Báo cáo Phương pháp sắc ký

Tiểu luận nhóm 3 Đề tài: GVHD: TH.S NGUYỄN XUÂN TÒNG Giới thiệu về một số Phương pháp sắc ký Đại cương về phương pháp sắc ký Các kỹ thuật định lượng của phương pháp sắc ký hiện đại Ứng dụng Nội dung thuyết trình Đại cương về phương pháp sắc ký - Phương pháp sắc ký do nhà bác học người Nga Mikhail Tewett ( 1872-1919) phát minh vào năm 1903 -Ông đã dùng cột chứa oxit nhôm tách các pigment của lá cây thành các vùng màu riêng biệt và đặt tên là sắc ký (chromatogrphy) PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ Russian Botanist Thí nghiệm sắc ký củaTswatt Phương pháp sắc ký ngoài khả năng tách còn là một trong những phương pháp phân tích định tính và định lượng các cấu tử có độ chính xác . Là quá trình tách dựa trên sự dịch chuyển hỗn hợp phân tích qua một lớp chất cố định ( được gọi là pha tĩnh)nhờ vào chất mang thường là khí hoặc lỏng ( được gọi là pha động). Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký: Người ta dựa vào trạng thái của pha động mà chia thành hai loại chính . Sắc ký lỏng và sắc ký khí , dựa vào cơ chế trao đổi của các cấu tử với pha tĩnh và pha động Phân loại sắc ký Trong phương pháp sắc ký khí, sự chuyển nồng độ chất phân tích X giữa pha động và pha tĩnh. Cân bằng của một cấu tử trong hệ sắc ký được mô tả bằng phương trình đơn giản sau: Apha động Apha tĩnh (1) Hằng số cân bằng của cân bằng (1)còn được gọi là hằng số phân bố được tính như sau: Hệ số phân bố Trong đó : Cs: : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh. Cm: nồng độ cấu tử trong pha động . Hệ số K tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh, pha động, và chất hòa tan. K càng nhỏ thì pha tĩnh giữ lại ít và ra càng nhanh ngược lại k càng lớn thì chất phân tích ra càng chậm. Thời gian lưu : là thời gian cần thiết để cấu tử đi từ đầu cột đến cuối cột hay chính là thời gian cấu tử bị lưu giữ trong cột . Hiệu số giữa thời gian lưu và thời gian lưu chết gọi là thời gian lưu đã hiệu chỉnh (tR’) tR’= tR – tM TM và TR là các giá trị nhận được từ sắc ký đồ Thời gian lưu 1 Hệ số chọn lọc Là đại lượng đặt trương cho khả năng tách của các cấu tử khác nhau trong hỗn hợp chất khảo sát . Hệ số chọn lọc α của cột đối với cấu tử A và B định nghĩa như sau: 1 KA ,KB:là hệ số phân bố của cấu tử A và B - Hệ số chọn lọc phụ thuộc vào bản chất của A,B, pha động, pha tĩnh và nhiệt độ . - Hệ số chứa hay còn gọi là dung lượng là một thông số quan trọng được sử dụng trong sắc ký ( ký hiệu là K’) - K tùy thuộc vào bản chất tan, pha động và pha tĩnh và pha động .K’ tùy thhuộc vào các yếu tố trên vừa phu thuộc vào các đặt tính của cột . Lý thuyết đĩa Martin và Synge - Được áp dụng cho quá trình sắc ký vào năm 1942. Theo thuyết này, cột sắc ký được xem như gồm nhiều phần nhỏ gọi là đĩa. Trong mỗi đĩa, cân bằng vật chất được thiết lập rất nhanh giữa pha động và pha tĩnh . Số đĩa được biểu hiện ở hệ thức sau: Trong đó : N: số đĩa lý thuyết của cột L:chiều dài của lớp chất nhồi tronh cột H: chiều cao của đĩa lý thuyết W, W1/2: bề rộng đáy mũi sắc ký , mũi sắc ký 1/2 Độ phân giải - Là đại lượng đặt trương cho quá trình tách của các chất ra khỏi nhau ( ký hiệu Rs) - Mối liên hệ giữa Rs,K’,N và α qua công thức : - Để tăng Rs để tách hai mũi ra khỏi nhau, ta có thể thay đổi: +Tăng ΔtR=tR2 – tR1 khi đó 2 mũi thang sẽ tách xa hơn. +Giảm W1,W2 khi đó 2 mũi thang nhọn hơn, cách này tiết kiêm được thời gian phân tích ,cho kết quả tố hơn. Phương trình Van Deemter Phương trình VanDeemter ra đời bổ sung cho một số điểm của quá trình sắc ký theo lý thuyết đĩa chưa lột tả được các vấn đề ảnh hưởng bên trong cũng như bên ngoài của quá trình sắc ký. Phương trình Van Deemter sẽ mô tả ảnh hưởng của quá trình này như sau: Trong đó : HA:chiều cao riêng phần thể hiện chất lượng của cột nhồi gây ảnh hưởng tốc độ dịch chuyển khác nhau của các phân tử trong cột nhồi A = 2λdp - λ: thông số phụ thuộc vào kích thước hạt và mứt độ đồng nhất khi nạp cột ,dp là đường kính của hạt chất hấp phụ . HB: chiều cao riêng phần biểu diễn sự phân tán của cấu tử khảo sát trong pha động. : Hệ số phụ thuộc vào khoảng cách giửa các hạt, DM là hệ số khuyết tán trong pha động - HC: chiều cao riêng phầnbiểu diễn sự hấp phụ và giải hấp phụ của cấu tử bên pha tĩnh và sự phân tán cùa cấu tử trong hai pha . A. Sắc ký lỏng Sắc ký lỏng là quá trình tách do ái lực khác nhau của cấu tử lỏng đối với chất hấp phụ rắn . Lực hấp phụ bao gồm lực Vande Waals, lực cảm ứng, lực liên kết hóa học và lực liên kết hydrogen. Sắc ký lỏng xác định được rất nhiều loại cấu tử đặt biệt là các chất có khối lương phân tử lớn. Giới thiệu một số phương pháp sắc ký Sắc ký lỏng được viết tắt là HPLC : High Performance Liquid Chromatography:sắc ký lỏng hiệu nâng cao. High Pressure Liquid Chromatography: sắc ký lỏng áp suất cao. Figure P-2:HPLC column Pha tĩnh Pha tĩnh trong sắc ký thường ở thể rắn, có nhiều loại pha tĩnh khác nhau , tùy theo nhu cầu mà người ta chọn lựa pha tĩnh phân cực hoặc không phân cực. Pha tĩnh không phân cực: thường sử dụng nền silica gel có gắn thêm mạch cacbon C18 Pha tĩnh phân cực: thường sử dụng cực là silosan (SiO2) hoặc alumina(Al2O3) pha tĩnh này rất háo nước, nước có thể là một chất độc đối với các pha tĩnh loại này. Dung môi được chon để chạy sắc ký phải đáp ứng được các yêu cầu sau: Có độ tinh khiết cao Hòa tan tốt với cấu tử cần phân tích Bị hấp phụ tối thiểu trên pha tĩnh Không phản ứng với chất cần xác định và chất hấp phụ. Pha động Để tăng khả năng tách có thể rửa giải bằng dung môi theo thứ tự khả năng giải hấp tăng dần. Đối với các chất hấp phụ phân cực dung môi có hằng số điện môi càng lớn sẻ có khả năng giải hấp càng cao đói với các chất hấp phụ trên đó và ngược lại. Chất hấp phụ không phân cực dung môi có hằng số điện môi càng cao sẽ giải hấp càng kém. Hệ thống máy sắc ký