Chương 2 Phương tiện & thủ thuật dùng trong vi sinh học

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 18/09/2013 ‹#› GVHD: Trần Kim Hoàng VI SINH VẬT ĐẠI CƯƠNG NHÓM 4 Trường Đại Học An Giang NGÔ THỊ PHƯƠNG LÝ LÊ THỊ CẨM GIANG LÊ TỊ MỸ DUYÊN TRẦN THỊ THANH HOA CTP123806 CTP123744 CTP123765 CTP123817 THÀNH VIÊN CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN & THỦ THUẬT DÙNG TRONG VI SINH HỌC MỘT SỐ THIẾT BỊ CƠ BẢN MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN PHƯƠNG TIỆN Một số thiết bị cơ bản 1/KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC Cấu tạo của kính hiển vi thường Kính hiển vi thường: Gồm nhiều thấu kính quang học để phóng đại vật quan sát lên nhiều lần. Kính này có 2 hệ thống thấu kính: vật kính và thị kính. Ngoài ra, còn có hệ thống chiếu sáng. Kính hiển vi quan sát vật nhờ các tia sáng chiếu xuyên qua vật, nhờ đó ta có thể quan sát được cơ cấu bên trong của vật nếu chúng ta cắt mỏng vật ra Khuyết điểm: không quan sát được hình dạng nổi bên ngoài của vật Kính này gồm nhiều thấu kính quang học để phóng đại vật quan sát lên nhiều lần. Kính có 2 hệ thống thấu kính: vật kính và thị kính. Vật kính gồm nhiều thấu kính, phóng đại vật quan sát lên nhiều lần hơn nữa. Do đó nó có khả năng phóng đại vật lên từ vài trăm đến khoảng 1.500 lần lớn hơn. công dụng: có thể quan sát cấu tạo bên trong của vật nếu chúng ta cắt mỏng vật ra 1/KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC KÍNH HIỂN VI SOI NỔI (LOUPE BINOCULAIRE) Một số thiết bị cơ bản Kính hiển vi soi nổi hay kính phóng đại 2 ống ngắm: Có độ phóng đại thường nhỏ, chỉ không quá 200 lần. Kính này gồm hai ống ngắm ghép song song nhau và quan sát với hai mặt cùng một lúc. Chức năng: kính này dùng để quan sát bên ngoài của vật với hình ảnh nổi của vật ấy, khác với khv thường, kính này dùng tia sáng phản chiếu của vật để quan sát 1/KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC KÍNH HIỂN VI ĐÁY ĐEN Một số thiết bị cơ bản Có tên tiếng Anh là darkfield microscope, kính hiển vi này gồm một kính hiển vi thường có gắn bộ hội tụ tia sáng (condenser) đặc biệt. Bộ hội tụ này hoặc được cấu tạo đặc biệt hoặc được che ở phần giữa, do đó ngăn các tia sáng chiếu thẳng vào vật mà chỉ cho các tia sáng chiếu xiên vào vật mà thôi. Khi quan sát, chúng ta sẽ thấy thị trường có màu đen, vì chỉ quan sát được với tia sáng xiên. Nếu có vật, tia sáng xiên chiếu vào vật sẽ cho tia bức xạ, chúng ta quan sát được ảnh bên ngoài của vật nhờ các tia bức xạ này. Công dụng: của kính hiển vi này là có thể quan sát vật không cần nhuộm màu, do đó quan sát được vật đang còn sống. KÍNH HIỂN VI ĐÁY ĐEN 1/KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC KÍNH HIỂN VI TƯƠNG PHẢN Một số thiết bị cơ bản Có tên tiếng Anh là contrast phase microscope, kính có cùng mục đích với kính hiển vi đáy đen, kính hiển vi tương phản dùng đê quan sát các vật quá nhỏ trong tình trạng đang