Các chỉ tiêu vi sinh chủ yếu trong sản phẩm thuỷ sản

CÁC CHỈ TIÊU VI SINH CHỦ YẾU TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN Chương 7 - Là những VSV ptriển điều kiện có oxy, ủ ở 30oC thời gian 72 h. - Chỉ tiêu được ktra = pp đếm đĩa, có 2 cách thực hiện: Dùng que trải thuỷ tinh vô trùng trải đều một lượng mẫu xác định trên bề mặt môi trường thạch. Cho một lượng mẫu xác định vào đĩa, cho môi trường nóng chảy (45oC) vào, trộn đều và đem ủ ở T0 và thời gian thích hợp. Kết quả được tính bằng cách đếm các đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250 khuẩn lạc và quy về nồng độ ban đầu của mẫu. Tổng số vi sinh vật hiếu khí Định lượng VSV bằng pp đo ATP (Adenosine triphosphate).  ATP là chất tích trữ và cung cấp nguồn NL cho cơ thể sống, sẽ hoàn toàn mất đi sau khi tế bào chết 2h.  Lượng ATP trung bình ở VSV là 0,3fg/tế bào (1femtogram = 10-15g).  SD hệ thống men luciferin-luciferase  định lượng ATP Khi trên bề mặt kiểm tra có sự hiện diện của ATP bất kể của tế bào vi sinh hay động, thực vật thì ATP kích hoạt pứng oxy hoá luciferin và giải phóng ra NL (dưới dạng lượng tử asáng).  Cường độ phát sáng  định lượng được lượng ATP và quy về số lượng VSV hay số tế bào sống có trong mẫu. Lưu ý khi định lượng bằng ATP • Có thể có ATP của tế bào thực phẩm • Nấm men có lượng ATP gấp 100 lần vi khuẩn • Khi tế bào bị stress lượng ATP giảm xuống • Do đó cần thiết phải tách tế bào vsv ra khỏi thực phẩm có có thể dùng enzyme liên kết, lọc Coliforms là nhóm trực khuẩn đường ruột gram (-) ko sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37oC trong 24h. Chỉ tiêu dùng đánh giá mức độ an toàn về vi sinh thực phẩm (áp dụng đầu tiên ở Mỹ, năm 1920). Giúp kiểm soát vệ sinh môi trường sống của nhuyễn thể 2 mảnh vỏ, nhưng không là chỉ tiêu tối ưu trong kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm về vi sinh Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trường và nhiều loại thực phẩm. Coliforms phát triển chậm ở 5oC, pH (4,4 – 9) Đặc điểm Coliforms Escherichia (E. coli) Citrobacter Klebsiella Enterobacter (2 loài Aerobacter và Cloacae) Nhóm coliform gồm 4 giống: Tính chất sinh hoá đặc trưng là các phản ứng Indol, Methyl red, Voges-Proskauer và Citrate (IMViC). I M VP iC Escherichia +(-) + - - Citrobacter -(+) + - + Klebsiella -(+) - + + Enterobacter -(+) - + + Các đặc điểm của Coliforms (Nghiệm pháp IMViC)  Sử dụng loại môi trường chứa chất ức chế các VK tự nhiên trong môi trường bên ngoài.  Muối này được pha chế sẵn ở mt nuôi cấy: Violet red bile, Brilliant green bile salt,  Mẫu được cấy lên mt Violet red bile lactose agar, được khẳng định bằng môi trường Brilliant green bile lactose. Coliforms sinh khí trong môi trường BGBL ở 37oC, 24h. Tác hại Gây các bệnh đường tiêu hoá: tiêu chảy, buồn nôn, gây triệu chứng đau đầu và mệt mỏi. Trẻ em, người già dễ mẫn cảm với nhóm VK này. Cơ sở của phương pháp kiểm tra Escherichia coli Đặc điểm  Là nhóm VK có khả năng lên men yếm khí, chiếm ưu thế trong hệ tiêu hoá của người, động vật trên cạn.  