Cập nhật những kĩ thuật mới trong chuyển gen động vật

Cập nhật những kĩ thuật mới trong chuyển gen động vật Th.s Nguyễn Thái Quỳnh Anh Đại học Khoa Học Tư Nhiên Tp HCM nguyenthaiquynhanh@gmail.com Protein tái tổ hợp Human growth hormone Human insulin Granulocyte colony-stimulating factor Follicle-stimulating hormone Factor VIII Insulin-like growth factor 1 Suy giảm miễn dịch do thiếu Adenosine desaminase Tách tế bào T  nuôi cấy in vitro  chuyển gene lành  tiêm các tế bào này trở lại máu của bệnh nhân  hệ miễn dịch tăng cường, nhưng không hoàn toàn bền vững  lặp lại sau vài tháng (1990) SCID (Severe Combined Immunodeficiency) (bubble boy disease) Liệu pháp gen Động vật chuyển gen Tạo ra động vật với đặc điểm di truyền mong muốn: - Sản phẩm từ động vật - Tạo ra các động vật kháng bệnh ( kháng thể, vaccine) - “Bioreactor” sản xuất sinh dược phẩm - Mơ hình động vật bệnh lý Tái thiết lập chương trình Induced pluripotent stem cells (iPS cells hoặc iPSCs) Tế bào gốc vạn năng được tạo ra từ tế bào trưởng thành CÁC THÀNH PHẦN CHUYỂN GENE VẬT LIỆU DI TRUYỀN CẦN CHUYỂN 1. Gene sửa chữa hay thay thế 2. Gene gây chết 3. Antisense nucleic acid Vật liệu di truyền cần chuyển gồm : Gene cần chuyển + Promoter mạnh + Gene chọn lọc Liên kết với plasmid hay vector là virus PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE 1. Vector virus 2. Vector không phải là virus 3. Phương pháp vật lý : vi tiêm, súng bắn gene CHIẾN LƯỢC CHUYỂN GENE Hai nhóm chíến lược chính : - Ex vivo  in vivo - In vivo Tế bào nhận gene chuyển: tế bào chưa biệt hóa như dòng tế bào tạo máu, nguyên bào sợi, nguyên bào cơ,.. Figure 9.2 TẠO DỊNG PHÂN TỬ Các phương pháp chuyển gen  Hệ thống chuyển gen khơng sử dụng virus Phương pháp hĩa chất Phương pháp vật lí Phương pháp vi tiêm  Hệ thống chuyển gen sử dụng virus Adenovirus Lentivirus Retroviris  Đóng gói bên ngoài  Nhập bào  Thoát khỏi endosome  Đi vào nhân  Biểu hiện HỆ THỐNG CHUYỂN KHÔNG DÙNG VIRUS Lipoplex là các túi nhỏ hình thành từ 1 lớp màng đơn lipid tích điện dương, đường kính 50-200 nm. Trộn các liposome này với dung dịch DNA  phức hợp tích điện dương bao lấy DNA  phức hợp kết hợp với bề mặt tế bào tích điện âm và được đưa vào trong Ưu điểm : - Tính bền - Khả năng gắn DNA, RNA trần rất cao, hầu như không có giới hạn kích thước đoạn gene cần chuyển - Có thể xâm nhiễm mọi loại tế bào - Không có tính kháng nguyên & các hoạt tính sinh học không mong muốn Nhược điểm : Không có tính đặc hiệu tế bào LIPOPLEX POLYPLEX Polyplex là 1 phức hợp phân tử hai chức năng dùng để gắn DNA & chuyển DNA vào tế bào đích thông qua sự gắn lên thụ thể & sự nhập bào. Một phần của phức hợp là 1 nhóm gắn DNA (như polylysine tích điện dương), phần kia là 1 ligand của 1 thụ thể đặc hiệu nằm trên tế bào đích Ưu điểm : khắc phục nhược điểm của lipoplex và các vector virus DEAE -Dextran Calcium Phosphate Liposome Điện biến nạp Vi Tiêm Tế bào chất Vi tiêm với DNA ngoại lai Pipette giữ Nhân Súng bắn gen CHIẾN LƯỢC CHUNG ĐỂ TẠO VECTOR VIRUS TRONG LIỆU PHÁP GENE VECTOR RETROVIRUS Vector đầu tiên được sử dụng cho liệu pháp gene sau khi đã được biến