Chương II Các phương pháp nuôi cấy tế bào cơ bản

5/17/2013 1 Chƣơng II CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO CƠ BẢN Bài giảng Môn học CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO Khoa CNSH & KTMT Nội dung cơ bản • Xác định sự sinh trưởng tế bào VSV • Các phương pháp nuôi cấy tế bào VSV • Các thiết bị nuôi cấy cơ bản VSV Mục đích xác định sinh trƣởng của tế bào “Mọi sự sinh trưởng đều có thể được định nghĩa là sự tăng tuần tự của các thành phần hóa học. Tăng đơn thuần khối lượng không thể phản ánh đầy đủ sự sinh trưởng, do tế bào có thể chỉ tăng hàm lượng các sản phẩm dự trữ của chúng như là glycogen, poly-β- hydroxybutyrite,…..” 5/17/2013 2 Mục đích xác định quá trình sinh trƣởng/nuôi cấy tế bào • Khảo sát quá trình sinh trưởng kết hợp với sự nhân đôi sinh khối cùng với các đặc tính xác định khác của sinh vật/ quần thể như: protein, DNA, RNA và nước nội bào. • Mặt khác, quá trình nuôi cấy nhằm cân bằng & duy trì một thành phần hóa học không đổi. • Môi trường dinh dưỡng thích hợp mà sau đó tế bào thích nghi thì nó sẽ ở trong trạng thái sinh trưởng tối ưu. • Chọn lọc và xác định số lượng tế bào, sinh khối tế bào hoặc hoạt tính tế bào. Phƣơng pháp đếm trực tiếp • Haemocytometer: Buồng đếm tế bào máu dùng cho những tế bào có đường kính ≥ 3 μm • Petroff-Hausser counting chamber: Buồng đếm Petroff- Hausser được dùng chủ yếu cho vi khuẩn và phân tích mẫu tinh trùng. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc • Các tế bào phát triển là tế bào có thể phân chia và tạo ra khuẩn lạc. Phương pháp này cho phép đếm các tế bào phát triển trên đĩa nuôi cấy . • Phương pháp đếm trên đĩa petri: – Phương pháp đĩa trải/hộp trải (spread plate) – Phương pháp đĩa rót/hộp đổ (pour plate). 5/17/2013 3 PP hộp trải (Spreading plate) Sinh khối sinh vật được phát triển trong môi trường canh (lỏng) và sử dụng một thể tích nhỏ hơn 100 - 200 μL được trải khắp bề mặt agar Phƣơng pháp hộp trải • Kỹ thuật hộp trải (Sự phân tán tế bào dựa trên kỹ thuật của Drigalsky) là 1 phương pháp hoàn thiện hơn với các ứng dụng rộng rãi trong thực tập VSV trong các phòng TN • Rất nhiều kỹ thuật sử dụng để xác định số lượng VK trong 1 mẫu nghiên cứu. Phƣơng pháp hộp đổ (Pouring plate) • Mẫu vật được trộn với agar nóng chảy (đã để nguội đến khoảng 60oC) và được rót trên đĩa vô trùng 5/17/2013 4 Dựa trên PP pha loãng nồng độ của R.Koch, các khuẩn lạc được cố định trên đĩa petri sạch chưa có môi trường, sau đó đổ môi trường có chứa agar đun nóng và làm lạnh ở khoảng 45-55 độ C. So sánh các phƣơng pháp Streaking plate (PP Cấy ria) 5/17/2013 5 Ƣu điểm • Có khả năng phân lập hàng triệu TB trên bề mặt • Những nhóm TB đơn lẻ phát triển dính vào nhau với những tế bào khác • Các khuẩn lạc phân lập riêng biệt • Không lẫn lộn vào các khuẩn lạc khác • Tạo dòng những nhóm tế bào VK đơn trong môi trường vô trùng Ƣu điểm • Chỉ cần các thiết bị tối thiểu • Các kết quả thu được nhanh • Có thể quan sát các đặc điểm hình thái của cơ thể 5/17/2013 6 Nhƣợc điểm • Thường rất khó phân biệt các tế bào chết và tế bào sống. • Không thích hợp cho các dịch huyền phù có mật độ thấp. • Các tế bào có kích thước nhỏ thường khó quan sát dưới kính hiển vi và có thể