Là nhân tố chỉ thị về sự nhiễm bẩn chất thải của người và động vật. Tác hại • Đa số các chủng E.coli không gây hại cho người. • 1 số chủng E. coli gây bệnh ở mức độ viêm ruột nhẹ đến cấp tính và tử vong. • Do chủng tạo độc tố đường ruột (enterotoxigenic E.coli_ETEC), chủng gây bệnh đường ruột (enteropathogenic E.coli_EPEC) hoặc chủng gây xuất huyết đường tiêu hoá (enterohemorrhagic E.coli_EHEC), • Dùng phân chuồng (phân bò) bón ao nuôi  nguy cơ nhiễm các chủng E. Coli gây bệnh. Vi khuẩn E.coli  Khẳng định vi khuẩn thuộc nhóm coliforms  Là E.coli cho kết quả nghiệm pháp IMViC phù hợp (++--).  Các chủng E. coli gây ngộ độc thực phẩm tạo các loại độc tố riêng biệt giúp xác định các dòng gây hại. Cơ sở của phương pháp kiểm tra Muốn xác định vi khuẩn E.coli trước hết PP : ELISA, kháng huyết thanh dựa vào tính đặc trưng của độc tố. Campylobacter spp Đặc điểm  Là VK chính, phổ biến gây bệnh tiêu chảy ở người.  Phân lập được VK này trong các loài nhuyễn thể 2 mảnh vỏ (chưa có thông tin về cá và giáp xác).  Số lượng VK có khả năng gây bệnh (thực phẩm) ở người từ 500 – 10.000 tế bào VK (tuỳ vào dòng VK, tình trạng sức khoẻ, tính mẫn cảm từng cá thể).  VK C. fetus có khả năng cảm nhiễm cao, loài chịu nhiệt (nhiệt độ thích hợp 42oC) ít gây bệnh do nhiệt độ không thích hợp. Vi khuẩn Campylobacter Không tạo bào tử, hình que, G- Pha log có hình que mảnh cong hoặc xoắn Tuỳ theo quá trình nuôi cấy tế bào có thể chuyển sang hình cầu O/F âm tính Tác hại VK gây bệnh trên đường tiêu hoá. Biểu hiện: tiêu chảy (nhẹ hoặc nặng), có hiện tượng xuất huyết. Trẻ em <1 tuổi rất mẫn cảm Cơ sở của phương pháp kiểm tra Sử dụng môi trường đặc trưng: Campylobacter Enrichment Broth, Abeyta-Hunt-Bark (AHB) agar, Modified Campy blood-free agar (mCCDA), Dựa vào hình dạng khuẩn lạc sau nuôi cấy trên mt rắn (khuẩn lạc trên môi trường đặc có rìa tròn, hay ko đều, có màu trắng hơi trong). Dựa vào các đặc điểm sinh hoá của loài Samonella (là vi khuẩn gây bệnh truyền qua thực phẩm) Đặc điểm Có mặt tự nhiên trong ống tiêu hoá của vật nuôi cũng như động vật hoang dã, ở động vât có vú và chim có thể gây bệnh thương hàn. Gia cầm là ký chủ trung gian và vi khuẩn có khả năng truyền qua trứng Trước 1940 là nhóm gây bệnh do thực phẩm phổ biến Có khoảng 2000 dòng, là trực khuẩn gram (-) kị khí ko bắt buộc, ko sinh bào tử, di động = chu mao (được phân lập 1884). Ko lên men lactose (trừ S. Arizona), sucrose, ko phân giải urea. Lên men dulcitol, mannitol, glucose. Ko có kn tách amine từ tryptophan. Ko sinh indol, acetoin. Sinh ra H2S và tách carboxyl từ ornithine và lysine. Xhiện nhiều ở vùng nhiệt đới Nước nhập khẩu thuỷ sản ko chấp nhận sp bị nhiễm. Tình hình • Nhiều pp phòng tránh nhưng hiệu quả ko cao do ▫ Xuất hiện nhiều dòng kháng thuốc ▫ Tăng số lượng người bị