Các kỹ thuật miễn dịch thường dùng

13/12/2012 1 KHOA CNSH & KTMT Bài giảng Miễn dịch học CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH THƢỜNG DÙNG 1 GV: Nguyễn Thành Luân luannt@cntp.edu.vn Vai trò của miễn dịch trong sinh học • Vô cùng quan trọng trong CNSH y dược & các ứng dụng sinh học khác • Các bệnh ở người và động vật chủ yếu xuất phát từ sự tạp nhiễm hoặc rối loạn của hệ thống miễn dịch • KN (bệnh) lạ xuất hiện ngày càng nhiều & phức tạp dưới các hình thức khác nhau  Cải thiện các cách chuẩn đoán bệnh 1 cách nhanh chóng là yêu cầu đối với ngành miễn dịch học 2 13/12/2012 2 Nhu cầu đáp ứng sản xuất miễn dịch trong sinh học • Sản xuất vaccine phòng ngừa các bệnh ở người và động vật như: influenza, MMR (measles, mumps, rubella), HIV/AIDS, sốt xuất huyết, di ứng & hen xuyễn, tiểu đường loại 1, thấp khớp… • Tăng hiệu quả trong cấy ghép mô TB/cơ quan • Cải thiện sức khỏe động vật hoang dã & vật nuôi (thú y) • Hỗ trợ ngành nông nghiệp/công nghiệp chăn nuôi 3 Các kỹ thuật miễn dịch cơ bản • Định lượng immunoglobulin và các protein khác – Miễn dịch ngưng kết – Miễn dịch kết tủa – Miễn dịch khuếch tán đơn & kép • Miễn dịch liên kết enzyme – Miễn dịch vi hạt – Miễn dịch huỳnh quang – Miễn dịch hóa/điện phát quang 4 13/12/2012 3 Kỹ thuật định lƣợng immunoglobulin và các protein đặc hiệu khác 5 Kỹ thuật cạnh tranh: KN không đánh dấu cạnh tranh với KN có đánh dấu, kết hợp với KT Yêu cầu của phản ứng này là KT phải có tính đặc hiệu cao, KN dùng xác lập đồ thị tương quan chuẩn phải rất tinh khiết, kháng nguyên không mất hoạt tính sinh học sau khi đánh dấu. Kỹ thuật định lƣợng immunoglobulin và các protein đặc hiệu khác 6 Kỹ thuật không cạnh tranh: được sử dụng rộng rãi trong định lượng KN hoặc KT bằng phương pháp miễn dịch 13/12/2012 4 Miễn dịch ngƣng kết (Agglutination) 7 Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT, dùng hạt latex hay HC làm nền phản ứng. Bản chất của phương pháp này là định tính và định lượng bằng cách pha loãng tuần tự. Cơ chế miễn dịch ngƣng kết 8 13/12/2012 5 9 Agglutination Sperm 10 Cách hoạt động: howitworks.htm 13/12/2012 6 Miễn dịch ngƣng kết (Agglutination) 11 Ưu điểm của phương pháp - Đơn giản - Chỉ cần trang bị máy quang phổ kế đo được bước sóng 340 nm và ủ nhiệt ở 37oC. Khuyết điểm - Hạn chế trong 1 số thử nghiệm - Độ nhạy của cơ chất phát hiện khá thấp. Miễn dịch kết tủa (Immuno-precipitation) 12 Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT tạo kết tủa trong môi trường thích hợp (như polyethylene glycol) Nếu lượng KT quá nhiều sẽ tạo thành độ đục và đo ở bước sóng UV (340nm). 