Chương IV: Vi sinh vật và các quá trình sinh học

86 Sinh học đại cương Chương IV: Vi sinh vật và các quá trình sinh học 87 Quá trình lên men  Khái niệm về lên men 1. Bất kỳ quá trình nào liên quan đến môi trường sinh khối của vi sinh vật, bao gồm cả kị khí và hiếu khí. 2. Bất kỳ quá trình sinh học nào xảy ra có mặt oxy 3. Quá trình làm hư hỏng thực phẩm 4. Sử dụng cơ chất vô cơ như chất cho và nhận điện tử 5. Sử dụng cơ chất vô cơ như chất khử 6. Sự sinh trưởng phụ thuộc vào quá trình phosphoryl cấp độ cơ chất  Các yêu cầu cần thiết cho qúa trình lên men - Vi sinh vật tiến hành quá trình chuyển hóa sinh học - Cơ chất để chuyển hóa thành sản phẩm - Điều kiên lên men - Quá trình thu hồi và tinh sạch sản phẩm - Xử lý dòng thải - Quá trình đóng gói và thương mại hóa 88 Quá trình lên men Vi sinh vật Cơ chất Vi dinh dưỡng Phân lập Lưu giữ Xây dụng tập hợp chủng Thanh trùng môi trường Bổ sung và khuấy trôn Điều kiện lên men Thu hồi và tinh sạch Xử lý dòng thải Bao gói, thương mại Điều kiện thanh trùng Thanh trùng khí Hơi Kiểm soát nhiệt độ Kiểm soát pH Đo lượng oxy hòa tan Phun khí Điều kiện khuấy Kỹ thuật phá vỡ tế bào Vật lý Hóa học Sinh học Cấy giống 89 Canh trường gốc Bình tam giác Nhân giống Thanh trùng môi trường Thiết lập môi trường Vật liệu môi trường thô Sinh khối Dịch lên men Phân tách tế bào Nước nổi Tách chiết sản phẩm Tinh sạch sản phẩm Bao gói sản phