Các kháng thể đơn dòng

Các kháng thể đơn dòng Các tế bào bạch huyết (lymphocytes) là các tế bào máu trắng cần cho các phản ứng miễn dịch. Các B-lymphocyte, loại sản xuất kháng thể, hiện diện trong lá lách, các u bạch huyết (lympho nodes) và máu. Khi một chất ngoại lai đi vào trong cơ thể của động vật có xương sống, thì các tuyến B- lymphocyte sản xuất nhanh và tiết ra các phân tử protein gọi là immunoglobulin hay còn gọi là kháng thể (antibody). Các kháng thể có các vị trí kết hợp có thể nhận ra hình dạng của yếu tố quyết định đặc hiệu trên bề mặt của chất ngoại lai, còn gọi là kháng nguyên (antigent). Kết quả là các kháng thể có thể liên kết với kháng nguyên đặc hiệu, trung hòa và đào thải các chất ngoại lai. Do tính đặc hiệu của chúng trong việc nhận dạng các tế bào hoặc phân tử đặc biệt nên kháng thể đã là những công cụ rất quan trọng để các nghiên cứu viên và thầy thuốc lâm sàng phát hiện sự hiện diện và nồng độ của thuốc, các sản phẩm của virus và vi khuẩn, hormone và các kháng thể khác trong máu. Có 5 loại kháng thể là immunoglobulin G, A, M, D và E. Hình 1 minh họa cấu trúc của một loại kháng thể immunoglobulin G (IgG), có cấu trúc protein dạng hình chữ Y bao gồm một cặp chuỗi nặng (heavy chain)9 và một cặp chuỗi nhẹ (light chain)10 được liên kết bởi các cầu nối disulfide. Mỗi chuỗi có 2 vùng: (1) vùng có thể thay đổi được, vùng này khác nhau tùy thuộc vào mỗi loại kháng thể và chúng chứa các vị trí liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên khác nhau, (2) vùng không thể thay đổi được, đặc trưng cho các kháng thể của một phân lớp nhất định. Bản chất của liên kết kháng thể-kháng nguyên tương tự với bản chất của phức hợp cơ chất- enzyme. Có nhiều dòng khác nhau của B-lymphocyte và mỗi dòng sản xuất ra các kháng thể khác nhau nhận ra các yếu tố quyết định kháng nguyên đặc hiệu. Vì thế, khi một động vật được tiêm một tác nhân miễn dịch, thì nó phản ứng bằng cách sản xuất ra một hỗn hợp kháng thể đa dạng hầu như không thể phân chia được. Để sản xuất một lượng lớn kháng thể đồng nhất (kháng thể đơn dòng) chỉ nhận ra một cấu trúc hóa học, chúng ta phải cho sinh trưởng được một dòng tế bào đặc biệt của B-lymphocyte. Tuy nhiên, người ta nhận thấy là các tế bào tiết (tạo) ra kháng thể không thể duy trì được trên môi trường nuôi cấy. Hình 1. Cấu trúc kháng thể immunoglobulin G (IgG). 1. Dung hợp tế bào Không giống như các tế bào tiết ra kháng thể, các tế bào myeloma (u tủy) là loại tế bào khối u ác tính của hệ thống miễn dịch, có thể được nuôi cấy liên tục. Kehler và Milstein (1975) đã phát triển một phương pháp dung hợp các tế bào B-lymphocyte của lá lách với tế bào myeloma của chuột để lai hai loại tế bào này với nhau, tế bào lai myeloma (hay hybridoma), có thể có đặc điểm của cả hai dòng tế bào: đó là sản xuất các kháng thể đặc hiệu và bất tử. Vì hybridoma được bắt nguồn từ một tế bào B-lymphocyte đơn, nên nó chỉ sản xuất một loại kháng thể gọi là kháng thể đơn dòng. Phương thức đặc trưng để dung hợp tế bào như sau:: - Tiêm kháng nguyên được chọn vào trong chuột. Hệ thống miễn dịch trong chuột đáp ứng bằng cách sản xuất các tế bào B-lymphocyte để tiết ra kháng thể. - Lấy lá lách của chuột và tách các tế bào B-lymphocyte. - Nuôi các tế bào myeloma thích hợp thiếu HPGRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase), đột biến HPGRT-, một marker di truyền để chọn các tế bào lai sau khi dung hợp. - Dung hợp các tế bào B-lymphocyte với các tế bào myeloma bằng cách trộn chúng trong môi trường chứa 40-50% polyethylene glycol (PEG). Môi trường sẽ chứa các hỗn hợp của B-lymphocyte, myeloma, và các tế bào hybrid-myeloma. Các B-lymphocyte chứa HPGRT, như vậy các hybridoma cũng chứa HPGRT. Vì thế, các tế bào myeloma được coi như là HPGRT-, trong khi các tế bào B-lymphocyte và hybridoma là HPGRT+. - Chọn lọc các tế bào HPGRT+ bằng cách nuôi cấy hỗn hợp trên môi trường chứa HAT (hypoxanthine, aminopterin và thymidine) là chất ức chế sinh trưởng các tế bào HPGRT-. Do đó, các tế bào myeloma sẽ chết trên môi trường này, trong khi các tế bào hybridoma sẽ phân chia. Các B- lymphocyte không dung hợp sẽ chết do khoảng thời gian sống bị hạn chế của chúng. Phương thức dung hợp các tế bào B-lymphocyte. 2. Thử nghiệm kháng thể Các kháng thể đơn dòng có thể được phân tích bằng kỹ thuật thử nghiệm pha rắn như các thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme linked immunosorbent assays-ELISA) hoặc các thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (radioimmuno assays-RIA). Các phương thức thử nghiệm đặc trưng như sau: - Đưa dung dịch kháng nguyên đặc hiệu (Ag) vào các giếng của đĩa microtitre có khả năng hút bám kháng nguyên bằng sự tương tác kỵ nước không đặc hiệu. Bổ sung một loại protein không gây cản trở liên kết kháng nguyên- kháng thể sau này, như là bovine serum albumin (BSA) để chiếm các vị trí gắn còn lại trên giếng. - Bổ sung dung dịch kháng thể đơn dòng thứ nhất (Mab1) là kháng thể đặc hiệu vào giếng. Kháng thể sẽ liên kết với kháng nguyên trên bề mặt rắn. - Bổ sung kháng thể đơn dòng thứ hai (Mab2) là kháng thể có đặc tính tương phản với immunoglobulin của loại mà từ đó tế bào hybridoma bắt nguồn. Một enzyme (E) cho phương pháp ELISA hoặc đánh dấu đồng vị phóng xạ cho phương pháp RIA được gắn đồng hóa trị với kháng thể thứ hai. - RIA: đo hoạt tính phóng xạ bằng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiography) hoặc bằng phương pháp đếm nhấp nháy của hệ thống nâng đỡ rắn (solid scintillation counter). - ELISA: Bổ sung cơ chất thích hợp và đo mật độ quang (OD) sản phẩm của nó trên máy quang phổ ở bước sóng thích hợp.