không thấy khi đếm. • Phương pháp đếm thực tế gây mỏi mệt và nhầm lẫn trong quá trình đếm. • Không thích hợp đối với các tế bào xếp thành cụm như là mycelium (thể sợi nấm) Phƣơng pháp xác định tế bào bằng máy đếm • Ƣu điểm – Tránh sự đơn điệu khi đếm trực tiếp bằng kính hiển vi – Kỹ thuật này cho phép không chỉ đếm được số lượng tế bào, mà còn đo cả kích thước tế bào • Nhƣợc điểm: – Không thể phân biệt giữa tế bào và các phần tử bẩn khác – khó sử dụng với các cơ thể dạng chuỗi – Không đem lại kết quả tốt với các cơ thể dạng hệ sợi (ví dụ như nấm) Máy đếm & chụp hình khuẩn lạc (Colony counter) 5/17/2013 7 Phƣơng pháp xác định sinh khối tế bào • Các phƣơng pháp trực tiếp – Trọng lượng khô của tế bào – Độ đục của dịch huyền phù tế bào • Các phƣơng pháp gián tiếp – Sự tiêu thụ chất dinh dưỡng – Tạo thành các sản phẩm – Các thành phần tế bào – Giải phóng nhiệt – Độ nhớt Nguồn Carbon + nguồn Nitrogen + Phosphate + O2 → Sinh khối tế bào + CO2 + H2O + Sản phẩm + Nhiệt Các phƣơng pháp bất động tế bào Phƣơng pháp gắn bề mặt (Microcarriers) 5/17/2013 8 Microcarriers • Vi thể mang (microcarrier) được xem là hỗn hợp hỗ trợ cho sự phát triển các tế bào đính trong bể phản ứng sinh học (bioreactor) • Là các hạt hình cầu có kích thước 125- 250µm và độ đậm đặc của chúng nhằm để duy trì trong các môi trường khuấy canh lỏng nhẹ • Gia tăng mật độ các tế bào đính protein hay tăng sinh các TB virus trong mô hình sản xuất công nghiệp (CNSH protein) hay vaccine. • Phương pháp nuôi cấy tế bào vi thể mang được thực hiện trong 1 bình xoay (spinner flask), mặc dù các loại thùng/bình khác như bể phản ứng sinh học (bể vi trọng lực hay bể dịch đệm) cũng có thể dùng cho nuôi cấy vi thể mang • Ưu điểm: trong công nghiệp sản xuất vaccine – Dễ dàng so sánh, đo đạc số liệu – Điều khiển các điều kiện phát triển TB trong bể phản ứng sinh học phức tạp, điều khiển bằng máy tính – Sự biến đổi tổng số TB trong khu vực tầng và thể tích ủ đòi hỏi bắt buộc cho 1 quy trình vận hành sản xuất – Biến đổi mạnh mẽ số lượng TB trong quy mô phòng TN kỹ thuật • Các loại Vi thể mang (microcarrier) trên thị trường – Vi thể mang dextran (Cytodex, GE Healthcare) – Vi thể mang collagen (Cultispher, Percell) – Vi thể mang polystyrene (SoloHill Engineering)  Khác nhau ở tính xốp, trọng lực đặc hiệu, cấu hình tối ưu, sự hiện diện của các thành phần động vật & hóa chất bề mặt….. 5/17/2013 9 Phƣơng pháp tạo thể xốp (Porous Glass) Thể xốp thủy tinh chứa khoảng 96% silica Các màng dạng sợi rỗng tạo thành một cấu trúc hình ống thường được sắp hàng như là các bó sợi song song bên trong một buồng hình trụ. Các tế bào được giữ lại trên thành của các sợi rỗng trong khi môi trường dinh dưỡng được thông khí luân chuyển quanh các sợi. Loại màng này có thể cung cấp thêm sự bảo vệ chống nhiễm bẩn môi trường. Các thể xốp thủy tinh thương mại trên thị trường VYCOR-Glass (PVG) & Controlled Pore Glass (CPG) Phƣơng pháp tạo thể xốp • Thủy tinh xốp (Porous glasses) có thể thu nhận được qua việc tách chiết acid của thể thủy tinh Borosilica gel kiềm tách pha • Sản xuất 1 thể thủy tinh xốp với 1 kích cỡ xốp kích cỡ khoảng 0.4-1000nm trong độ phân bố xốp • Có thể tạo ra các loại nấm mốc khác nhau, các