Chương 5 Di truyền vi sinh vật

CHƯƠNG 5 DI TRUYỀN VI SINH VẬT Mục tiêu 1. Trình bày được các kiểu đột biến và cơ chế của các tác nhân gây đột biến 2. Phân biệt được 2 loại tái tổ hợp di truyền và 3 loại nhân tố di truyên IS, Tn và Bacteriophage Mu 3. Trình bày được phương pháp vận chuyển vật liệu di truyền ở vi khuẩn. 4. Trình bày các bước cơ bản và lợi ích của kỹ thuật di truyền trong công nghiệp. 1. Đại cương Các VSV hầu hết đều giống tổ tiên của mình ở hầu hết các đặc điểm. Di truyền là việc duy trì các đặc điểm của tổ tiên cho đời sau của thế giới hữu sinh . Đơn vị di truyền là gen. Gen là một đoạn ADN đảm nhiệm việc mã hoá một đơn vị tính trạng di truyền, các đặc điểm của gen được di truyền cho thế hệ sau qua sao chép. Phần lớn gen nằm trong nhân tế bào. Phần nhỏ thuộc plasmid, các yếu tố di truyền động. 1. §¹i c­¬ng * Theo quan niÖm hiÖn hµnh dßng th«ng tin di truyÒn tõ nhiÔm s¾c thÓ ®Õn tÕ bµo chÊt ë mäi vi sinh vËt diÔn ra nh­ sau: 1 2a 1 3a ADN ARN protein  2b 3b? * LiÖu qu¸ tr×nh 3b cã tån t¹i trong tù nhiªn hay kh«ng? : 2. Sao chép AND, phiên mã, dịch mã ( Sinh viên tự nghiên cứu ) 3. PHÁT SINH ĐỘT BIẾN VÀ CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN3.1. Đột biến ngẫu nhiên và đột biến gây tạo 3.1.1. Đột biến ngẫu nhiên + Nguyên nhân: * Tác động của môi trường * Chuyển hóa tautomer (hỗ biến của các base khi sao chép) + Ví dụ: T ở dạng keto khi sao chép chuyển sang dạng enol sẽ bắt cặp với G . Hậu quả là trong sợi ADN mới sau 1 thế hệ 1 cặp GC sẽ thay vào vị trí AT 3. PHÁT SINH ĐỘT BIẾN VÀ CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN3.1. Đột biến ngẫu nhiên và đột biến gây tạo 3.1.1. Đột biến gây tạo + Nguyên nhân: Sử lý TB VSV với các tác nhân gây đột biến vật lý, hóa học, sinh học + 2 dạng đột biến: - Đột biến tổng gen thay đổi số genom của VSV VD: từ đơn bội thành đa bội => có giá trị trong cải tạo giống - Đột biến gen thay đổi cấu trúc gen gồm + Đột biến điểm + Đột biến trượt khung 3. PHÁT SINH ĐỘT BIẾN VÀ CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN3.1. Đột biến ngẫu nhiên và đột biến gây tạo + Đột biến điểm một cặp base bị thay thế bằng một cặp base khác - Chuyển dịch (base purin được thay bằng purin) VD: AT thay bằng GC - Đảo dịch là khi base purin được thay thế bằng base pirimidin VD: AT thay bằng CG + Đột biến trượt khung ( 1 đoạn ADN bị loại đi, bị chuyển chỗ , bị cách ra do sự chèn vào của ADN lạ ) Đột biến điểm đổi cặp base Đột biến trượt khung 3.2. Cơ chế td của các tác nhân đột biến 3.2.1. Lắp chất tương tự base Chất tương tự base là chất kháng trao đổi (anti – metabolite), tế bào nhầm lẫn lắp vào ADN. Thường gây đột biến là BU (5 brom-uracil) và AP (2-amino-purin) A T Nhân đôi Nhân đôi G C Nhân đôi Quan sát sơ đồ và mô tả cơ chế phát sinh đột biến gen do tác động của 5BU (5Brôm – Uraxin). A 5BU G 5BU 3.2.1.LẮP CHẤT TƯƠNG TỰ BASE 3.2.2. Thay đổi hóa học của base + Acid