sống của vật ấy (không nhuộm màu). Kính hiển vi tương phản cho hình ảnh của vật rõ hơn kính hiển vi đáy đen, thấy được các chi tiết bên trong. Kính hiển vi này cũng chỉ là kính hiển vi thường, nhưng có gắn thêm hai bộ phận đặc biệt: vòng mở tia sáng (annular diaphragm) ở bộ phận điều chỉnh lưu lượng ánh sáng và đĩa tạo tương phản hay tạo lệch pha (phase shifting element) đặt trong vật kính. Nhờ 2 bộ phận này, ánh sáng đi ngang qua vật quan sát được phân tích thành hai chùm tia, một chùm tia sáng cứng đi ngang qua vật và chùm tia sáng bị khúc xạ đi qua chung quanh vật. Vì vật chất trong vi sinh vật có chiết suất gần bằng nhau do đó rất khó nhận thấy nếu không nhuộm màu (như khi ta quan sát một miếng thủy tinh đặt trong chậu nước). Nhờ dùng 2 chùm tia có độ dài sóng khác nhau chiếu xuyên qua nên ta có thể thấy được các vật khác nhau có chiết suất gần giống nhau. KÍNH HIỂN VI TƯƠNG PHẢN 2/KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ XUYÊN THẲNG Một số thiết bị cơ bản Với kính hiển vi điện tử xuyên thấu (transmission electron microscope - TEM), tất cả các bộ phận được đặt trong một trụ kín và tạo chân không bằng một bơm hút. Trong chân không hoạt động của điện tử không bị cản trở. Các điện tử bắn xuyên qua mẫu vật được các vật kính và thị kính bằng điện từ làm tản rộng ra (phân kỳ), sau cùng hiện lên màng huỳnh quang có bộ máy chụp ảnh để chụp ảnh khi cần. Tia điện tử khi xuyên qua mẫu vật sẽ bị ngăn cản hoặc không tùy theo tính chất của mẫu vật sẽ hiện hình trên màng huỳnh quang thành ảnh đen trắng. Các nơi của mẫu vật ngăn cản tia điện tử sẽ có màu đeN KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ XUYÊN THẲNG 2/KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ NỔI (SCANNING ELECTRON MICROSCOPE) Một số thiết bị cơ bản Kính hiển vi điện tử được chế tạo bởi Ernst Ruska năm 1933. Kính hiển vi quang học ngày càng được cải tiến. Từ với một thấu kính đơn giản với độ phóng đại chỉ vài mươi lần, ngày nay chúng ta có kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1.500 lần. Tuy vậy kính hiển vi quang học không thể vượt lên khỏi giới hạn trên được, do đó không thể giúp chúng ta quan sát được virus. Lý do của giới hạn này là vì ánh sáng thường mà chúng ta dùng để quan sát trong kính hiển vi quang học có độ dài sóng tương đối lớn, từ 400-700 nm. Với độ dài sóng lớn như vậy chúng ta không thể quan sát các vật nhỏ. Do đó trong hướng phát minh ra những dụng cụ giúp chúng ta quan sát được những vật cực nhỏ, năm 1931, Knoll và Ruska ở Đức đã lần đầu tiên chế tạo ra kính hiển vi điện tử. Kính hiển vi này áp dụng nguyên tắc là nếu một nguồn bắn điện tử đặt ở một hiệu thế cao (khoảng 30-150 KV) sẽ bắn các điện tử có độ dài sóng rất ngắn (0,5 nm). Các độ dài sóng này có thể bị từ trường làm lệch đường đi (giống như thấu kính làm lệch đường đi của tia sáng). Áp dụng nguyên tắc trên kính hiển vi điện tử được cấu tạo như dưới đây. 3/MÁY LY