Chương 2: Công nghệ gen và các ngành học omics

CễNG NGHỆ SINH HỌC Chương 2: CN gen và các ngành học omics 2.1. Các phương pháp NC SHPT/CN Gen 2.2. Genomics 2.3. Proteomics 2.4. Omics 2.5. Chỉ thị phân tử - MAS 2.6. Microarray – DNA/Protein chip Cụng nghệ gen là chỡa khúa để phỏt triển Cụng nghệ sinh học 1. Cụng nghệ DNA tỏi tổ hợp là cụng nghệ nền chủ đạo 2. Bản chất phõn tử của gen 3. Xỏc định trỡnh tự nucleotid bộ gen 4. Nội dung của kĩ thuật ADN tỏi tổ hợp 5. Cỏc ứng dụng của Cụng nghệ gen DNA is packaged in the cell nucleus as chromosomes Image compliments of National Human Genome Research Institute DNA is tightly coiled into chromosome structures which are found in the nucleus of all living cells in plants and animals. DNA sequences encode protein sequences Image compliments of National Human Genome Research Institute Giới thiệu về cụng nghệ gen Hiện thực nhờ: 1. Kĩ thuật đọc trỡnh tự 2. Kĩ thuật AND tỏi tổ hợp ứng dụng: 1. Xỏc định trỡnh tự genom 2. Biến nạp gen 3. Nhận dạng cỏ thể Acid Phosphoric Đường Ribose Base hữu cơ Adenin Thymidin Cytocin Guanin 3 Thành phần tạo nờn một nucleotid 3’ 5’ Phõn tử ADN xoắn kộp Gen = ADN Mó di truyền = Bộ ba nucleotid mó hoỏ cho trỡnh tự acid amin trong phõn tử protein Đột biến ở trỡnh tự nucleotid tạo nờn thay đổi nguy hiểm trong phõn tử protein Dịch mó gen là Sinh tổng hợp protein ADN mARN Protein Ribosom Cỏc Phương phỏp sinh học phõn tử trong nghiờn cứu genome 1. PCR: Phản ứng chuỗi polymerase -Polymerase Chain Reaction (PCR) 2. RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA – DNA đa hỡnh nhõn bản ngẫu nhiờn 3. AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism - đa hỡnh chiều dài phõn đoạn nhõn bản 4. RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism - đa hỡnh chiều dài phõn đoạn cắt hạn chế 5. SSR: Simple Sequence Repeats Cỏc trỡnh tự lặp lại đơn giản 1. PCR 1. Định nghĩa: PCR là quỏ trỡnh nhõn bản một hay nhiều phõn đoạn ADN thụng qua polymerase trong điều kiện in vitro. 2. Tỏc giả: Kary Mullis (1985), GiảI Nobel 1993 3. Nguyờn lý: a) Thành phần phản ứng: - ADN khuụn - 4 loại dNTP - Taq polymerase (Thermus aquaticus) chịu được 95oC và hoạt tớnh tối ưu ở 75OC - 1-2 loại đoạn mồi primer b) Quỏ trỡnh phản ứng  PCR Chỉ cần một lượng nhỏ ADN ban đầu cú thể nhận được số lượng bản copy rất lớn (1 triệu bản trong 2 giờ) Bước 1: Biến tớnh dsDNA ssDNA: 94oC, 60 s Bước 2: Tiếp hợp mồi với ssDNA: 37-68oC, 60 s Bước 3: Tổng hợp sợi DNA: 72oC, 90 s Bước 1 + 2 + 3 = 1 Chu kỡ Kết Quả Sau 1 chu kỡ 1 PT DNA 2 PT DNA PCR 20-40 (n) vũng: 2n PT DNA Giáo lý trung tâm (Central Dogma) & Lai Phân Tử DNA > Lai DNA+DNA* (probe=Mẫu dò)=Lai > Southern + Gene được tìm thấy mRNA > lai RNA+DNA* = Northern > Gene được phiên mã thành mRNA Protein > Lai Western = Lai protein (kháng nguyên) + Kháng thể (Miễn dịch) > Khẳng định sản phẩm dịch mã của gene được tạo ra. Biol. Activity > Biotest (thử sinh học) Lai phõn tử Molecular hybridization 1. Lai Southern: DNA+DNA* - Nguyên lý: DNA genome ss + DNA* mẫu dò ss theo nguyên tắc base bổ sung - Mục đích: Khẳng định sự