Các phương pháp xác định trình tự của acid nucleic

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CỦA acid nucleic Các phương pháp phân tích acid nucleic đã đề cập trong các chương vừa qua cung cấp nhiều thông tin về acid nucleic nghiên cứu nhưng chưa cho phép kết luận về bản chất của nó, cụ thể là acid nucleic ấy tương ứng với gen gì, có chức năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào. Thông tin này chỉ có thể rút ra được từ việc xác định trình tự nucleotide của acid nucleic. Hai phương pháp xác định trình tự chính là phương pháp hóa học của Macxam và Gilbert (1977) và phương pháp enzyme học của Sanger và cộng sự (1977). Dù rất khác nhâu về nguyên tắc hai phương pháp này đều có một số điểm chung : hình thành một tập hợp nhiều oligonucleotide có chiều dài khác nhau, mỗi olygonucleotide có sác xuất xuất hiện bằng nhau trong phản ứng. Các trình tự này sau đó được phân tách dựa vào kích thước bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có khả năng phân tách hai trình tự chỉ cách nhau một nucleotide. Kết quả đọc được trên bản phóng xạ tự ghi hoặc nhờ một máy dò tự động. I-Nguyên tắc hóa học : Phương pháp Macxam và Gilbert. Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử ADN cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học. Trước hết phân tử ADN được đánh dấu bằng 32P ở một đầu. Sau đó, chúng được chia thành 5 phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lý hóa học chuyên biệt có khả năng làm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và sau đó cắt phân tử AND ngay tại nnucleotide ấy. Năm nhóm nucleotide bị tạc động là : G, A, C , G + A , T + C. Kết quả của sự xử lý hóa học lả sự hình thành nên năm tập hợp olygonucleotide, các olygonucleotide trong một tập hợp có kích thước khác nhau nhưng lại cung chấm dứt tại cùng một loại nucleotide. Cuối cùng năm phân đoạn trên được đen đi phân tách trên gel polyacrylamide. Vị trí của các oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được phát hiện nhờ đầu đánh phóng xạ. Kết quả được đọc trên bảng phóng xạ tự ghi II-Phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotide của Sanger Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme ADNpolymerase mạch bổ xung cho trình tự ADN mạch đơn cần xác định. Đặc trương của phương pháp là ngoài bốn loại nucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide là những loại deoxynucleotide trong đó nhóm 3′OH được thay bằng H. Điều này khiến các didoxynucleotide không còn khả năng hình thành các nối phosphatdiester và do đó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp. Trình tự ADN cần được xác dịnh phải được tạo dòng trong một vecter mạch đơn (phage M 13). ADN polymerase sử dụng có thể là đoạn Klenow của ADN polymerase I, Taq polymerase hay Sequanase. Sự tổng hợp mạch mới bắt đầu từ một mồi bắt cặp với một trình tự chuyên biệt trên phage M 13, với sự hiện diện của bốn loại nucleotide trong đó một loại được đánh dấu đồng vị phóng xạ (35S). Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn phân đoạn riêng. Người ta lần lượt cho vào mỗi phân doạn một trong bốn loại dideoxynucleotide với hàn lượng rất nhỏ. Do hàm lượng thấp nên thỉnh thoảng mới có một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp một oligonucleotide; và lập tức sự tổng hợp oligonucleotide đó ngùng lại. Tính xác suất thì trong mỗi phân đoạn sẽ có mặt tất cả các cỡ oligonucleotide ứng với tất cả các nucleotide cùng loại hiện diện trên ADN. VD : nếu trình tự DNA cần xác định là AATCGATAGGCTTGCATG thì trong phân đoạn có mặt dideoxynucleotide ddC sẽ có sự tổng hợp các oligonucleotide sau: AATC AATCGATGGC AATCGATGGCTTGC Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp sẽ được đem phân tách trên gel polyacrylmide và kết quả dược đọc trên bản phóng xạ tự ghi. III-Các phương pháp cải biên từ phương pháp của Sanger Trong thực nghiệm, việc sử dụng phương pháp chính thống nêu trên đòi hỏi thao tác phức tạo vì phải tạo dòng trở lại đoạn DNA cần xác định trình tự vào một vecter mạch đơn (phage 13). Do đó, để đơn giản hóa, ngay từ đầu người ta tạo dòng với vecter là các plasmid thế hệ thứ ba. Ở hai bên của đoạn DNA được tạo dòng, các plasmid này có mang hai trình tự chuyên biệt, mỗi trình tự nằm trên một mặt. khi cần xác định trình tự của mạch nào, trước hết người ta tách rời hai mạch (biến tính bằng NaOH) rồi sử dụng mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt nằm trên mạch đó. Phản ứng tổng hợp xảy ra thoe nguyên tắc đã nêu ở phần trên. 1-Xác định trình tự bằng máy tự động Trong kỹ thuật này, người ta không đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất –các fluochrome. Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau. Như vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacryl amide, kết quả sẽ được đọc qua một hệ thống vi tính. Tất cả các phương pháp vừa kể đều dùng để xác định trình tự của một DNA đã được tạo dòng. Sự ra đời của phương pháp PCR cho phép xác định trực tiếp trình tự của một DNA khuyếch đại bằng PCR không qua tạo dòng. 2-Phương pháp PCR dùng trong xác định trình tự nucleic acid Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự phối hợp giữa phương pháp PCR và phương pháp sử dụng các dideoxynucleotide.Phương pháp chỉ sử dụng được khi vùng cần xác định trình tư đã biết trước ; và ứng dụng chủ yếu là dùng phát hiện nhah một đột biến điểm. Trước hết đoạn DNA cần xác định trình tự được khuyếch đại bằng phương pháp PCR. Sau đó, hai mạch của phân tử DNA được tách rời nhau. Mỗi mạch được bắt cặp với một mồi (có thể là mồi dùng cho phản ứng PCR hay một mồi nằm bên trong đoạn DNA). Phản ứng tổng hợp xảy ra tượng tự như trong các phương pháp enzyme học sử dụng dideoxynucleotide. *************************************** Tóm tắt Các phương pháp xác định trình tự nucleic acid đều dựa vào hai nguyên tắc : -Nguyên tắc hóa học (phương pháp Macxam-Gilbert): dựa vào các phản ứng hóa học thủy giải đặ c hiệu DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau. -Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên) : dựa vào sự tổng hợp mạch bổ xung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau. Ở cả hai trường hợp, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylmide có khả năng phân tách hai trình tự DNA chỉ trên nhau một nucleotide. Với việc sử dụng một loại nucleotide có đánh dấu đồng vị phóng xạ, kết quả trình tự cần xác định được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di. *********************************************