TÂM MÁY LY TÂM THÔNG THƯỜNG Một số thiết bị cơ bản Máy ly tâm là dụng cụ dùng để lắng các vật thể to trong một dung dịch hoặc để phân tách các vật thể có trọng lượng khác nhau trong một dung dịch. Máy ly tâm có thể là: Bộ ly tâm quay tay Quay bằng tay, cấu tạo đơn giản. Vận tốc quay thường kém, khoảng 700-1.500 vòng/phút. Thường dùng để lắng tuyến trùng, bào tử nấm, vi khuẩn. Máy ly tâm thông thường Quay bằng động cơ điện, vận tốc thực dụng tối đa khoảng 16.000 vòng/phút, thông thường là 3.000 vòng/phút. Rất thông dụng trong các phòng nghiên cứu vi sinh học. Máy siêu ly tâm Một máy siêu ly tâm hiệu Beckman Coulter. Máy siêu ly tâm (ultracentrifuge) có vận tốc quay rất nhanh, có thể đạt đến 100.000 vòng/phút. Tuy nhiên ở vận tốc trên 25.000 vòng/phút, máy cần có bộ phận tạo chân không cho nồi quay (rotor) không bị ma sát vì không khí để tránh tăng nhiệt độ gây nguy hiểm. Ngoài ra, máy còn được trang bị thêm bộ phận làm lạnh ở nhiệt độ cố định. Máy siêu ly tâm rất cần thiết cho các nghiên cứu virus. Khi sử dụng máy ly tâm, nhất là máy siêu ly tâm, cần quan tâm đến việc làm cân bằng trọng lượng các ống ly tâm. Một sự chênh lệch nhỏ về trọng lượng giữa hai ống ly tâm đối xứng nhau có thể gây nguy hiểm chết người nếu quay với vận tốc quay lớn. 3/MÁY LY TÂM TỐC ĐỘ QUAY CỦA MÁY LI TÂM Một số thiết bị cơ bản 4/TỦ CẤY TỦ CẤY VÔ TRÙNG Một số thiết bị cơ bản 5/NỒI HẤP VÔ TRÙNG Ở ÁP SUẤT CAO NỒI HẤP ÁP SUẤT Một số thiết bị cơ bản 6/TỦ ẤM TỦ ẤM Một số thiết bị cơ bản MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN ĐĨA PETRI MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN ỐNG NGHIỆM MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN BÌNH TAM GIÁC MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN ỐNG ĐONG MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN QUE CHÀ MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN QUE CẤY THỦ THUẬT KHỬ TRÙNG LY TÂM NHUỘM MÀU Khử trùng Nguyên tắc Có 3 nguyên tắc khử trùng chung Thanh trùng: là tiêu diệt tất cả vsv trên và trong dụng cụ cần thanh trùng thường dùng nhiệt hay hơi formol,etilen oxit…,HgCl2 tia cực tím hay gamma. Tẩy độc: chỉ diệt hoặc tách các vsv có thể gây nhiễm trùng, k cần diệt tất cả các vsv Kiềm hãm:k có mục đích giết vsv ngay mà chỉ giữ chúng trong tình trạng bất động phương pháp Các phương pháp thường dùng là: Pp dùng nhiệt: + Dùng nhiệt khô: để thanh trùng các dụng cụ không cháy như kim loại, thủy tinh,… ở 150oC- 180oC tối thiểu 1 giờ hoặc 120oC tối thiểu 4 giờ. + Dùng nhiệt ướt: để thanh trùng hoặc tẩy độc môi trường nuôi cấy, thực phẩm hoặc dụng cụ, hóa chất,… + Thường dùng hơi nước sôi (1000C) để tẩy độc để loại virus và 1 số VK thường gặp. Thời gian tối thiểu 1h + Để thanh trùng vi khuẩn và nấm, phải dùng hơi nước bảo hòa ở 1210C với thời gian tối thiểu 20 phút (nồi autoclave). 