tồn tại của gen 2. Lai Northern: RNA+DNA* - Nguyên lý: mRNA lai với DNA* mẫu dò theo nguyên tắc base bổ sung - Mục đích: Khẳng đinh gen được phiên mã thành mRNA 3. Lai Western: Protein Kháng nguyên+ Protein Kháng thể* - Nguyên lý: Phản ứng miễn dịch giữa KN với KT. - Mục đích: Khẳng định gen được biểu hiện thành sản phẩm 2. RAPD Nhõn bản cỏc phõn đoạn DNA genome bằng PCR với cỏc đoạn mồi ngẫu nhiờn dài 10 nucleotide. Khụng cần thụng tin về đoạn gen cần nhõn bản Khụng xỏc định được thể dị hợp tử 3. AFLP Cắt DNA genome bằng EcoR1 và Mse1 Nối cỏc đoạn cắt với adapter PCR bằng mối tương thớch với adapter Biến dị sản phẩm PCR Kết quả: 300-500 bằng DNA 4. RFLP 1. Tỏch DNA genome 2. Cắt DNA genome với RE 3. Biến dị 4. Southern Bloting – Thấm truyền lờn màng Nitrosocellulose 5. Lai với mẫu dũ – probe từ MM đỏnh dấu bằng phúng xạ hoặc huỳnh quang 6. Hiển thị trờn film 7. Codominance: Đồng trội 5. SSR 1. Tỏch DNA genome 2. PCR với mồi SSR 3. Biến dị 4. Đỏnh giỏ bằng vạch 5. Xỏc định mối quan hệ Gene chips enable the expression of 8500 different genes to be tested in a single experiment. Each spot on the gene chip represents a different DNA sequence and the darkness of each spot represents its level of gene expression in the experiment. This enables identification of genes that all function together (e.g. all expressed in a particular stage of plant development or in response to some change of environmental conditions). DNA Microarrays - the "Gene Chip" Analysis of Gene Expression Throughout the Genome Image compliments of Dean Lavelle & Richard Michelmore, UC Davis. Genomics Methods Are Accelerating Crop Improvement Image compliments of UCD Biotechnology Program. • identification of genes that control valuable traits • manipulation of genes to produce crops with improved traits Genome Gene map Gene sequence Gene expression Traits Yield Drought Disease Stress Oil quality Maturity Stress Disease Yield Herbicide tolerance t a g c t a g c g c t c g c t g t c g t g g t ct g a t g a t g t t g t g t a a a a c g g c t g Image from Access Excellence Graphics Gallery genetic map DNA sequencegene clones Use of genomics data for "Marker-Assisted Breeding" Genomics data provides "markers" throughout the genome "Molecular markers" are unique DNA sequences that are: a) located at known positions throughout the genome b) easily assayed in a small tissue sample c) (occasionally) located very close to a "gene of interest" Nematode-resistance gene Mi linked to the Aps marker genetic map physical map Linkage of the Mi gene to the Aps marker gene provided a quick easy assay. Almost every progeny plant that contained the Aps marker also contained the Mi gene. Chỉ thị phân tử và đa hình DNA Protein do gen XYZ mó hoỏ hoạt động bỡnh thường tạo nờn tớnh khỏng bệnh Protein do gen XYZ mó hoỏ bị đột biến làm mất tớnh khỏng bệnh đa hỡnh về trỡnh tự nucleotid lặp lại ATT lặp lại - Cõy A: 4 lần - Cõy B: 6 lần - cõy C: 3 lần Phõn tớch sự đa hỡnh về trỡnh tự nucleotid lặp lại (SSR) Lấy mẫu lạ và tỏch chiết DNA PCR đoạn lặp lại Biến dị sản phẩm PCR Phõn tớch ASH bằng DNA chip Tỏch chiết DNA Dot blot lờn màng Lai Southern với DNA mẫu dũ Đọc kết quả bằng mỏy Scaner Xử lý số liệu NTSys Vers. 2.1. MapMaker JointMap Centimorgan (cM): Là đơn vị đo được để mụ tả khoảng cỏch liờn kết di truyền giữa cỏc gen. 1 cM là khoảng cỏch giữa hai gen cú tần suất tỏi tổ hợp bằng đỳng 1%. Được đặt theo tờn của Thomas Hunt Morgan người đầu tiờn đề xuất thuyết liờn kết di truyền Đơn vi khoảng cỏch cho biết hai gen cỏch nhau bao nhiờu. Thường 1 centimorgan bằng khoảng 1 triệu cặp base. 3Kb 1Kb 0,5Kb 2Kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 M Kết quả biến di sản phẩm RAPD của quần thể vải nghiờn cứu với mồi OPG-05 Cỏc phõn đoạn ADN được nhõn bản ngẫu nhiờn khi tiến hành phản ứng RAPD với mồi OPG-05 Thø tù c¸c dßng v¶i nghiªn cøu * CD¦T (Kb) P§ ADN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 TB ADN 2,0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1,5 2 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 44 1,42 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1,4 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 44 1,25 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 37 1,2 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 45 1,05 7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 45 0,95 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,9 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 45 0,85 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0,78 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 44 0,66 12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 43 0,63 13 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 45 0,6 14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 44 0,55 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,45 16 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 44 0,35 17 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 45 0,25 18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 TP§ ADN 12 12 12 12 12 12 12 12 11 12 12 11 12 12 11 12 12 12 11 11 12 12 12 13 16 13 12 12 12 12 12 11 12 12 9 11 12 12 11 12 12 12 12 12 12 535 Genomics Ngành khoa học nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của bộ gen Có các đoạn đọc trình tự toàn bộ DNA genom của: (1) Nấm men (2) Cây cải dại Arabidopsis; (3) Cây lúa; (4) Người (5) cây ngô, ... Omics • DNA >Gemone > Genomics • mRNA>Transcriptome>Transcriptomics (RT – PCR) • Proteins>Proteome>Proteomics (Nano-LC- MS/MS TOF) • Metabolits>Metabolome>Metabolomics Nghiờn cứu genom Cỏc phương phỏp nghiờn cứu genom - Sequencing - PCR - RAPD/AFLP/RFLP - Lai phõn tử Cỏc lĩnh vực chuyờn ngành Hệ gen học (Genomics) Các đoạn đọc trình tự DNA genom Hệ protein học (Proteomics) Các đoạn xác định trình tự và chức năng Của các protein Tin sinh học (Bioinformatics) Ngõn hàng dữ liệu (Database) NCBI (NIH) EMBL DDBJ Swiss Protein Datebase Phương phỏp NC Genomics Cỏc kĩ thuật mới Hệ gen học (Genomics) Khai thỏc sử dụng Sinh tin học (Bioinformatics) PTN. NC genomics Tỏch chiết DNA genom Diện di xung Xỏc định trỡnh tự nucleotid Thiết kế thư viện YAC, BAC, EMBL, Plasmid Sinh phẩm Sinh phẩm cỏc giai đoạn phỏt triển Về cấu trỳc gen, Gen điều khiển Sinh học phõn tử Lưu giữ, xử lý dữ liệu Phần mềm SHPT Phõn tớch trỡnh tự nucleotid trong DNA Thiết bị mới/Thư viện chỉ thị phõn tử/DNA chip Xỏc định trỡnh tự nucleotid bằng mỏy tự động đỏnh dấu bằng Flourescence Đọc và ghi tự động  600-800 bp/primer Trỡnh tự nucleotit của gen nh2nh5 được nhõn bằng cặp mồi NH2-NH5 GAGAAGCTGAAGGAGAAGGAGAAGCAGAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGATAAACAA AAA 60 GATAAAGATAATGATGGAGCTAGTGACGGAAATGATGTGTCAACTAGCACAAAAACTGGA GAGAGAGATAGAGATGTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTTTCACTGTTCCAAGGATAAAG 120 TCTTTTACTGATAAGATGATTTTACCAAGAATTAAGGGAAAGTCTGTCCTTAATTTAAAT CATCTTCTTCAGTATAATCCGAAACAAATTGACATCTCAAACACTCGTGCCACTCAATCT 300 CAATTTGAAAAGTGGTATGAGGGAGTGAGGAATGATTATGGTCTTAGTGATAACGAAATG CAAGTGATGTTAAATGGTTTGATGGTTTGGTGTATCGAAAATGGTACATCTCCAGACATA 420 TCTGGTGTTTGGGTAATGATGGATGGGGAAACCCAGGTTGATTATCCTATCAAACCTTTA ATTGAACATGCAACTCCTTCATTTAGGCAAATCATGGCTCACTTCAGTAACGCGGCAGAG 540 GCATATATCGCGAAGAGAAATGCAACTGAGAGGTACATGCCGCGGTATGGAATTAAAAGG AATTTGACTGACATTAGCCTCGCTCGATATGCTTTTGATTTCTATGAGGTGAACTCGAAA 660 ACACCTGATAGGGCTCGTGAAGCTCATATGCAGATGAAGGCTGCAGCGCTACGTAATACT AGTCGCAGAATGTTCGGAATGGACCGCAGTGTCAGTAACAGGGAAGAAAACACCGAAAGA 780 A 781 Trỡnh tự axit amin của protein dịch mó từ gen nh2nh5 EKLKEKEKQKEKEKEKDKQKDKDNDGASDGNDVSTSTKTGERDRDVNAGTSGTFTVPRIK 60 SFTDKMILPRIKGKSVLNLNHLLQYNPKQIDISNTRATQSQFEKWYEGVRNDYGLSDNEM 120 Gen protein và của virus đốm vũng đu đủ (PRSV) Lập bản đa genom Genom là toàn bộ thụng tin di truyền cú trong tế bào Genom vi khuẩn 1-2 *106 bp Genom người 3,3*109 bp (cụng bố thỏng 2/2001) Genom người 2 tổ chức cựng giải mó: Nhõn tạo ( Tự nhiờn ( 100 loại gen gõy bệnh được xỏc định (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi- bin/SCIENCE96/genelist Điều mới mẻ: cho cả 30.000 gen (khụng phải 100.000) và 200 giống của vi khuẩn Giải mó genom – Tiến hành như thế nào? 1. Lập bản để chỉ thị phõn tử đều trờn tất cả NST 2. Xõy dựng ngõn hàng BAC toàn bộ AND genom 3. Xỏc định vị trớ cỏc dũng BAC trờn NST thụng qua lai Southern 4. Nhận dạng và đọc trỡnh tự (nhắc lại 5 lần, 1-3 lỗi/1000 nucleotide 5. Bảo quản số liệu trong ngõn hàng dữ liệu. Server: 1500 GB • Genom người (HGP 2.2003) • Genom lúa (RGP, 4.2003) • Genom Arabidopsis • Genom Drosophila • Genom Saccharomyces Giải mó bộ gen lỳa Cựng bộ hoàn thành: 4/2002 Qui mụ: 400 Mbp Gồm: 30000-50000 gen ứng dụng 1. đỏnh giỏ chức năng gen 2. Cải tiến chất lượng hạt 3. Phũng trừ sõu bệnh So sánh với genom cuả ngô và mạch So sánh genom của 6 loài cây trồng thuộc họ hoà thảo Mỳ mạch Ngô Cao lương Mía Kê Lúa Proteomics Ngành khoa học nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các protein thuộc một genom. Có các đề án xác định toàn bộ các protein của: (1) Vi khuẩn Bacillus (4000 protein) (2) của cây Arabidopsis; (3) của người, v/d Clinical proteomics Sinh vật NC 3’ Xử lý ở ĐK đặc trưng hay bệnh lý Sinh vật NC 2D-Protein toàn phần Khối phổ Trypsin DATA BASE