khiếm khuyết trong hệ miễn dịch ▫ Lượng trứng sản xuất bởi gà bị nhiễm sẵn vk trong buồng trứng Cơ sở của phương pháp kiểm tra 4 giai đoạn, sử dụng chủng đối chứng trong suốt quá trình phân tích. • Tiền tăng sinh: Mẫu được tiền tăng sinh ở mt ko chọn lọc (37oC, 18h). • Tăng sinh: Chuyển sang mt tăng sinh chọn lọc (Rapparport Vassiliadis soy pepton) (42oC, 24h). • Phân lập Cấy chuyển VK sang môi trường chọn lọc Xylose lysine desoxycholate (XLD) hay Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (37oC, 24h). Trên XLD khuẩn lạc Samonella đặc trưng hơi trong, nhốm đỏ (thay đổi chất chỉ thị mt), có tâm đen, có vùng đỏ quanh khuẩn lạc. • Khẳng định Mẫu nhiễm Samonella khi có các trực khuẩn gram (-), tạo các khuẩn lạc điển hình trên môi trường đặc trưng và có đặc điểm: Lactose (+), Sucrose (-), Glucose (+), Urea, Indol (-), VP (-), TDA (-), Mannitol (+). Vi khuẩn Samonella Clostridium perfringens Đặc điểm  Là trực khuẩn kị khí, gram (+), sinh bào tử, có chu kỳ ptriển nhanh. T0 45oC + đk tối ưu: chu kỳ ptriển là 7’.  Phổ biến trong đường tiêu hoá người dùng làm VSV chỉ thị về kn nhiễm phân của thực phẩm.  pH ptriển 5,5 – 8,5.  Có kn cạnh tranh cao do sinh bào tử  nên có kn tồn tại tốt (so với các tế bào sinh dưỡng của VSV khác). Bào tử: • Hình thành trong đk kị khí ở ruột non. • Ptriển tốt I ở 37 – 45oC, thấp I 200C, cao I 50oC. • Tồn tại tgian khá dài ở đk khắc nghiệt (40% bào tử còn sống sót ở thực phẩm sau trữ đông 3 tháng (-17,7oC), còn lại 11% ở thực phẩm sau 6 tháng trữ đông. Tác hại  Gây ngộ độc thực phẩm.  Tác nhận gây bệnh đặc biệt do vừa là tác nhân gây bệnh do thực phẩm khi ăn phải một lượng lớn tế bào sống, vừa là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm do có khả năng sinh nội độc tố. Cơ sở của phương pháp kiểm tra  Nuôi cấy trên mt đặc hiệu trong đk yếm khí.  Dựa vào khả năng khử ion sulphite (S2O3 -) thành sulfua (S2 -) của VK.  (Mẫu được cấy lên mt có chứa Fe3+ và ion S2O3 -, ủ ở 37oC từ 1-2 ngày,nghi ngờ có Clostridia chịu nhiệt thì ủ ở 50oC. Clostridia điển hình có màu đen xung quanh khuẩn lạc). Vi khuẩn Clostridium perfringens Staphylococus aureus (là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm) Đặc điểm  Là cầu khuẩn kị khí tuỳ nghi, gram (+), kết dạng chùm, không di động, không sinh bào tử  Gặp trên da, xoang mũi, tóc ở người.  Đường kính khoảng 0,7 µm, không sinh bào tử, không di động. Là vi khuẩn ko có khả năng cạnh tranh cao, có thể phát triển mạnh và sinh độc tố ở mt nồng độ muối cao (cá, thịt muối).  Chống chịu cao với chất sát khuẩn, kháng sinh (HgCl2, neomycin, polymycin, tellurite, sodium azide dùng làm chất ức chế trong mt nuôi cấy chọn lọc).  Ptriển tốt trên mt ko muối & có muối ở nồng độ muối 7 – 10%, lên tới 20%.  Độc tố được sinh ra khi bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ thường  Sinh độc tố dạng protein phân tử lượng thấp (30.000 dalton) - gọi là độc tố đường ruột (có các loại A, B, C1, C2, D và E còn gọi là SEA, SEB) SEB bền nhiệt hơn SEA, nhưng ngộ độc do SEA xuất hiện nhiều hơn do có độc tính cao hơn, dùng làm vũ khí sinh học trong chiến tranh  Độc tố này thuộc loại chịu nhiệt, một khi đã hình thành thì việc đun sôi hay Các quy trình chế biến thông thường cũng không phá huỷ được. VK Có thể chịu được nhiệt độ 60oC trong 16h Tác hại Biểu hiện ngộ độc • Là dạng độc tố đường ruột. Kích thích dây thần kinh trong dạ dày, gây nôn, đau thắt bụng, tiêu chảy, kiệt sức nghiêm trọng sau 2 – 4 giờ sau khi ăn ko chết người, gây đau do các phản ứng rất mạnh. • Liều gây độc đối với người khoẻ mạnh khoảng 100-200 ng tương đương với khoảng 30 g hoặc ml thực phẩm chứa 106 – 107 cfu/g, thấp hơn với trẻ nhỏ, người già Xác định dựa vào đặc điểm khuẩn lạc trên mt đặc trưng và pứng đông huyết thanh. Môi trường Baird Paker:  Sau 24h khuẩn lạc có màu đen sáng, lồi đkính 1 – 1,5 mm, có quần sáng rộng (1 – 2mm) bao quanh.  Sau 48h khuẩn lạc Staphyloccoci coagulase (+) tính có đkính 1,5 – 2 mm có màu đen sáng lồi, quanh khuẩn lạc có một vùng mờ đục hẹp tiếp đó là vùng sáng rộng 2 – 4 mm. Cơ sở của phương pháp kiểm tra Vi khuẩn S. aureus Phòng tránh • Không thể tiệt trùng hoàn toàn • Trong quá trình chế biến tránh các nguồn lây nhiễm • Số lượng tế bào 100-500 cfu/g hoặc ml thông thường không gây hại, trừ trường hợp độc tố đã được tạo ra • Gia nhiệt làm chết các tế bào sống, sau đó làm lạnh nhanh tới <5oC Vibrio Đặc điểm  Có 4 loài thuộc giống vibrio gây bệnh do thực phẩm là V. cholarae (O1, O139 và các dòng khác), V. mimicus, V. parahaemolyticus, V. vulnificus  Vibrio ko sinh bào tử, di động = tiên mao.  Ptriển tốt ở pH >9, nồng độ muối 3% được sd trong mt phân lập đặc trưng.  Phân bố trong mt nước biển và nước lợ. V. cholera • O1 không có vỏ bao tế bào, O139 có vỏ bao tế bào, gram (-) hình que hơi cong giống dấu phẩy- phẩy khuẩn • Tất cả các dòng đều nhạy với nhiệt độ, ở nhiệt độ nấu thông thường có thể diệt hết các mầm bệnh Vib. Phát triển rất nhanh ở nhiệt độ phòng • Là bệnh trên người, hiếm có trường hợp bệnh mãn tính, lây truyền do nước hoặc thức ăn nhiễm phân người bệnh. Môi trường nước biển có thể chứa vi khuẩn trong thời gian dài. • Sản xuất độc tố 82 KDalton gồm 2 tiểu đơn vị A và B (CT- chorela toxin hoặc AB toxin), B gắn vào các receptor trên tế bào, A kích thích enzyme adenyl cyclase làm tế bào ruột tiết ra nhiều nước, Cl,K, bicarbonate. Là nhóm nội độc tố, sinh ra bên trong tế bào vk và giải phóng khi tb chết đi, VK phát triển ở ruột non, không gây ra các biểu hiện bệnh tích như các vết loét. • Các biểu hiện thường xãy ra 1-5 ngày sau khi nhiễm bệnh, thông thường 2 ngày • Thực phẩm bị nhiễm phân của người bệnh là nguồn lây chủ yếu, thực phẩm được chế biến bởi người nhiễm bệnh cũng có thể lây hay các tp có nguồn gốc từ nguồn vk như môi trường biển và nước lợ  V. parahaemolyticus các đặc tính sinh lý giống như V. cholerae (kn ptriển nồng độ muối và pH cao, có khả năng di động).  