phân mảnh TB khác nhau, các màng tế bào siêu mỏng, các tuýp và nhẫn. • Trong CNSH, thủy tinh xốp có lợi thế trong việc tinh sạch DNA và cố định enzyme hoặc VSV. • Rất phù hợp cho sự tổng hợp các oligonucleotide. • Các nucleotide khởi đầu được tập hợp ở phía trong bề mặt. Chiều dài của chuỗi oligonucleotide được quyết định bởi kích cỡ thể xốp của thủy tinh 5/17/2013 10 Phƣơng pháp bao vi thể (Ethylcellulose) Ethyl cellulose • Ethyl cellulose có nguồn gốc từ cellulose chứa nhiều nhóm glucose bị chuyển hóa nhóm hydroxyl thành nhóm ethyl ether. Số lượng ethyl ether tùy thuộc vào nhà sản xuất • Sản xuất chủ yếu dạng màng bao mỏng • Sử dụng như là chất gia vị thức ăn như chất bổ trợ chuyển đổi Ƣu & nhƣợc điểm • Ưu điểm của kỹ thuật bao vi thể – là tạo một diện tích bề mặt lớn cho sự tiếp xúc của cơ chất và tế bào. – Màng bán thấm chỉ cho đi qua một cách chọn lọc những thành phần có trọng lượng phân tử thấp • Nhược điểm chính của hệ thống màng là – Giá thành cao, – Sự tắc nghẽn của màng đã làm trở ngại cho việc chuyển khối – Khó khăn trong việc thông khí 5/17/2013 11 Phƣơng pháp bao vi thể (Emulsion) Phƣơng pháp bao vi thể (Emulsion) • Phương pháp tạo thể nhủ (Emulsion) được sử dụng ở cả 2 pha là: phân tán & liên tục ở dạng lỏng. • Ví dụ: ứng dụng PP này có thể thấy include nước trộn dầu giấm, sữa, mayonnaise, và 1 số loại thể lưu cần loại bỏ cho các công việc hàn kim loại (vàng, bạc…) cũng như ứng dụng các chất keo (colloid) trong phim chụp ảnh Phƣơng pháp tự kết khối • Các tế bào tự kết khối hoặc kết thành cụm như len cũng có thể được xem như là các tế bào được bất động – Do kích thước lớn của chúng – Ưu điểm tương tự như sự bất động bằng các phương pháp khác. – Ví dụ: nấm mốc sẽ tạo ra các tiểu thể tự nhiên, thì các tế bào vi khuẩn hoặc nấm men lại cần đến sự kết cụm. – Các nhân tố kết thành cụm nhân tạo hoặc các nhân tố liên kết ngang (cross-linkers) có thể được bổ sung để tăng cường quá trình. 5/17/2013 12 Phƣơng pháp nuôi cấy theo điều kiện chọn lọc • Hóa học: thành phần hóa học, cơ chất,…. • Vật lý: pH, nhiệt độ, …. • Sinh học: các tác nhân sinh học như VK tương tác, virus, enzyme,… Điều kiện nuôi cấy: Hiếu khí & kỵ khí Nuôi cấy hiếu khí: có O2 và đa số là tự động hóa các thiết bị nuôi cấy Nguyên lí hoạt động: Dựa trên khả năng sống, sinh sản của vi sinh vật trong những điều kiện thuận lợi về nhiệt độ, khí oxi cung cấp, về pH môi trường, về tốc độ khuấy. Tất cả các yếu tố này đều được điều khiển PID, trên cơ sở đó có thể điều khiển môi trường sống của vi sinh vật thích hợp. Hệ thống nuôi cấy vi sinh tự động (Bioengineering, Thụy Sĩ) 5/17/2013 13 Nuôi cấy kỵ khí Thiết bị nuôi cấy kỵ khí: tạo điều kiện môi trƣờng không có O2 Tài liệu tham khảo • Review of Medical Microbiology /E. Jawetz, J. Melnick, E. A. Adelberg/ Lange Medical Publication, Los Altos, California, 2002. – P.46-87. • Medical Microbiology and Immunology: Examination and Board Rewiew /W. Levinson, E. Jawetz.– 2003.– P.14-16 • Handbook on Microbiology. Laboratory diagnosis of Infectious Disease/ Ed by Yu.S. Krivoshein, 1989, P. 29-74. • Essentials of Medical Microbiology / W.A. Volk at al., – Lippincott-Raven, Philadelphia-New-York KẾT THÚC CHƢƠNG II THANK YOU!