về GEN Trình tự nucleotit của gen GAGAAGCTGAAGGAGAA GGAGAAGCAGAAAGAAA AAGAAAAAGAAAAAGAT AAACAAAAA 60 GATAAAGATAATGATGGA GCTAGTGACGGAAATGAT GTGTCAACTAGCACAAAA ACTGGA GAGAGAGATAGAGATGTC AACGCCGGAACTAGTGGA ACTTTCACTGTTCCAAGG ATAAAG 120 Trái: Protein của cây mạ khi bị lạnh hiển thị bằng thuốc nhuộm bạc. Phải: Protein của Bacillus khi bị shock nhiệt hiển thị bằng đánh dấu huỳnh quang. Xác định phổ protein bằng kỹ thuật 2D- PAGE 20.000 đoạn nucleotid ngắn đại đIện cho các gen khác nhau được gắn lên tấm màng nitrosocellulose Lai với quần thể mRNA đánh dấu huỳnh quang để phát hiện những gen mới hoạt hoá Mục đích: Tìm gen Kỹ thuật di truyền Kỹ thuật di truyền là việc chuyển gen từ cơ thể này sang cơ thể khác Nông nghiệp Ngư nghiệp Y dược ứng dụng trong nông nghiệp •Kháng thuốc diệt cỏ Gen vi khuẩn vẫn tạo enzym khử độc amoniac khi gặp thuốc diệt cỏ nhóm basta •Kháng sâu hại Gen vi khuẩn tạo protein độc diệt sâu hại cây •Tăng năng suất Nhờ gen cao sản (sữa, thịt nạc ...) Vần đề An toàn sinh học GMO – Cây trồng chuyển gen Lan truyền gen lạ vào tự nhiên • Gen kháng kháng sinh • Gen diệt côn trùng • Gen kháng thuốc diệt cỏ - GMF - Thực phẩm chuyển gen Dị ứng với protein lạ ứng dụng trong y tế • Sản xuất thuốc Insuline, hoormon sinh trưởng, hFGF, RIP... • Chế tạo vaccine Gen protein vỏ của virus gây bệnh được biếnnạp vào vikhuẩn hoặc nấm men để sản xuất kháng nguyên • Liệu pháp gen Gen lành được đưa vào tế bào của bệnh nhân để cấy trả lại Nhân bản động vật Cừu Dolly 1996 (Jan Willmut) -Lấy nhân 2n của tế bào sinh dưỡng -Đưa vào tế bào trứng bỏ nhân -NuôI thành phôI -Cấy phôI vào cừu mẹ mang thai hộ Nhân chứa ADN Phôi Chuẩn bị  Dung hợp Phân bào Nuôi phôi  Cấy phôi Sinh con nhân bản Nhân bản gì nữa? Liệu pháp gen – Gene Therapy Nguyên lý: Đưa một gen hay alen lành lặn vào tế bào/mô của người bệnh Khó khăn: Làm thế nào để đưa gen cần thiết đến tế bào cần nhận? Nuôi tế bào của bệnh nhân và tái nhập gen lành. (Hệ miễn dịch, gây tăng cholesteron) Dùng virus làm vector vận chuyển gen - Đang nghiên cứu Bệnh nhân Jesse Gelsinger là 1 trong 18 bệnh nhân được trị liệu gen bện thiểu năng gan, mất 9/1999 do cơ thể phẩn ứng với virus biến đổi gen gây nên hiện tượng mất chức năng nhiều cơ quan dẫn đến tử vong Nhận dạng cá thể Thông qua phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Chỉ cần một lượng nhỏ DNA ban đầu có thể nhân được số lượng bản copy rất lớn (1 triệu bản trong 2 giờ) ứngdụng PCR trong KH hỡnh sự Khoa học hỡnh sự Lấy dấu ADN Sự sai khỏc rất nhỏ trong genom đủ để phõn biệt cỏ thể Cần lượng ADN nhỏ Tỡm phả hệ Vớ dụ trường hợp Thomas Jefferson Con cháu nam giới của ông nội Jefferson đều có cùng một NST Y như nhau. Có phải nhà kỹ thuật di truyền đang làm thay việc của thượng đế Giới hạn ở đõu? •Chữa bệnh •Sinh con theo ý muốn •Nhõn bản người •Sử dụng cỏc loài khỏc Vấn đề nhõn văn và xó hội học Minh họa Giám định gen hài cốt liệt sỹ Lễ bàn giao kết quả giám định gen hài cốt liệt sỹ Viện Công nghệ Sinh học cơ thể cấu tạo bởi mười nghìn tỷ (1013) tế bào Giỏm định gen hài cốt Tế bào cú 1 nhõn chứa hầu như toàn