đổi để trở thành không hoàn chỉnh và để có thể xâm nhiễm nhiều loại tế bào. Nguồn gốc là MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Bộ gene chứa 3 gene gag-pol-env. Ba gene này sẽ bị loại bỏ và thay thế bằng gene cần chuyển Ưu điểm : (1) Hiệu quả xâm nhiễm tế bào cao (2) Vector không hoàn chỉnh  không có khả năng lây lan (3) Gắn xen được vào bộ gene  biểu hiện bền vững Nhược điểm : (1) Đoạn gene < 7.5 kb (2) Chỉ xâm nhiễm tế bào đang phân chia (3) Gắn chèn vào bộ gene  có khả năng gây ung thư (4) Khả năng tái sắp xếp lớn Vector Lentivirus 1. Nhiễm virus vào tế bào đích 2. Sao chép ngược bộ gen RNA thành DNA 3. Chuyển DNA virus vào trong nhân 4. Dịch mã trong cytoplasm tạo thành các protein in Gag- Pol – Env 5. Sự hình thành và đĩng gĩi capsid với 2 mạch RNA và các reverse transcriptase 6. Các virion làm “nổ” tế bào để tự thốt ra VECTOR ADENOVIRUS „ Jesse Gelsinger, 18 tuổi (Pennsylvania, 1999) - Thiếu hụt enzyme Ornithine transcarbamylase - chết sau 4 ngày LPG - Có thể do vector adenovirus gây các phản ứng miễn dịch trầm trọng DNA mạch đôi có thể mang gene mục tiêu > 30 kb Ưu điểm :  Là kí chủ thường xuyên ở người, đã được sử dụng thường xuyên như vaccin  quen thuộc với hệ thống miễn dịch người  Xâm nhiễm cả các tế bào không phân chia  DNA không gắn xen vào bộ gene nhưng có thể biểu hiện ổn định nếu tế bào không phân chia Nhược điểm : Tính kháng nguyên mạnh  gây đáp ứng miễn dịch mạnh Vector Adeno-associated Virus MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE Một số nhược điểm của vector virus : - Tính đặc hiệu tế bào quá cao (nhất là các retrovirus) - Kích thước gene cần đưa vào hạn chế - Sự gắn xen ngẫu nhiên vào NST - Tạo phản ứng miễn dịch không mong muốn CÁC CHIẾN LƯỢC CHUYỂN GENE PHƯƠNG PHÁP NHƯỢC ĐIỂM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- EX VIVO Vector virus (retro/adenovirus, HSV) Tính ổn định, độ an toanø Các phương pháp hóa học, vật lý (hóa/điện Hiệu quả, tính ổn định, biến nạp, vi tiêm, súng bắn gene, liposome,..) tính đặc hiệu tế bào ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- IN VIVO Tế bào đã nhận gene chuyển ex vivo Tính ổn định của tế bào Vector virus Hiệu quả, tính ổn định, độ an toàn, trúng đích Các phương pháp hóa học, vật lý - Liposome Hiệu quả, trúng đích - Vi tiêm vào cơ Hiệu quả, phân bố trong cơ å thể Phương pháp ex vivo Phương pháp in vivo PHƯƠNG PHÁP EX VIVO Gene được chuyển vào tế bào nuôi cấy in vitro rồi tế bào có nhận gene chuyển được đưa trở vào người bệnh MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP EX VIVO  Tế bào sử dụng phải có các tiêu chuẩn : (1) dễ lấy ra & cấy ghép trở lại cơ thể (2) có khả năng sinh sôi & chuyển vật chất di truyền cho thế hệ con (3) có khả năng biểu hiện nhiều loại protein  Các loại tế bào thường được sử dụng là : tế bào tuỷ xương, các loại tế bào chưa biệt hóa như nguyên bào sợi (fibroblast), keratinocyte (tế bào sơ cấp của biểu bì), tế bào gan, đặc biệt là tế bào nguồn lấy từ túi noãn hoàng  Thuận lợi : (1) ghép tự thân  không bị thải loại (2) chuyển gene in vitro cho hiệu quả cao & giúp chọn chính xác tế bào