Chương 2: Các kỹ thuật nền của công nghệ sinh học hiện đại (tiếp theo)

LOGO Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo) Nguyen Thi Viet Anh www.themegallery.com Nội dung 1. Các kỹ thuật chính dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.2. Các enzym dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.3. Các vector nhân dòng dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.1. Khái niệm 1.4. Nhân dòng gen (gene cloning) 2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA 2.1. Kỹ thuật chiết tách DNA và RNA 2.2. Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA 2.3. Phương pháp PCR 2.4. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 2.5. Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA) 2.6. Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR (AFLP, SSR) 1.5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen 2.7. Genomic và proteomic www.themegallery.com  Ngân hàng bộ gen:  Thư viện DNA từ bộ gen (lắc cơ học, RE);  Khái niệm ngân hàng bộ gen (Bank of genomic DNA): • Đoạn DNA được tách dòng (khác nhau do tế bào, bộ gen, RE,…); • Bao gồm exon và intron; • VD: ngân hàng bộ gen của vi khuẩn; • tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen và đã được tách dòng trong tế bào chủ; • Đầu tiên DNA 300.000-400.000 bp gắn vào YAC hoặc BAC, cắt đoạn nhỏ trung bình 30.000-40.000 bp gắn vào cosmid, cuối cùng là các đoạn trung bình 4.000 bp gắn vào plasmid để giải kí tự chuỗi. 2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA www.themegallery.com 2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA Bước 1: Dùng enzyme cắt giới hạn Bước 2: DNA bị cắt thành nhiều đoạn khác nhau Bước 3: đoạn DNA được đưa vào vector www.themegallery.com Ngân hàng cDNA  Bộ gen Eukaryotae (1,7% gen người-mã hoá protein);  Tập hợp cDNA được tổng hợp nhờ kỹ thuật phiên mã ngược mRNA tương ứng (cDNA=complementary DNA);  Exon;  Enzyme reverse transcriptase, DNA polymerase;…  cDNA từ những đoạn gen đã được phiên mã ra mRNA (khác biệt tuỳ vào tế bào của mô đã được biệt hoá và giai đoạn biệt hoá) tổng hợp các ngân hàng cDNA trong từng loại tế bào, từng loại mô của các cơ quan sẽ hình thành nên ngân hàng cDNA của một cơ quan nào đó.  VD: rễ lúa www.themegallery.com www.themegallery.com www.themegallery.com Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA  Kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA:  Tách chiết và tinh sạch mRNA của tế bào;  Sử dụng kỹ thuật PCR: các đoạn mồi (primer) đặc hiệu, các loại nucleotide tự do, DNA polymerase…  mRNA tổng hợp nên cDNA;  Enzyme RNase H để phân huỷ sợi khuôn RNA;  Tổng hợp sợi đơn cDNA thứ 2 www.themegallery.com Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA  Kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA: có 2 nhóm phương pháp chủ yếu:  Phiên mã ngược bằng phân huỷ hoàn toàn sợi khuôn mRNA (cDNA có cấu trúc kẹp tóc-hairpin loop, S1 nuclease cắt bỏ);  Phiên mã ngược tạo cDNA theo kỹ thuật RACE (rapid amplification of cDNA ends): kỹ thuật nhân nhanh đầu cuối cDNA.  Video cDNA libraries www.themegallery.com  Ưu điểm sử dụng ngân hàng cDNA:  Các dòng c-DNA chứa trình tự mã hoá liên tục của một gen;  Những tế bào chuyên hoá sẽ tạo ra số lượng lớn của 1 loại protein;  Dễ chiết tách; giảm nhẹ việc xác định đúng dòng mong muốn từ ngân hàng gen. Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA www.themegallery.com Phương pháp PCR  PCR = Polymerase chain reaction: phản ứng polymerase dây chuyền:  Khuếch đại một lượng lớn đoạn DNA trong điều kiện in-vitro;  Trong ống nghiệm plastic nhỏ (ependoff);  Khác hẳn với sự tạo dòng các đoạn DNA bằng tế bào vi khuẩn hay nấm men; www.themegallery.com Phương pháp PCR  Nguyên tắc thực hiện:  Sự khuếch đại nhờ vào chu trình nhiệt lập lại (~35 lần) gồm các bước: 1. Đun nóng, biến tính (950C); 2. Làm nguội, gắn mồi (37-650C); 3. Ủ dài, tổng hợp (720C).  