lỏng Hệ thống máy sắc ký lỏng Mô hình máy sắc ký lỏng Bộ phận tiêm mẫu - Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu từ ngoài vào cột bằng kim bơm. Bộ phận tiêm mẫu gồm: kim tiêm, loop, van xoay chiều. Loop có tác dụng khi lấy mẫu đảm bảo lượng mẫu chuẩn và mẫu thật đưa vào cột như nhau Bộ tiêm mẫu tự động Cột sắc ký Cột sắc ký có nhiều loại và nhiều kích cỡ khác nhau Cột sắc ký lỏng thường đặt trong một buồng ổn nhiệt, tuy nhiên chế độ lỏng trong sắc ký lỏng ít đươc sử dụng. Cột sắc ký Đầu dò ( derector) Trong sắc ký lỏng thường sử dụng nhiều loại đầu dò khác nhau UV, DAD, độ dẫn, khúc xạ.. Các tín hiệu thu được từ đầu dò tỷ lệ thuận với hàm lượng chất cần xác định và được chuyền tài tới bộ phận ghi đo. Đầu dò UV Năm 1952 máy sắc ký khí đầu tiên ra đời. Dưới sự chủ trì của giáo sư Kulemann và các cộng sự. Sắc ký khí là phương pháp sắc ký mà pha động thường là khí và pha rắn là chất rắn hấp phụ. Sắc ký khí thường dùng để xác định các chất dể bay hơi( tos99,99%. Khí mang nào cho cực tiểu càng trải rộng càng tốt. Những loại khí mang thường dùng: He, H2, ,N2… Trong đó He là khí mang tốt nhất, H2 dễ gây cháy nổ, N2 rẻ tiền nhưng tách không tốt. Pha động Mô hình cấu tạo của máy sắc ký khí Khí mang thường được sử dung trong bình nén, chịu áp cao,bình có van đo áp suất bên trong và bên ngoài bình, điều chỉnh lưu lượng khí. Người ta phân biệt các bình khí dựa vào màu sắc của vỏ bình: Bình khí H2 có màu đỏ. Bình khí N2 có màu xanh. Bình khí He có màu nâu. Các khí mang này phải đảm bảo có độ tinh khiết cao, khí trước khi vào cột phải được bẫy ẩm. Khí mang Bộ tiêm mẫu Mẫu dạng lỏng được bơm vào cột bằng kim tiêm qua một septum. Đối với mẫu dạng khí dùng hệ thống headspace để đưa mẫu vào cột. Nhiệt độ buồng tiêm thường giữ ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ hóa hơi của cấu tử cần xác định. Bộ phận tiêm mẫu Cột nhồi: dài 2 -3 m,đường kính 2 – 4 mm,thường làm bằng thủy tinh, kim loại, teflon, trong cột nhồi đầy với những hạt rắn, hình cầu diện tích riêng của hạt > 1m2/gam Cột mao quản(cột mở):chiều dài 10 – 100 m, đường kinh 0.2 - 0.3mm,trên thành trong của cột được phủ một lớp pha tĩnh rất mỏng (0.03 – 0.1mm) Cột sắc ký khí Có khả năng gia nhiệt và hạ nhiệt rất nhanh. Nhiệt độ là một thong số quan trọng trong sắc ký khí. Buồng nhiệt chứa cột vì vậy phải có nhiệt độ hoạt động thấp hơn nhiệt độ giới hạn. Buồng ổn nhiệt (oven) Đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID – flame ionization detector). Đầu dò dẫn nhiệt ( TCD – thermal conductivity detector). Đầu dò bắt giữ điện tử ( ECD – electron capture detector) C. Đầu dò (detector) Đầu dò ion hóa ngọn lửa Đầu dò dẫn nhiệt Đầu dò bắt giữ điện tử Sắc ký trao đổi ion dựa trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh động của pha tĩnh rắn với các ion trong dung dịch phân tích. Pha tĩnh trong trường hợp này được gọi là chất trao đổi ion. Bản