nitrơ khử amin của A, G, nhưng không làm đứt sợi, do đó thay thế nhóm –NH2 bằng -OH: => A thành hypoxantin ghép đôi được C AT => GC => G thành xantin, vẫn sóng đôi với C nên không gây đột biến + Hydroxylamin pứ chủ yếu với C, khiến base này sóng đôi sai với A, CG => TA +Ethyl- và methyl-sulfonat, ethylenimin, N-nitroso-guanidin là các tác nhân alkyl hóa gây đột biến mạnh Đột biến gây tạo do hydroxylamino 3.2.3.Chèn thêm vào hoặc loại đi một cặp base. Phân tử acridin xen vào giữa các cặp base trên chuỗi ADN làm tăng khoảng cách giữa chúng => mất đi một số cặp hoặc thêm vào một số cặp base và như vậy làm chuyển dịch khung đọc mã trong tổng hợp protein gây đột biến. Tác dụng gây đột biến của Acridin 3.2.4. Ánh sáng tử ngoại UV và bức xạ ion hóa Ánh sáng tử ngoại UV, tia Rơnghen và các bức xạ ion khác nhau có tác dụng gây chết mạnh và gây đột biến. Ánh sáng UV tác dụng lên acid nucleic hậu quả là khi sao chép bị sai lệch. Ví dụ: ánh sáng tử ngoại gây đột biến đổi dịch, trượt khung thậm trí mất đoạn. Tia Rơnghen, alpha, beta, cũng là 1 tác nhân gây đột biến. Ánh sáng tử ngoại UV : * Năng lượng thấp không đủ để ion hóa, không xuyên xâu nên không tác động được vào các tế bào nằm sau trong cơ thể sinh vật. Có hiệu quả đột biến ở VSV, hạt phấn… * Cơ chế chủ yếu của đột biến UV là do acid nucleic và các hợp chất trong tế bào hấp thụ, sự hấp thụ càng mạnh thì khả năng đột biến càng cao. * Acid nucleic hấp thụ bước sóng 260 nm là cao nhất , nên bước sóng 260 nm có hiệu quả đột biến tốt nhất. Tác dụng của UV (ĐB gen or ĐB NST): + Các base thymin gần nhau trên phân tử ADN liên kết với nhau tạo dimerthymin,gây méo mó phân tử ADN có thể dẫn đến mất khả năng tái bản của ADN. + Tia UV thường ít gây chết tế bào mà tạo nên các đột biến. Tác động gây đột biến phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của tế bào, tuổi giống, loài sinh vật… Tia bức xạ ion hóa Tia có bản chất sóng điện từ với bước sóng cực ngắn gồm tia X, tia gamma. Tia có bản chất hạt gồm các tía alpha, beta, các proton,… Các tia bức xạ có năng lượng lớn làm cho các phân tử nước và các phân tử trong tế bào bị phá vỡ thành những phân tử tích điện ( bị ion hóa). Khi có mặt O2 bức xạ oxi hóa sinh ra các peroxid hydro và nhiều chất phản ứng mạnh gây tổn thương ADN. 4. TÁI TỔ HỢP DI TRUYỀN VÀ CHUYỂN TÍNH TRẠNG4.1. Tái tổ hợp di truyền + Tái tổ hợp của tế bào nhân thật: Hợp tử là sản phẩm kết hợp của 2 tế bào + Tái tổ hợp ở tế bào nhân nguyên thủy * Một phần của ADN của tế bào cho chuyển sang tế bào nhận do đó chỉ xuất hiện hợp tử 1 phần. Đoạn ADN của tế bào nhận và ADN của tế bào cho ,sóng đôi và trao đổi đoạn và khi phân bào tiếp theo sẽ xuất hiện 1 tế bào chỉ chứa NST đã tái tổ hợp. * Tái tổ hợp di truyền gồm có: - Tái tổ hợp phổ biến - Tái tổ hợp đặc hiệu 4.1.1.TÁI TỔ HỢP PHỔ BIẾN TH phổ biến là quá trình mà trong đó ADN lạ mới xâm nhập vào trong tế bào được liên kết với ADN chủ thông qua việc ghép đôi đoạn tương đồng ,bẻ vỡ và trao đổi chéo 2 đoạn ADN có trình tự giống nhau Có 6 enzym tham gia vào quá trình này: trong đó đáng chú ý là -SSB protein, RecA protein 4.1.1.TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU AND của E.coli tái tổ hợp 4.1.1.TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU Tái tổ hợp đặc hiệu vị trí chỉ cần một đoạn ADN tương đồng rất nhỏ để nhận biết – gọi là trình tự nhận biết, quá trình này cần các enzym đặc hiệu cho các phân tử ADN tái tổ hợp. Phân loại: + Tái tổ hợp đặc hiệu 1 vị trí: 1 phân tử ADN mang trình tự nhận biết + Tái tổ hợp đặc hiệu 2 vị trí nếu cả 2 phân tử ADN đều mang trình tự nhận biết. 4.1.3. Các nhân tố di truyền động4.1.3.1. Nhân tố chèn vào IS IS là nhân tố di truyền có thể lắp vào các vị trí khác nhau trên genom của vi khuẩn làm mất tính liên tục của gen. Đặc tính này tạo cho IS có khả năng di động rộng rãi. Nhân tố IS được xác định đầu tiên là ở E.coli gồm 800 -1400 cặp base và không mang một phenotyp nào khác ngoài chức năng chuyển chỗ. 4.1.3. Các nhân tố di truyền động4.1.3.1. Nhân tố chèn vào IS IS được phát hiện đầu tiên ở E.coli do tác động ức chế hoạt động của gen. Khi IS xen vào bên trong gen tương ứng VK mất khả năng lên men galactose, khi nhân tố này rời khỏi gen khả năng lên men galactose được tái lập. Các trình tự IS không mã hóa protein nên chỉ có thể phát hiện chúng thông qua tác động của chúng. 4.1.3. Các nhân tố di truyền động4.1.3.2. Transposon (Tn) Là nhân tố di truyền động gây đột biến và được gọi là ‘gen nhảy’. Tn đọc mã một số tính trạng dễ nhận thấy về kiểu hình như tính kháng kháng sinh (penicilin, tetracyclin, kanamycin…), tính kháng kim loại nặng như Ag. Sự chuyển chỗ của Tn là kết quả của sự sao chép do đó không làm mất đi Tn ở vị trí chèn vào ban đầu trong ADN. 4.1.3.3. Bacteriophage Mu *Có chung đặc tính của cả IS và Tn. Bacteriophage Mu coi như 1 Tn khổng lồ, khi hợp nhất vào tế bào chủ sẽ gây đột biến. * Đảo ngược gen là đặc tính đáng chú ý của bacteriophage Mu. * VD: Sù ®¶o ng­îc ®Çu ®o¹n G cña Bacteriophage Mu. §o¹n G m· ho¸ tæng hîp c¸c protein sîi ®u«i. NÕu ®o¹n n»y n»m theo h­íng G+, c¸c protein ®u«i S vµ U ®­îc t¹o thµnh vµ phage nhiÔm vµo E. coli K 12. NÕu ®o¹n ®¶o ng­îc theo h­íng G-, mét promotor kh¸c sÏ ho¹t ®éng vµ sîi ADN ®èi diÖn sÏ ®­îc sö dông, sîi nµy phiªn m· c¸c gen kh¸c mµ s¶n phÈm cña chóng lµ mét protein ®u«i S’ vµ U’ kh¸c lµm thay ®æi phæ vËt chñ cña phage. Nhê vËy phage cã thÓ hÊp thô vµo c¸c tÕ bµo E. coli C vµ c¸c vi khuÈn ®­êng ruét kh¸c. Sù ®¶o ng­îc còng liªn quan ®Õn Salmonella, vµ ë ®©y liªn quan ®Õn sù thay ®æi tæng hîp tiªn mao cña vi khuÈn. 4.2.BIẾN NẠP (transformation) Đ/n: Sự chuyển gen ADN được giải từ một vi khuẩn cho hoặc được chiết từ vi khuẩn cho này sang vi khuẩn nhận khác gọi là biến nạp. Các tế bào ở trạng thái có thể biến nạp được bởi 1 ADN trong môi trường là các tế bào khả nạp. Phân loại: - Biến nạp tự nhiên : Trạng thái khả nạp do các gen NST mã hóa và được kích thích bởi một số điều kiện của môi trường. - Biến nạp nhân tạo: Trạng thái khả nạp có được phải qua xử lý nhân tạo. Ví dụ ủ với nồng độ cao các ion hóa trị 2. 4.2.BIẾN NẠP (transformation)Biến nạp tự nhiên (Khả nạp tự nhiên ) Tính trạng biến nạp tự nhiên thường là tính kháng độc tố và tính nguyên dưỡng với acid amin. Trong trạng thái sinh lý thích hợp tế bào khả nạp có bề mặt tế bào thay đổi, thành tế bào xốp có hoạt tính enzym ngoại bào cao, đồng thời yếu tố khả nạp đã được tạo ra và tiết vào môi trường. Nồng độ ADN thích hợp cho biến nạp chỉ cần thấp: 0,1 µgADN/ml huyền dịch tế bào là đủ để biến nạp 5 % quần thể tế bào nhận. Thí nghiệm Grififth với D.pneumoniae (nòi S,R) 4.2.BIẾN NẠP (transformation)Biến nạp tự nhiên (Khả nạp tự nhiên ) VD: Diplococcus pneumoniae Điều kiện: - 12 phân tử Protein nhỏ được tổng hợp tiết vào môi trường - Nồng độ của TB và các yếu tố khả nạp đạt đến nồng độ nhất định. => Màng của thành TB chứa cấu trúc dạng túi bên trong mỗi túi có protein liên kết đặc hiệu với 1 trình tự AND gồm 11 cặp base. 4.2.BIẾN NẠP (transformation)Biến nạp tự nhiên (Khả nạp tự nhiên ) Streptococcus pneumoniae Hấp thụ và chế biến ADN từ bất kỳ nguồn nào chẳng hạn ADN từ tinh trùng cá hồi hay từ S.pneumoniae khác đều được hấp thụ như nhau. Tuy nhiên chỉ có ADN tương đồng với ADN của vi khuẩn nhận mới được hợp nhất, 4.2.BIẾN NẠP (transformation)Biến nạp tự nhiên (Khả nạp tự nhiên ) Haemophilus influenza Hấp thụ plasmid nguyên vẹn nếu plasmid chứa 11 thứ tự base phù hợp Còn S.pneumoniae bao giờ cũng cắt plasmid khi xâm nhập vào tế bào và chuyển thành sợi đơn. 4.2.BIẾN NẠP (transformation)Biến nạp nhân tạo (Khả nạp nhân tạo ) Đối với các VK ở điều kiện bình thường không có khả năng biến nạp, tính khả nạp có thể được cảm biến ứng nhờ xử lý tế bào với dung dịch CaCl2 hoặc ủ ở nhiệt độ lạnh. VD: Việc sử dụng các VK Gr (+) chi bacillus và các xạ khuẩn chi Streptomyces việc sử dụng nguyên sinh chất thiếu vách (tế bào trần) để biến nạp có ý nghĩa thực tiễn cao….(SGT) 4.2.BIẾN NẠP (transformation)Biến nạp nhân tạo (Khả nạp nhân tạo ) Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện áp cao. Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng qua dịch huyền phù tế bào. Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng 10.000-100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây. Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời. Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v vì vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ màng. Sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy xung điện 4.2.BIẾN NẠP (transformation)Biến nạp nhân tạo (Khả nạp nhân tạo ) Hình 2.18: Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời trên màng tế bào chất 4.3.TẢI NẠP (transduction) Đ/n: Tải nạp là sự chuyển gen ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ phage Thường chỉ một đoạn ngắn ADN được chuyển Có - Tải nạp phổ biến - Tải nạp đặc hiệu Và trong cả hai trường hợp phage tải nạp thường bị khuyết tật như mất khả năng dung giải tế bào chủ Tải nạp thường gặp ở các loài Bacillus, Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella..Tuy nhiên không phải tất cả các tất cả các phage đều có thể tải nạp và các vi khuẩn đều tải nạp được. 4.3.TẢI NẠP (transduction)4.3.1. Tải nạp không đặc hiệu Đ/n: Là kiểu tải nạp mà trong đó một đoạn bất kỳ của ADN tế bào chủ được lắp thêm hoặc được thay thế bằng genom của phage. Thí nghiệm - Chủng S.typhimurium B+ được nhiễm phage ôn hòa P22 - Sau khi dung giải tế bào chủ các phage được tách riêng và ủ với chủng S.typhimurium B- ( khác với S.typhimurium B+ ít nhất một tính trạng di truyền) - Kết quả: Khi nuôi cấy S.typhimurium B- xuất hiện một số biến chủng có tính trạng của S.typhimurium B+ 4.3.TẢI NẠP (transduction)4.3.1. Tải nạp không đặc hiệu Đối với phage 22 của Salmonella, phage P1 của E.coli chỉ một tính trạng hoặc là các gen rất gần nhau là có thể được tải nạp. Đoạn ADN được tải nạp chỉ bằng 1-2% ADN của vi khuẩn Phage PBS1 của B.subtilis tải nạp được 8% genom của TB chủ Quá trình tải nạp nhờ phage Chu trình nhân lên của phage 4.3.TẢI NẠP (transduction)4.3.2. Tải nạp đặc biệt Chỉ một đoạn ADN nhỏ xác định được tải nạp mà thôi.Chẳng hạn là phage lamda thường chỉ tải nạp gen gal và gen bio. VD: Phage tải nạp nhiễm vào 1 tế bào nhận bị khuyết tật chẳng hạn gen gal (-), tái tổ hợp qua trao đổi gen gal (-) bằng tải nạp gal (+). Các thể tái tổ hợp hoặc các thể tải nạp tạo thành sẽ là gal (+). 4.3.TẢI NẠP (transduction)4.3.2. Tải nạp đặc biệt Phage phi 80 : lắp vào cạnh gen đọc mã tổng hợp triptopan do dó thích hợp cho việc chuyển các gen trp. Một số trường hợp ADN được tải nạp không tái tổ hợp mà nằm ngoài NST của thể nhận: =>”tế bào dị hợp về tính trạng được truyền tải”-ADN được phiên mã nhưng không sao chép. => “Tải nạp khuyết” 4.3.3. Tiếp hợp ( conjugation) Đ/n: Tiếp hợp là sự vận chuyển ADN qua thiết lập cầu tiếp hợp trực tiếp giữa hai tế bào vi khuẩn, sự dịch chuyển này được định hướng từ tế bào cho (đực) sang tế bào nhận (cái). Tế bào cho chứa một yếu tố ADN có thể di chuyển được gọi là plasmid giới tính F. Những TB thiếu plasmid F (F-) chỉ có thể là thể nhận Khi tiếp hợp 100% plasmid được chuyển nhưng không có tính trạng nào của nhiễm sắc thể được hợp chuyển. 4.3.3. Tiếp hợp ( conjugation) Plasmid có thể hợp nhất vào nhiễm sắc thể và khi tiếp hợp ADN của nhiễm sắc thể sẽ được chuyển từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận với tần số cao hơn hàng trăm lần so với dùng chủng F+ => Tế bào Hfr (tần số cao của các thể tái tổ hợp) Plasmid F gắn vào NST theo kiểu thuận nghịch và khi tách ra nếu không chính xác nó sẽ kéo theo 1 đoạn ADN của tế bào chủ tạo plasmid F’ Tiếp hợp 