2. Pp dùng hóa chất: 2/ pp dùng hóa chất: + các halogens: - CaCl2 : 0,5 -5% dùng khử độc nước sinh hoạt - I2 : là 1 chất thanh trùng tốt nhưng ít dùng hơn vì đắt và có màu. Ngày xưa, ngành y tế thường dùng cồn iod 2% thanh trùng vết thương. + các kim loại nặng: - HgCl2 : 1%0 hoặc 1/5000. để khử độc ngoài mặt mẫu vật khi nuôi cấy. - Ag2SO4 : thuốc nhỏ mắt dành cho trẻ sơ sinh (1%). - CuSO4: diệt rong xanh trong hồ nước và diệt nấm trong NN. + các kim loại nặng: -HgCl2 : 1%0 hoặc 1/5000. để khử độc ngoài mặt mẫu vật khi nuôi cấy. - Ag2SO4 : thuốc nhỏ mắt dành cho trẻ sơ sinh (1%). - CuSO4: diệt rong xanh trong hồ nước và diệt nấm trong NN. + các chất khác: Phenol, Cồn, Xà bông, Chất tẩy,… 3/ dùng tia sáng: + tia cực tím: có tính thanh trùng mạnh, diệt được cả bào tử VK. Các tia 230 – 280nm, đặc biệt 253,7nm có tác dụng thanh trùng mạnh nhất. Dùng thanh trùng phòng ốc, dụng cụ (Cần bảo vệ mắt). + tia âm cực: tia điện tử có khả năng thanh trùng và xuyên qua kim loại mỏng. Dùng thanh trùng dụng cụ y khoa, thịt, rau cải và thực phẩm khác đã đóng gói. 4/ pp lọc: +- Ruột bằng sứ xốp của bình lọc nước, các loại giấy lọc đặc biệt nhờ có các lỗ hỏng nhỏ cho các chất lỏng đi qua nhưng ngăn cản VK, nấm lại nên dùng để thanh trùng hoặc tẩy độc. - Màng lọc cực mịn: được làm bằng collodion cellulose acetate hoặc những chất tương tự có lỗ rất nhỏ từ 0,005 - 1µm nên có thể dùng màng lọc thích nghi để loại tất cả VSV, kể cả virus nhỏ nhất ra khỏi dung dịch muốn thanh trùng. Ly tâm Nguyên tắc của pp ly tâm là khi 1 vật bị tác dụng bởi ly tâm sẽ bị lôi kéo bởi 1 lực và do chuyển theo chiều hướng ly tâm. M của vật bị tác dụng càng lớn, lực ly tâm càng lớn. Nguyên tắc này đc áp dụng trong việc: Tẩy độc dịch chứa vk, lắng VK xuống đáy ống. Ở 6000v/p trong 20p, có thể lắng tất cả VK trong nước xuống đáy ống. Các VSV nhỏ hơn, như virus thì còn lơ lửng trong nước -> tách VK ra khỏi dịch chứa virus. Thu thập hay cô đọng: trong 1 huyền phù với mật số cao hơn -> ly tâm với tốc độ và thời gian thích hợp để VSV ấy lắng xuống đáy ống. Tinh ròng vsv: trong một dịch chứa nhiều loại VSV, ta có thể ly tâm để phân tách các VSV và các vật thể có kích cở khác nhau chứa trong dịch này ra từng lớp riêng biệt. 1/ Môi trường nuôi cấy tự nhiên 2/ Môi trường nuôi cấy bán tổng hợp 3/ Môi trường nuôi cấy tổng hợp 4/ Môi trường nuôi cấy sống Môi trường nuôi cấy vsv 1/ môi trường nuôi cấy tự nhiên: - Được sử dụng phổ biến là sữa, nước trích thịt bò, nước trích các loại rau củ quả, ngũ cốc,... Các loại môi trường này chứa nhiều chất dinh dưỡng hữu cơ và vô cơ tan trong nước đáp ứng yêu cầu về dưỡng chất của 1 số lớn VSV. - Dễ chuẩn bị, rẽ tiền và có thể sử dụng cho nhiều mục đích thông thường trong nghiên cứu VSV. 2/ Môi trường nuôi cấy bán tổng hợp: Là môi trường nuôi cấy tự nhiên được bổ sung thêm 1 số chất dinh dưỡng được xác định. VD: Nước trích thịt bò hay nước trích các loại rau củ quả được bổ sung thêm Glucose, NaCl, … 3/ Môi trường nuôi cấy tổng hợp: Các thành phần dinh