13/12/2012 7 Miễn dịch kết tủa (Immunoprecipitation) 13 Miễn dịch khuyếch tán đơn (Single radial immunodiffusion, RID) 14 13/12/2012 8 15 Kỹ thuật Mancini • Kháng huyết thanh này được hòa tan vào thạch đun lỏng • Hỗn hợp thạch-kháng huyết thanh được đổ rải đều • Đục các lỗ tròn trên thạch và cho huyết thanh cần đo hoặc huyết thanh chứng vào • Kháng nguyên sẽ khuyếch tán theo hướng ly tâm từ các lỗ ra vùng thạch có chứa kháng huyết thanh • Vòng tủa mất 48 giờ mới ổn định=>tương đối nhạy (->5 mg/lít) và đáng tin cậy 16 13/12/2012 9 Đường chuẩn dùng trong kỹ thuật Mancini 17 Miễn dịch khuyếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) 18 Kỹ thuật này dựa trên sự hình thành cấu trúc mạng lưới của agarose. Các phân tử có trọng lượng nhỏ hơn 200 kDa khuếch tán dễ dàng trong agarose, các phân tử có trọng lượng lớn di chuyển chậm và khó khăn hơn. Kỹ thuật Ouchterlony 13/12/2012 10 Immuno-diffusion 19 Miễn dịch khuyếch tán kép trên thạch 20 13/12/2012 11 21 Căn cứ vào đường kết tủa có 3 trường hợp xảy ra + Các giếng chứa kháng nguyên đều đồng nhất và tương ứng với kháng thể thì các đường kết tủa gặp nhau và nối liền nhau => hiện tượng hai kháng nguyên đồng nhất + Hai giếng chứa kháng nguyên chỉ có một phần tương ứng với một phần khác nhau của kháng thể thì sẽ xuất hiện hai đường kết tủa cắt nhau => hai kháng nguyên không đồng nhất nhau + Hai giếng chứa kháng nguyên có liên quan một phần với kháng thể (cùng có chung một epitop A), sẽ tạo ra hai đường kết tủa gặp nhau, nhưng là một đường dài và một đường ngắn hơn 22 13/12/2012 12 23 Miễn dịch Enzyme (ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay) 24 Nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (định lượng) bằng chất đánh dấu là một enzyme (alkaline phosphatase hoặc peroxidase) ELISA thuộc hệ thống kỹ thuật MD enzyme pha rắn (giá đỡ KN hay KT). Pha rắn là điều kiện cần thiết cho thành công của phản ứng, trên đó phản ứng MD được xảy ra. Tùy theo yêu cầu kỹ thuật pha rắn có thể là: - Bề mặt polystyrol, polyvinylchlorid, các chất dẽo… các thành phần phản ứng được hấp phụ vật lý. - Cellulose, agarose… các thành phần phản ứng được gắn bởi các liên kết hóa học. 13/12/2012 13 Maùy ño quang Maùy uû Maùy röûa Khaùng IgM Khaùng nguyeân Coäng hôïp Cô chaát Ño maät ñoä quang Phản ứng gồm các giai đoạn cơ bản 26 Giai đoạn 1: Kết hợp KN và KT Giai đoạn 2: Kết hợp chất đánh dấu (conjugate enzyme) vào phức hợp KN và KT Giai đoạn 3: Biểu hiện màu và đọc kết quả 13/12/2012 14 Miễn dịch vi hạt (MEIA) (micro-particle enzyme immuno assay) 27 - Cải tiến từ kỹ thuật ELISA: pha cứng (solid phase) của phản ứng (KN hay KT) được gắn trên các vi hạt treo lơ lững trong dung dịch. - Các ưu điểm: + Tăng diện tích tiếp xúc KN và KT, làm tăng độ nhạy, giảm thời gian ủ, giảm thời gian làm phản ứng + Giúp tự động hóa kỹ thuật rửa, giúp rửa sạch hơn Miễn dịch huỳnh quang (FIA) (fluoro immuno assay) 28 Kỹ thuật thực hiện bao gồm các giai đoạn cơ bản như kỹ thuật ELISA, ngoại trừ 2 điểm sau: - Thay thế chất đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang. - Phát hiện (định lượng) chất đo bằng một quang kế huỳnh quang (fluorometer) Khuyết điểm cơ bản nhất là vấn đề nhiễu, chất phát huỳnh quang có thể hiện diện