Sử dụng các đoạn mồi (primer) để bắt cặp bổ sung với đầu đoạn mạch tương ứng;  DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, vi khuẩn Thermophilus aquatus) www.themegallery.com Phương pháp PCR www.themegallery.com Phương pháp PCR  Phản ứng PCR:  Khuôn mẫu (DNA cần khuếch đại);  Các đoạn mồi (primer ~18-25 Nucleotide);  DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase);  Các nucleotide tự do (dNTP);  Dung dịch đệm thích hợp;  Video phản ứng PCR www.themegallery.com Phương pháp PCR  Lợi ích:  Khuếch đại các trình tự nucleotide đặc hiệu  Thời gian thực hiện cực nhanh;  Đơn giản và ít tốn kém;  Độ tinh sạch của mẫu không cần cao. Giới hạn:  Cần phải biết trình tự nucleotide (hoặc ít nhất là một phần của đoạn cần khuếch đại). www.themegallery.com  Các dạng PCR mở rộng:  RT-PCR (reverse transcripstase PCR): mRNA làm khuôn mẫu chuyển thành cDNA cho sự khuếch đại PCR;  Real-Time PCR: PCR định lượng, có thể biết được số lượng DNA khuếch đại trong quá trình khuếch đại;  PCR-ELISA: kết hợp với miễn dịch trong chuẩn đoán. Phương pháp PCR www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA  DNA: một chuỗi xoắn kép:  4 loại Nucleotide: A (Adenine), C (Cytosine), G (Guanine), T (Thymine);  Xác định trình tự của DNA (sequencing) là biết được trình tự sắp xếp của 4 loại Nu trên chuỗi DNA. www.themegallery.com  Phương pháp hoá học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert: 1. Đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’ của DNA; 2. Xử lí với hoá học làm biến đổi 1 hay 2 base (dimethylsulphate làm biến đổi Guanine, hydrazine và NaCl làm biến đổi Cytosine…); 3. Các Nucleotide biến đổi sẽ bị lấy ra khỏi chuỗi DNA; 4. 4 loại Nucleotide4 nhóm với 4 bản điện di  Tổng hợp đầy đủ 4 bản điện di sẽ phản ánh đầy đủ trình tự các nucleotide của đoạn DNA. Kỹ thuật xác định trình tự DNA www.themegallery.com  Phương pháp hoá học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert: Kỹ thuật xác định trình tự DNA www.themegallery.com  Phương pháp hoá học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert: Kỹ thuật xác định trình tự DNA www.themegallery.com  Hạn chế của phương pháp hoá học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert:  Khó thực hiện;  Cần nhiều thông số tối ưu từ thí nghiệm;  Xác định nồng độ giới hạn của các chất hoá học; Kỹ thuật xác định trình tự DNA www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Phương pháp dideoxy của F. Sanger: 1. Dideoxynucleotide: mất nhóm OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose (nơi gắn dNTP kế cận)dừng tổng hợp DNA; 2. 4 phản ứng với 4 loại ddNTP (A, T, C, G) 3. Cũng có 4 bản điện di www.themegallery.com www.themegallery.com  Các phương pháp xác định trình tự DNA thế hệ mới:  Dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại dNTP Kỹ thuật xác định trình tự DNA www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật giải trình tự 454 pyrosequencing Kỹ thuật giải trình tự dựa trên sự nối với chất hoá học 4 màu www.themegallery.com  Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA):  RFLP=Restriction fragment length polymorphism;  Dựa trên đặc điểm của các loại enzyme cắt giới hạn;  Các đoạn cắt = các “dấu vân tay” (fingerprinting) đặt trưng cho từng loại phân tử;  Bản đồ di truyền các kết quả của RFLP: xác định nguồn gốc hoặc kiểm tra mức độ tiến hoá của các loài sinh vật Kỹ thuật RFLP www.themegallery.com  Bao gồm các bước:  Tách chiết và tinh sạch DNA;  Xử lí bằng enzyme cắt giới hạn;  Điện di đoạn cắt trên gel agarose;  Southern blotting (lai DNA/DNA) Kỹ thuật RFLP www.themegallery.com  Southern blotting:  Phương pháp lai giữa các đoạn DNA mạch đơn của mẫu cần nghiên cứu với các mẫu dò đánh dấu phóng xạ (các đoạn oligo nucleotide đã biết trình tự)  Gồm các bước: Kỹ thuật RFLP Caét ADN baèng men giôùi haïn Ñieän di treân gel Bieán tính ADN (NaOH & NaCl) Chuyeån ADN sang maøng (transfer) Lai vôùi maãu doø ñöôïc ñaùnh daáu baèng ñoàng vò phoùng xaï Röûa maøng lai Phaùt hieän phaân töû lai nhôø phoùng xaï töï ghi (autoradiography) www.themegallery.com www.themegallery.com  Ứng dụng:  Chọn lọc các cá thể; chọn giống động thực vật;  Phát hiện các cặp gen nghiên cứu là đồng hợp hay dị hợp tử hay có liên kết gen…;  Kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo quy luật Mendel;  So sánh sự tiến hoá của các loài;  So sánh sự khác nhau giữa các cá thể trong loài. Kỹ thuật RFLP www.themegallery.com Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR  Kỹ thuật AFLP:  AFLP = Amplified fragment length polymorphism (các đoạn DNA đa hình được khuếch đại chọn lọc);  Các cặp mồi (primer) đặc hiệu khuếch đại đoạn DNA cần nghiên cứu;  Thực hiện PCR lần thứ 2 với các mồi được nối thêm 1 hoặc 2 nucleotide ở đầu 3’ (hoặc 5’) của mồiđể nhân các đoạn DNA có tính đặc hiệu cao;  Cho phép phân biệt mức độ giống nhau khác nhau của các đơn vị dưới loài (quan hệ di truyền gần nhau) www.themegallery.com Kỹ thuật AFLP Kỹ thuật AFLP www.themegallery.com www.themegallery.com Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR  Kỹ thuật SSR:  SSR = Simple sequence repeat (các trình tự lặp lại đơn giản, Arbitrary primer- PCR, PCR mồi tự chọn); Kỹ thuật SSR www.themegallery.com  Các trình tự lặp lại đơn giản (simple sequence repeat):  Hay còn gọi là microsatellite (vi vệ tinh);  Phổ biến trong hệ gen động vật và thực vật;  Thường gồm từ 2-6 cặp base;  Số lượng lặp lại từ 2-40 lần. Kỹ thuật SSR www.themegallery.com  Ưu điểm:  Khả năng phát hiện tính đa hình cao;  Phát hiện được kiểu gen đồng hợp hay dị hợp.  Tiết kiệm thời gian và hoá chất.  Nhược điểm:  Thiết kế mồi đặc hiệu cho từng locus;  Khó xác định mối quan hệ giữa các allele với những trình tự lặp lại SSR này. www.themegallery.com Ý nghĩa của các kỹ thuật Gene Đặc tính Nguồn Nhiễm sắc thể Liên kết marker Khoảng cách Bph-10(t) Rầy nâu O.australi ensis 12 RG457 3.68 cM Pi-1 Đạo ôn LAC23 11 Npb181 3.5 cM Xa-1 Bạc lá Kogyoku 4 Npb235 3.3 cM Xa-4 Bạc lá IR20 11 Npb181 1.7 cM www.themegallery.com Bản đồ di truyền nhiễm sắc thể số 12 của cà chua www.themegallery.com Bản đồ di truyền nhiễm sắc thể số 10 của bắp www.themegallery.com  Giải kí tự chuỗi DNA của hàng loạt mô hình:  Vi khuẩn E.coli (kích thước 4,6 Mb; năm 1997; số lượng 4.200 gen);  Nấm men Saccharomyces (kích thước 12,1 Mb; năm 1996; số lượng 6.034 gen);  Thực vật Arabidopsis thaliana (kích thước 100 Mb; năm 2000; số lượng 25.000 gen);  Con người (kích thước 3200 Mb; năm 2003; số lượng khoảng 30.000 gen) Genomics www.themegallery.com Genomics www.themegallery.com  Genome = bộ gen;  Sự giải kí tự chuỗi thành công ở bộ gen người và hàng trăm sinh vật khác đã tạo nên khoa học về bộ gen gọi là Genomics hay bộ gen học;  Cho phép hiểu chi tiết về cơ chế phân tử của sự sống, xác định được trình tự DNA nhanh chóng và các chức năng;  Phát hiện, bảo tồn và sử dụng sự đa dạng sinh học. Genomics www.themegallery.com  Proteomics: nghiên cứu toàn bộ các phức hợp protein, gồm vị trí, chức năng, các biến đổi và tương tác;  Ứng dụng trong sản xuất ra hormon và vaccin có hiệu quả với số lượng lớn;  Mạng lưới các gen điều hoà;  Chữa trị một số bệnh do thiếu biến đổi sau dịch mã;  Mạng lưới biểu hiện gen giữa các loài Proteomics www.themegallery.com www.themegallery.com  Nhập môn CNSH – Phạm Thành Hổ;  Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thuỳ Dương;  Biện pháp sinh học trong Bảo vệ thực vật – Nguyễn Văn Đĩnh;  Bài giảng về công nghệ sinh học trong bệnh cây-Hà Viết Cường;  System biology – Pierre Hilson;  Molecular breeding and biodiversity of plants- Isabel Roldan Ruiz;  Google.com.vn  …. Tài liệu tham khảo LOGO