dưỡng của môi trường được kiểm soát chặt chẽ về số lượng và chất lượng. Tùy theo loại thành phần dinh dưỡng sử dụng ta có + Môi trường nuôi cấy hữu cơ tổng hợp: phần lớn thành phần dinh dưỡng là các chất hữu cơ tan trong nước. + Môi trường nuôi cấy vô cơ tổng hợp: phần lớn thành phần dinh dưỡng là các chất vô cơ tan trong nước. - Có thể biết rõ cũng như điều khiển thành phần dinh dưỡng của môi trường 1 cách dễ dàng. Với biện pháp tăng thêm hoặc bỏ bớt chất dinh dưỡng ta có thể biết rõ tác động của chất dinh dưỡng đ/v VSV. Đây cũng là môi trường rất tốt cho các loại VSV đã biết rõ nhu cầu dinh dưỡng của chúng. 4/ Môi trường nuôi cấy sống: Dùng để nuôi cấy 1 số VSV đặc biệt có tính ký sinh bắt buộc VD: Virus gây bệnh đậu mùa, người ta nuôi cấy chúng trên bò còn sống và sau đó thu thập virus trên con bò ấy để làm thuốc chủng bệnh đậu mùa. Nhuộm màu Để vsv ăn màu ta có thể q/sát được hình ảnh rõ ràng hơn Phần lớn màu nhuộm trong vi sinh học là các muối và được chia thành 2 nhóm: + Màu acid: có ion mang màu là anion (-) + 1 base---1 muối màu + Màu base: có ion mang màu là cation (+) + 1 acid ---1 muối màu Màu acid phối hợp chặt (ăn màu) với thành phần của tế bào chất (có tính base) và màu base ăn màu với thành phần của nhân tế bào (có tính acid). - Một số các màu nhuộm chỉ bao phủ ngoài mặt mẫu vật được nhuộm do quá trình hấp thu hoặc là nó tan hay kết tủa chung quanh vật được nhuộm. 1/ Nhuộm Đơn: Phần lớn màu để nhuộm đơn là methylene blue, crystal violet, basic fuchsin (thuộc nhóm màu aniline),... Có rất nhiều công thức và thủ thuật để nhuộm đơn mẫu vật. đ/v Vi Khuẩn:thường dùng d2 Loeffler's methylene blue Dịch A A + B Loffler's methylene blue. Để dành lâu được, giúp q/sát được nhiều chi tiết về hình dạng và cấu trúc tb Methylene blue 0,3g Ethyl alcohol 95% 30,0ml Dịch B KOH (0,01%) 100ml Đ/v nấm: thường dùng d2 Lactophenol cotton blue. Cotton blue nhuộm xanh nguyên sinh chất của nấm. Lactophenol có chiết xuất là 1,45 nên giúp q/sát nấm rõ ràng hơn. Phenol (tinh thể tinh ròng) 20 g Lactic acid 20 g Glycerol 40 g Nước cất 20ml Cotton blue (methyl blue) 0,05 g 2/ Nhuộm gram: Gram stain video P2 này rất quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn + VK gram dương (+) ăn màu tím + VK gram âm (-) ăn màu hồng Dung dịch tím kết tinh (Crystal violet) Crystal violet 2g + 20 ml etanol 95% Amonium oxalate 0,8g +80ml nước cất           Dung dịch Iod     1 g Iod + 2g KI + 300ml nước cất   Dung dịch tẩy màu   Etanol 95% hoặc hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton. dd Safranin   0,5g+ 100ml nước cất   Các bước nhuộm gram (Steve K. Alexander và ctv) 3/ Nhuộm roi: Do đường kính roi của VK rất nhỏ khó q/sát được qua kính hiển vi quang học cần nhuộm hóa chất (màu) đặc biệt để làm cho roi to ra và cũng giữ màu nhuộm. Hóa chất để tô phủ roi có thể là tannic acid, màu nhuộm có thể dùng pararosaniline. Cảm ơn các bạn và cô đã lắng nghe!