Đặc điểm khác: phát triển ở nồng độ muối cao hơn (6%) so với V. cholerae.  V. parahaemolyticus tồn tại trong nước biển và xuất hiện trong các sinh vật biển (nhuyễn thể, giáp xác,)  Gây bệnh tả với 2 dòng là Vibrio cholerae O1 và O139 do các chủng này có khả năng sinh độc tố đường ruột và gây bệnh tả trên người.  Dòng thuộc loài V. parahaemolyticus cũng là một tác nhân gây bệnh, gây ra những triệu chứng: đau bụng, tiêu chảy, nôn, ớn lạnh, đau đầu (Ăn thực phẩm bị nhiễm với lượng 105 tế bào/g sau 12h, các tác động của nhóm này tập trung ở vùng dạ dày) Tác hại • Dựa và các đặc điểm sinh hoá: • Vibrio có dạng hình que, hơi cong, có 1 tiên mao, di động, ptriển ở mt có pH và nồng độ muối cao, oxidase và catalase dương tính, ko tạo khí khi lên men glucose. Cơ sở của phương pháp kiểm tra Vi khuẩn Vibrio cholerae Listeria • Listeria bao gồm 6 loài, trong đó Lis. monocytogene (13 nhóm huyết thanh) là loài có khả năng gây bệnh trên người, Lis. ivanovii là loài gây bệnh trên động vật. • Bệnh do listeria trên người là bệnh cơ hội hiếm gặp, đối với người khoẻ mạnh thường không có những dấu hiệu hoặc là những dấu hiệu xuất hiện không đáng kể, tuy nhiên nó rất nguy hiểm đối với thai nhi, trẻ sơ sinh, trẻ em, người già, phụ nữ mang thai và những người bị suy giảm miễn dịch. • Vi khuẩn này có khả năng phát triển trên nhiều loại thực phẩm trong điều kiện nhiệt độ lạnh giúp vk có năng năng tăng mật số đến liều gây bệnh trong thời gian bảo quản thực phẩm. • Là vi khuẩn gram dương, hình que nhỏ, chịu lạnh (nhiệt độ phát triển 1-44oC), kỵ khí tuỳ tiện, không sinh bào tử và có khả năng di động. Khả năng di động của vk tuỳ thuộc vào nhiệt độ, khả năng di động cao nhất ở vào 20-30oC, do đây là nhiệt độ cho sự biểu hiện cực đại của gene điều khiển sự hình thành tiên mao. Tiên mao có tính kháng nguyên cao, được dùng để phân biệt các dòng listeria, có khả năng tan huyết khi cấy trên môi trường thạch máu. • Nhiệt độ phát triển tối ưu 30-37oC, ở 7-10oC tốc độ nhân đôi tăng rất nhanh. Tế bào có khả năng kháng lại với các điều kiện như đông lạnh, khô, nồng độ muối cao (>10%), pH từ 5 trở lên, chịu được môi trường acid, nên có thể tồn tại được trong acid dạ dày. Không chịu được nhiệt độ khi thanh trùng Pasteur (71.7oC 15 phút, 62.8oC 30 phút) nhưng khi trong tế bào bạch cầu chịu được nhiệt độ cao hơn. • VK lis. có mặt trong nhiều môi trường như đất, rác, nước, rau quả hỏng. Người có thể có mầm bệnh khi ko có biểu hiện, thường mầm bệnh có trong túi mật. • Tạo protein 58kD ᵝ-hemolysin và listerolysin O có khả năng làm tan huyết và khả năng này được tăng mạnh khi kết hợp với haemolysin của S. aureus. Đặc điểm này được sử dụng để phân biệt với L. inocua được gọi là test kiểm tra nhân tố CAMP (Christie, Atkins, và Munch-Peterson) • Phân lập dựa vào môi trường đặc trưng và các test sinh hoá