi, dẫn đến chúng ta có thể nhân và thu được nhiều đoạn không đặc hiệu Nhưng nếu nhiệt độ kết gắn quá cao chúng ta có thể không nhân được đoạn DNA mong muốn. Nhiệt độ kết gắn nên thấp hơn nhiệt độ nóng chẩy của mồi khoảng từ 3 – 5oC. Có thể tham khảo cách tính Tm mồi như sau : Tm = 4(G + C) + 2(A + T). - Cả hai mồi nên có cùng Tm để chúng có thể kết gắn ở cùng một nhiệt độ. - Hai trong số 3 bazơ cuối đầu 3 ‘ của mồi nên chọn có G hoặc C để quá trình kết gắn xẩy ra dễ hơn. - Để tránh mồi tạo thành dimer (mạnh kép) khi thiết kế mồi cần tránh chọn nơi 2 đầu của 2 mồi có trình tự bổ sung nhau. Nếu xẩy ra hiện tượng dimer thì phản ứng nhân DNA sẽ không xẩy ra. - Nồng độ Mg++ nên từ 1,5 – 3 mM, nếu cao hơn thì dễ làm cho enzyme Taq tổng hợp nhầm nhiều nu. - Khi thiết kế phản ứng không nên cho quá nhiếu Taq polymerase vì có thể gây ra hiện tượng nhân những đoạn không đặc thù. Mặt khác cũng không nên cho quá nhiều DNA nguyên bản vào phản ứng. III. Ph­¬ng ph¸p RAPD - VÒ c¬ b¶n nguyªn lý cña ph­¬ng ph¸p RAPD gièng hoµ