chất của quá trình tách là do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch đối với các trung tâm trao đổi ion của ionit. Sắc ký trao đổi ion Thành phần : cationit (nhựa trao đổi cation) và anionit ( nhựa trao đổi anion) Cationit: chứa các nhóm chức hoạt động là cacc1 anion R-, ion linh động là Mn+. Anionit : có dạng R+X- với nhóm hoạt động R+ thường là nhóm amin. Cơ chế trao đổi của cationit: R-SO3H(R) + Mn+(dd) (R-SO3-)nMn+ ( R)+ nH+ Cơ chế trao đổi ion của anionit:nhóm amin của anionit tác dụng tương tự như các amin trong dung dịch nước R-NH2OH- + H2O R-NH3OH- Ion OH- trên anionit được trao đổi với các ion trong dung dich. R-NH3+OH + HCL R-NH3+CL- + H2O Cơ chế trao đổi ion Quá trình sắc ký xảy ra khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh. Hệ sắc ký bản mỏng: Bản mỏng: chế tạo bằng thủy tinh, polimer, nhôm.. Pha tĩnh: có thể sử dụng: silicagel, nhôm oxit, xenlulose, tinh bột… Pha động: không dùng một dung môi mà thường kết hợp nhiều dung môi để tách các cấu tử ra khỏi nhau. F. Sắc ký bản mỏng Dùng để tách điện tích các cấu tử trong dung dịch mẫu. Để định lượng người ta thường đo điện tích các cấu tử hoạc cân chúng. Ngoài ra còn định lượng bằng cách kết hợp chúng với phương pháp so màu hoặc phương pháp hồng ngoại. Phân tích định tính và định lượng bằng sắc ký bản mỏng MÔ HÌNH SẮC KÝ GiẤY Sự tách biệt của mực đen bởi sắc ký lớp mỏng Máy phân tích sắc ký lớp mỏng tự động Các kỹ thuật định lượng của phương pháp sắc ký hiện đại Kỹ thuật so sánh Chỉ cần chạy một mẫu chuẩn và một mẫu thật từ đó so sánh được kết quả. Ta luôn có: Trong đó: Cx,Cc:nồng độ của chất cần xác định và chất chuẩn. Ax,Ac:tín hiệu đo của chất cần xác định và chất chuẩn. Kỹ thuật nội chuẩn. Phương pháp nội chuẩn đơn giản không tốn nhiều công sức và được áp dụng rất phổ biến , đặc biệt trong sắc ký khí. Chất được chọn làm nội chuẩn thỏa các yêu cầu sau: Thời gian lưu trữ của chất nội chuẩn gần với thời gian lưu chất của chất cần xác định. Độ nhạy của nội chuẩn phỉa xấp xỉ với độ nhạy của chất cần xác định . Chất nội chuẩn cần được tách khỏi tất cả các chất có sẵn trong mẫu. Kỹ thuật thêm chuẩn Thêm vào mẫu một lượng biết trước chất cần định lượng. Chạy sắc ký mẫu nguyên và mẫu thêm, đo độ tăng diện tích của chất cần định lượng từ đó xác định được hàm lượng chất đó có trong mẫu ban đầu. Ưu điểm: loại bỏ được ảnh hưởng của chất nền trong mẫu. Nhược điểm: nồng độ được tính bằng cách ngoại suy trên vùng tuyến tính của đường chuẩn. Trong kỹ thuật Chế thuốc thử hóa học. Điều chế hóa chất. Tách các ion có điện cực trái dấu. Cô đặc dung dịch loãng. Sử dung sắc ký trao đổi ion để phân tích định tính , định lượng. Ứng dụng của sắc ký Kiểm định chất lượng thuốc BVTV bằng máy sắc ký lỏng phân giải cao   Kiểm định chất lượng thuốc BVTV trên máy sắc ký khí  Chuẩn bị mẫu kiểm định chất lượng thuốc BVTV Cảm ơn Thầy và các bạn đã chú ý lắng nghe và góp ý.