có nhận gene chuyển nhờ marker trên vector (3) tế bào bảo vệ gene khỏi bị phân huỷ khi đưa trở vào cơ thể CÁC CHIẾN LƯỢC CỦA LIỆU PHÁP GENE  Sửa chữa sai hỏng trên gene bệnh  Bổ sung gene lành thay cho gene bệnh  Ức chế biểu hiện của gene bệnh  Tiêu diệt tế bào bệnh SỬA CHỮA SAI HỎNG TRÊN GENE BỆNH Thông qua tái tổ hợp đồng dạng Ưu điểm : tái lập hoàn toàn tình trạng bình thường Nhược điểm : rất khó thực hiện thành công BỔ SUNG GENE LÀNH THAY CHO GENE BỆNH Trong trường hợp gene bệnh không biểu hiện, gene lành được đưa vào tế bào và biểu hiện để tái lập kiểu hình bình thường Ưu điểm : dễ thực hiện Nhược điểm : Biểu hiện của gene không được điều hòa như trong điều kiện bình thường Chỉ sử dụng khi gene bệnh là lặn ỨC CHẾ SỰ BIỂU HIỆN CỦA GENE BỆNH TRIPLEX FORMING OLIGONUCLEOTIDES (TFO) TFOs liên kết với một trình tự DNA mạch đôi thông qua liên kết hydrogen Hoogsteen RIBOZYME-SPLICEOSOME Sửa chữa đột biến trên mRNA thông qua Ribozyme gồm 3 vùng : mã hóa (coding domain), “cắt nối trans” (trans splicing domain) và vùng liên kết với pre-mRNA (binding domain) GÂY CHẾT TRỰC TIẾP  Chuyển gene ức chế phân bào (gene p53 ức chế khối u, gene kháng angiogenesis ức chế sự hình thành mạch máu mới, ..  Chuyển gene “tự sát” mã hóa enzyme chuyển “tiền thuốc” thành thuốc tiêu diệt tế bào GÂY CHẾT GIÁN TIẾP THÔNG QUA VIỆC KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH  Chuyển gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của tế bào khối u  kích thích hệ thống miễn dịch nhận diện và tiêu diệt tế bào biểu hiện kháng nguyên bề mặt của khối u.  Chuyển gene cytokine  kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động mạnh lên và tiêu diệt tế bào khối u. CÁC KIỂU GÂY CHẾT TẾ BÀO BỆNH GÂY CHẾT TẾ BÀO BỆNH  “Tiền thuốc” (prodrug) không gây độc cho tế bào  Dưới tác động của gene “tự sát” trong tế bào, “tiền thuốc” thuốc gây độc tế bào  Thuốc khuếch tán  tạo tác động “bystander” với các tế bào hay mô kế cận CÁC GENE TỰ SÁT (SUICIDE GENES) ADEPT (Antibody Direct Enzyme Prodrug Therapy) GPAT : Glycerol-3-phosphate acyltransferase (GDEPT-Gene Direct Enzyme Prodrug Therapy) VDEPT (Virus Direct Enzyme Prodrug Therapy) HSV-TK: Herpes simplex virus – thymidine kinase GCV : nucleoside Gancyclovir VÍ DỤ VỀ LIỆU PHÁP GENE TRONG UNG THƯ TUYẾN GIÁP  dn-RET (dominant negative)- proto- oncogene với “đột biến thêm chức năng” sẽ bất hoạt oncoprotein bình thường  PTP (Protein Tyrosine Phosphatase) điều hòa biểu hiện của TNF (Tumor Necrosis Factor)  Gadd45 kiểm tra chu trình tế bào, sửa sai DNA, apoptosis  HMGI(Y) (High Mobility Group) : Protein “nonhistone” trong nhân ở ĐV có vú có tính linh động điện di cao, biến đổi cấu trúc DNA và NSC làm ảnh hưởng đến sự sao chép, phiên mã, tái tổ hợp,, liên quan đến sự hình thành khối u và di căn  ONYX-015 là 1 adenovirus nhân bản trong tế bào không biểu hiện p53 (protein sửa sai)  NIS (Sodium Iodide Symporter) + hóa trị 131I Kĩ thuật chuyển gen trong tạo động vật biến đổi gen 1. Vi tiêm 2. Chuyển gen thơng qua retrovirus 3. Chuyển tế bào gốc phơi Qui trình chuyển tế bào gốc phơi 1. Tế bào gốc phơi (ES) được thu