trong tự nhiên. Do đó tín hiệu huỳnh quang phát ra phải cao hơn hẳn so với nhiễu  Độ nhạy của thử nghiệm này không cao. 13/12/2012 15 KT gắn FITC Tiêu bản tế bào nhiễm bệnh Kháng thể (KT) Miễn dịch huỳnh quang (FIA) (fluoro immunoassay) Miễn dịch phóng xạ (RIA) (radial immuno assay) 30 Kỹ thuật thực hiện bao gồm các giai đoạn cơ bản như kỹ thuật ELISA, ngoại trừ 2 điểm sau: + Chất đánh dấu là một đồng vị phóng xạ của một nguyên tố như I125 hay Co63 + Phát hiện (định lượng) chất đo bằng một máy đếm phóng xạ (Geiger Meter) Phương pháp này có độ nhạy tốt, nhưng tốc độ phản ứng chậm và cần nhiều thời gian để đếm bức xạ phát ra 13/12/2012 16 Tạo các Ag phóng xạ bằng miễn dịch cạnh tranh 32 13/12/2012 17 33 Miễn dịch hóa phát quang trực tiếp (DCLIA) (Direct-chemiluminescense immuno assay) 34  Chất đánh dấu là phân tử khả năng phát quang khi thay đổi pH môi trường (Acridinium Ester ).  Phức hợp KN-KT sau khi rửa sẽ thêm vào một chất acid, sau đó khi cho vào chất kiềm, trong vòng 2 giây phân tử Acridinium Ester sẽ phát quang.  Để định lượng ánh sáng phát ra, cần dùng buồng nhân quang (luminometer) trong buồng tối, lượng ánh sáng phát ra tỉ lệ với nồng độ cơ chất cần phân tích có trong mẫu thử. 13/12/2012 18 35 PP gaén tröïc tieáp Khaùng theå treân pha raén gaén vaøo KN trong HT beänh nhaân, sau ñoù ñöôïc gắùn vaøo chaát lieân keát khaùng theå mang acridinium PP gaén caïnh tranh KN caàn ño vaø chaát ñaùnh daáu mang acridinium gaén caïnh tranh vaøo KT treân pha raén Miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA) (Electro-chemiluminescense immuno assay) 36 Dựa trên sự sử dụng phức hợp Ru(bry)3 2+ (Ruthemium (II) và tris (bipyridyl) và TPA (Tripropylamine). Hoạt động có sự khởi động điện. Phản ứng xảy ra dưới tác dụng của điện áp. Khi đặt một điện thế lên điện cực buồng đo, phức hợp ruthenium được kích hoạt và tín hiệu phát quang được hình thành 13/12/2012 19 37 38 Máy điện hóa phát quang 13/12/2012 20 e - Ñieän cöïc e - TPA TPA ** TPA* [Ru(bpy) 3 3+ ] [Ru(bpy) 3 2+ ] [Ru(bpy) 3 2+ ] Photon (620nm) H + e - NỘI DUNG NẮM BẮT KIẾN THỨC 40 PHÖÔNG PHAÙP MIEÃN DÒCH CAÙC XEÙT NGHIEÄM ÑÒNH LÖÔÏNG Mieãn dòch ngöng keát ñoä ñuïc Caùc heä thoáng maùy sinh hoùa töï ñoäng vaø baùn töï ñoäng Apo A 1 , Apo B , C 3 , C 4 , CRP, Ferritin IgA, IgG, IgM, Microalbumin… Mieãn dòch men (ELISA, MEIA) Caùc heä thoáng ELISA thuû coâng vaø baùn töï ñoäng Abbott (AxSYM) BioMerrieux (Vidas, MiniVidas) Caùc hormon: TSH, LH, FSH, Prolactin, FT3, FT4, TBG, Thyroglobulin, Insulin, Testosteron, Progesteron… Caùc chæ ñieåm ung thö: CEA, PAS, AFP, NSE… Caùc XN vieâm gan sieâu vi: Anti HAV, 5HBV, Anti HCV… Caùc chaát khaùc: Troponi I, TroponinT, Ferritin… Mieãn dòch huyønh quang Abbott (iMX, AxSYM) Hoùa phaùt quang tröïc tieáp Abbott (Architect i2000 ) Bayer (ACS:180SE, ADVIA centaur) Ñieän hoùa phaùt quang Roche (Elecsis 1010, Elecsis 2010) 13/12/2012 21 KẾT THÚC CHƢƠNG 6 41