bộ AND của tế bào Tế bào cú nhiều (1000) ty thể cựng chứa ADN dạng vũng Phõn tớch Giỏm định gen gỡ? VỠ SAO CHỌN GEN TI THỂ? Đoạn gen HV1 vựng D-loop ADN ty thể: • Cỏch 40-60 thế hệ mới cú một đột biến trong dũng họ. • Chỉ di truyền đằng mẹ • cỏ thể bền vững đến1000 năm trong di hài D-loop Hoàn thiện phương pháp giám định gen 41 32 1= Máu; 2 = Tóc; 3 = Răng (sữa); 4 = Răng cũ Bước 1: Tách chiết ADN từ mẫu sinh phẩm Hình A: Sản phẩm PCR từ mẫu ADN răng hài cốt Hình B, C: Sản phẩm PCR từ các mẫu máu Bước 2: Nhân bản các đoạn gen ty thể A B C Nhân dòng phân tử và chẩn đoán cắt hạn chế khẳng định dòng gen tái tổ hợp Bước 3: Tách dòng gen Giải trình tự gen trên máy ABI Prism 3100 Avant (Tốc độ 2,5 giờ/4 mẫu~4000 nucleotid) Bước 4: Đọc trình tự nucleotid của gen nhân dòng Trình tự Tại Phòng Dự án Sinh tin học Bước 5: Phân tích số liệu và Lập ngân hàng dữ liệu So s¸nh lËp c©y ph¶ hÖ Hình thành cây phả hệ tổng thể và cây phả hệ riêng rẽ LS phả hệ PB02 LS. phả hệ PA02 Thu thËp mÉu Tách chiết ADN Tách dòng gen Nhân bản gen Đọc trình tự Không xác định 3-5 ngày 2-3 ngày 3-5 ngày 2-4 ngày Tổng số: 2-3 tuần THỜI GIAN THỰC HIỆN ví dụ 2: Hồ sơ số PA02001 Bia mộ ghi: Liệt sỹ Trần Xuân Tỷ Hy sinh 28-2-1969 Vợ Ngô Thị Hoà, Quê quán: Thạch Đài, Thạch Hà, Hà Tĩnh NơI hy sinh: bên cạnh suối Chà Miệt Nghĩa trang liệt sỹ tại huyện Ngọc Hồi Kontum Mộ liệt sỹ Trần Xuân Tỷ Bia mộ ghi: Liệt sỹ Trần Xuân Tỷ Hy sinh 28-2-1969 Vợ Ngô Thị Hoà, Quê quán: Thạch Đài, Thạch Hà, Hà Tĩnh NơI hy sinh: bên cạnh suối Chà Miệt Giấy Báo tử Đoàn 559 Số 173/BT Ngày 25/9/1966 Đồng chí Nguyễn Hưũ Vu Nguyên quán: Bắc Bình, Thạch Đài, Thạch Hà, Hà Tĩnh Con ông: Nguyễn Hữu Huyền Vợ là: Ngô Thị Hoà Đã chết ngày 20/7/1966 Tại: Mặt trận phía tây Địa chỉ thân nhân hiện nay: Cha Nguyễn Hữu Huyền ở nguyên quán Giấy Báo tử Đoàn 559 Số 173/BT Đồng chí Trần Tỷ, Cấp bậc: Chuẩn Uý, CV. Đại đội phó Đv: TĐ2 BT37 Đoàn 559 Nguyên quán: Xuân Hoa, Nghi Xuân, Hà Tĩnh Con ông: Trần Đạt Và bà Nguyễn Thị Diên Vợ là: Dương Thi Tam Đã hy sinh anh dũng ngày 28-2-1968 Tại: Mặt trận phía tây Thi hìa mai táng tại Nghĩa Trang đơn vị Ngày 30/6/1969 Thông tin về Liệt sỹ Liệt sỹ Trần Tỷ Theo Sổ sách của Đoàn 559 Số thứ tự 685 ghi: • Trần Tỷ (bia mộ ghi Trần Xuân Tỷ), năm sinh 1941(?) • Vợ Dương Thị Tam, • QQ. Xuân Hoa, Nghi Xuân, Hà Tĩnh. • NN: 2.1962 • CB: U1 (Thiếu uý, C Phó), • Đơn vị: C3D2 Binh trạm 37 (mở rông từ BT7, Sân bay Chà Vằn thuộc tỉnh Saravan thuộc Sư đoàn 470); • Hy sinh: 28.2.1969 (Trạm giao liên 74D16 đánh biệt kích ). Liệt sỹ Nguyễn Hữu Vu Theo Sổ sách của Đoàn 559 Số thứ tự 117 ghi: • Nguyễn Hữu Vu • NN: 4.1963 • CB: chiến sỹ (y tá) • Đơn vị: B1, C61 BT7 • Hy sinh: 20.7.1966 (Sốt rét ác tính, Trạm xá BT7 Bản Nhai, Vu-pu-vong-nưa, tỉnh A-to- pư Bố: Nguyễn Hữu Huyền • Vợ: Ngô Thị Hoà, Thạch ĐàI, Thạch Hà, Hà Tĩnh Thông tin về Liệt sỹ Saravan Attopư Những điểm đáng chú ý Những điểm đúng • Có Liệt sỹ Trần Tỷ (bia ghi Trần Xuân Tỷ) hy sinh ngày 28.2.1969 và gia đình đang sống ở Xuân Hoa, Nghi Xuân, Nghệ An • Thông tin về bà Ngô Thị Hoà trên bia mộ hoàn toàn đúng