nhận từ lớp ICM của blastocysts trong giai đoạn phơi sớm 2. ES được nuơi cấy in vitro và xâm nhiễm với gen chuyên biệt 3. ES biến đổi gen được vi tiêm vào blastocyst để thành lập mơ dịng sinh dục và sinh dưỡng Kĩ thuật knock-out gen • Qui trình chung – Tạo dịng vector – Vector được chuyển vào tế bào gốc phơi và tái tổ hợp với vùng nst định trước – Chọn lọc marker lần 1 (neomycine gene) – Chọn lọc marker lần 2 (herpes simplex virus - thymidine kinase gene và Ganciclovir) – Kiểm tra tái tổ hợp đồng dạng • Chuột: mơ hình động vật hiệu quả – Nghiên cứu bệnh người (Alzhemer, Viêm khớp) – Phát triển thuốc và liệu pháp • Knock-out gen mục tiêu – Chèn DNA vào vị trí đặc hiệu nst – Bất hoạt gen đặc hiệu trên nst – Đưa đột biến vào động vật thí nghiệm tạo mơ hình bệnh Nobel prize in Physiology or Medicine 2007 Nguyên tắc cho kĩ thuật biến đổi gen mục tiêu trên chuột bằng cách sử dụng tế bào gốc phơi -Knock-out: bất hoạt chức năng của gen bằng cách loại bỏ tồn bộ hay một phần -Knock-in: đưa một đột biến vào gen nội sinh Hệ thống Cre/lox • Hệ thống tái tổ hợp Cre/lox dùng để phân tích chức năng gen in vivo. Hai thành phần: Cre recombinase protein điều hịa sự tái tổ hợp đặt hiệu nằm giữa vị trí loxP Xĩa, chèn, chuyển và đảo đoạn trong DNA tế bào Cho phép DNA biến đổi trở thành mục tiêu cho loại tế bào đạt hiệu hoặc được hoạt hĩa bởi sự kích thích đặt hiệu bên ngồi Hoạt động ở cả eukaryo và prokaryo Cre recombinase protein (38-kDa) được mã hĩa bởi bacteriophage P1. Cre liên kết với vị trí loxP ( chưa sáng tỏ). Một cre bám một trong 2 vị trí bám dính recombinase lox-P 13-bp lặp lại đảo ngược xung quanh vùng trao đổi đoạn trung tâm. Cre thúc đẩy tiếp hợp của vùng DNA chứa lox-P và xúc tác sự tái tổ hợp giữa 2 vị trí . • Lox P (locus of X-over P1) 34-bp là vị trí nhận diện của Cre recombinase • Tồn tại trình tự bất đối xứng (8 bp) ở giữa với 2 trình tự xuơi dọc hai bên (13-bp). Trình tự bất đối xứng là yếu tố qui định về định hướng của vị trí Lox-P – 2 LoxP site với cùng định hướng => xĩa bỏ trình tự giữa – 2 LoxP đối hướng => đảo trình tự giữa – 2 trình tự DNA riêng biệt + 1 LoxP tương ứng => translocation RNA can thiệp (iRNA) • Làm im lặng sự biểu hiện gen bằng cách giảm sự biểu hiện gen • Ngăn cản mRNA dịch mã • Tạo chuột chuyển gen – Tiêm tiền nhân – Lentiviral vector Knock-out gen mục tiêu sử dụng RNAi • Giới hạn thời điểm và mơ đặc hiệu cho biểu hiện RNAi 2012 iPS Cell Reprogramming Using mRNA • Khơng sát nhập vào bộ gen, loại bỏ nguy cơ đột biến • Mức độ biểu hiện protein tạm thời được điều hịa dễ dàng • Nhanh chĩng tái thiết lập chương trình (16 ngày) • Phù hợp cho ứng dụng lâm sàng: mơ hình bệnh, y học tái tạo. In Vitro mRNA Production ? Pig fibroblasts cells Pig knockout Pancreatic, heart, liver, kidney related genes cells Lentiviral vector siRNA ? ? ? Cloned pig with human organs Pig enucleated oocyte Embryo transfer Organ related genes knockout cloned pig blastocyst Human iPS cells Mơ hình kết hợp 4 chìa khĩa cơng nghệ sinh học hiện đại thế kỉ 21: chuyển gene, nhân bản vơ tính, iPS cell và cơng nghệ sinh sản STAP Cells Thanks you!