4.4.VAI TRÒ CỦA CÁC PLASMID TRONG SINH HỌC Plasmid là phân tử ADN sợi kép, vòng kín, kích thước 105 base có khả năng tự sao chép độc lập với nhiễm sắc thể. C¸c tÝnh tr¹ng ®­îc m· ho¸ bëi plasmid th­êng cung cÊp cho c¸c tÕ bµo chñ c¸c ­u thÕ sinh tr­ëng, vµ nhê ®ã mµ c¸c tb nµy thu ®­îc ­u thÕ chän läc. Vai trò của các plasmid trong sinh học  Vai trò của các plasmid trong sinh học + Plasmid kháng thuốc + Plasmid mã hóa bacteriocin + Plasmid mã hóa yếu tố gây bệnh + Plasmid mã hóa trao đổi chất phức tạp 4.4.1. Plasmid kh¸ng Plasmid R (plasmid kh¸ng thuèc) … Kh¸ng víi kim lo¹i nÆng, nh­ b¹c, nicken, C¸c plasmid R cã thÓ ®­îc chuyÓn t¶i nhê tiÕp hîp hoÆc biÕn n¹p. Mét sè gen nhiÔm s¾c thÓ còng ®­îc huy ®éng bëi plasmid R. 4.4.2. Plasmid m· ho¸ bacteriocin Mét sè protein cã kh¶ n¨ng giÕt chÕt hoÆc k×m h·m sinh tr­ëng cña c¸c loµi th©n thuéc, lµ c¸c bacteriocin vµ do plasmid m· ho¸: Colixin, pyoxin, megaxin. 4.4.3. Plasmid m· hãa yÕu tè g©y bÖnh C¸c yÕu tè x©m thùc – invasin (S. flexneri ), Enterotoxin ( ®éc tè ruét) ®éc víi ®­êng ruét vµ g©y Øa ch¶y, Hemolyzin cã t¸c dông dung gi¶i hång cÇu. C¸c siderophor liªn kÕt s¾t nh­ aerobactin 4.4.4. Plasmid m· ho¸ trao ®æi chÊt phøc t¹p C¸c plasmid khæng lå, kÝch th­íc kho¶ng 300-1200 kb, ®­îc gäi lµ c¸c mega plasmid m· hãa c¸c gen cè ®Þnh nit¬ t¹o nèt sÇn, qóa tr×nh nitrat ho¸. C¸c plasmid cã vai trß trong tiÕn ho¸. 4.4.5. C¸c thÕ hÖ plasmid + C¸c plasmid thÕ hÖ thø nhÊt: lµ c¸c plasmid t×m thÊy trong tù nhiªn (ColE1, pSC101,…), + C¸c plasmid thÕ hÖ hai: c¸c plasmid ®­îc t¹o ra b»ng c¸ch tËp trung c¸c ®Æc tÝnh quý cña nhiÒu plasmid tù nhiªn vµo mét plasmid. + C¸c plasmid thÕ hÖ ba: ®©y lµ c¸c plasmid m¹nh nhÊt hiÖn nay víi 2 ®Æc tÝnh c¬ b¶n lµ : (1) kÝch th­íc nhá nªn sao chÐp rÊt nhanh, t¹o ®­îc nhiÒu b¶n sao trong vi khuÈn; (2) cã mang mét polylinker (polycloning site). 5. GIỚI HẠN VÀ CẢI BiẾN CƠ SỞ KỸ THUẬT GEN HiÖn t­îng giíi h¹n vµ enzym giíi h¹n do Hamilton Smith vµ céng sù ph¸t hiÖn ®Çu tiªn (1970) ë vi khuÈn Hemophilus influenzae. B×nh th­êng tÕ bµo VK bÞ nhiÔm phage th­êng bÞ phage ph¸ hñy. Mét sè chñng khi bÞ nhiÔm phage kh«ng bÞ phage ph¸ hñy mµ cã kh¶ n¨ng ph©n hñy ADN phage, nhê mét sè lo¹i enzym ®Æc hiÖu trong tÕ bµo VK. 5. GIỚI HẠN VÀ CẢI BiẾN CƠ SỞ KỸ THUẬT GEN HÖ thèng enzym ph¸ huû ADN l¹ x©m nhËp vµ b¶o vÖ ADN b¶n th©n lµ hÖ thèng enzym giíi h¹n. HÖ thèng enzym giíi h¹n (restrictase) cã hai lo¹i ho¹t tÝnh enzym: endonuclease vµ methyltransferase. C¶ hai thÓ hiÖn ho¹t tÝnh ë mét ®o¹n x¸c ®Þnh tr×nh tù ph©n biÖt. Methyltransferase c¶i biÕn tr×nh tù ADN tÕ bµo (methyl ho¸ adenyl ë vÞ trÝ N-6 khi sao chÐp), vµ råi endonuclease ®­îc ho¹t ho¸, ADN l¹ kh«ng ®­îc c¶i biÕn lµ c¬ chÊt cho enzym nµy. 5. 1. C¸c endonuclease giíi h¹n C¨n cø vµo kh¶ n¨ng nhËn biÕt vµ vÞ trÝ c¾t ®Æc hiÖu ng­êi ta chia enzym giíi h¹n lµm 3 lo¹i: Enzym giíi h¹n Lo¹i I ®­îc cïng 1 protein mang c¶ hai ho¹t tÝnh, tr×nh tù nhËn biÕt ®Æc biÖt, c¾t ADN ngÉu nhiªn. Enzym giíi h¹n Lo¹i II cã endonuclease vµ methyltransferase ®­îc mang bëi 2 protein kh¸c nhau, cã tr×nh tù nhËn biÕt ®Æc hiÖu, vÞ trÝ c¾t ®Æc hiÖu vµ n»m trong vïng nhËn biÕt, thÓ hiÖn sù ®èi xøng quay kÐp, ®­îc sö dông trong t¹o dßng nh©n b¶n gen. 5. 1. C¸c endonuclease giíi h¹n Enzym giíi h¹n lo¹i III ®­îc cïng mét protein mang c¶ hai ho¹t tÝnh, cã vÞ trÝ nhËn biÕt ®Æc hiÖu vµ vÞ trÝ c¾t còng ®Æc hiÖu. Cã hµng tr¨m enzym giíi h¹n th­¬ng m¹i. C¸c RE c¾t ®o¹n ADN lÖch ®i t¹o ra ®Çu dÝnh (cè kÕt), cßn sè enzym kh¸c nÕu c¾t trªn cïng mét vÞ trÝ sÏ t¹o ra c¸c ®Çu b»ng (tï). C¸c ®o¹n ADN víi c¸c ®Çu dÝnh bï t¹o lk hydro, sau ®ã ligase hµn l¹i, t¹o lk míi Mét sè enzym giíi h¹n 5.2. ThiÕt kÕ c¸c plasmid (vector) t¸i tæ hîp NÕu 2 lo¹i ADN ®­îc xö lý víi cïng 1 RE (restrictase) th× mçi ADN sÏ cã ®Çu dÝnh t­¬ng hîp nhau vµ 2 ®o¹n ADN Êy sÏ g¾n l¹i ®­îc víi nhau t¹o thµnh ADN duy nhÊt. Plasmid mµ cã chøa 2 lo¹i ADN cã nguån kh¸c nhau ®­îc gäi lµ plasmid t¸i tæ hîp. Tách ADN NST của “tế bào cho” Đoạn ADN bị cắt ra Gắn đoạn bị cắt vào plasmid nhờ enzim nối ADN tái tổ hợp Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận E.coli Enzim cắt ADN tái tổ hợp Tách ADNnst tb cho Tách plasmit Chuyển ADNtth vào TB nhận Enzim cắt 5.2. ThiÕt kÕ c¸c plasmid (vector) t¸i tæ hîp Cã thÓ g¾n gen (b¶n sao cADN) cña sinh vËt nh©n thËt bËc cao (vd v­în, ng­êi) vµo 1 plasmid, theo c¸c b­íc sau: tõ m« vËt chñ ta chiÕt lÊy pre-m-ARN tõ gen môc tiªu råi lo¹i bá intron vµ ghÐp nèi c¸c exon ta ®­îc m-ARN tt. Tõ m-ARN tr­ëng thµnh nhê enzym phiªn m· ng­îc tæng hîp cADN (kü thuËt RT-PCR), vµ cADN ®­îc ghÐp víi plasmid t¹o thµnh plasmid lai. C¸c b­íc chÝnh chÕ t¹o plasmid t¸i tæ hîp 5.3. §­a plasmid tt hîp vµo tÕ bµo vk nhËn BiÕn n¹p: xö lý tÕ bµo nhËn víi dung dÞch CaCl2 ë nhiÖt ®é thÊp (0-4ºC víi E. coli), bæ sung plasmid tt hîp råi ®un nãng tÕ bµo nhËn (tíi 42ºC víi E. coli) ®Ó g©y shock nhiÖt chung. Nhê vËy tÝnh thÊm cña tÕ bµo VSV thay ®æi, cho phÐp plasmid x©m nhËp tÕ bµo. TÕ bµo sau khi bÞ xö lý víi shock ®iÖn (xung ®iÖn), shock ®iÖn t¹o thµnh c¸c mao dÉn qua ®ã plasmid cã thÓ dÔ dµng x©m nhËp tÕ bµo. Ng­êi ta sö dông c¸c gen kh¸ng kh¸ng sinh nh­ kh¸ng tetracyclin, ampicilin ®Ó lµm dÊu hiÖu nhËn biÕt tÕ bµo ®· dung n¹p plasmid. 5.3. §­a plasmid tt hîp vµo tÕ bµo vk nhËn Khi tÕ bµo VK nhËn plasmid t¸i tæ hîp, tÕ bµo sinh s¶n t¹o thµnh 1 quÇn thÓ lín c¸c tb gièng nhau gäi lµ mét dßng. V× plasmid lµ t¸c nh©n biÕn truyÒn nhê ®ã mµ gen míi ®­îc ®­a vµo tb vk, nªn plasmid cßn ®­îc gäi lµ vect¬ t¹o dßng. Víi mét sè plasmid, viÖc cho vµo m«i tr­êng nång ®é thÊp cña chloramphenicol d® viÖc sao chÐp plasmid mÊt ®iÒu khiÓn khiÕn hµng tr¨m b¶n sao plasmid (vµ tÊt nhiªn gen ngo¹i lai trong ®ã) ®­îc tæng hîp bëi mçi mét tÕ bµoVK. Sù sao chÐp bÊt th­êng nh­ vËy cña plasmid gäi lµ sù khuyÕch ®¹i. 6. Kt PCR vµ x¸c ®Þnh tr×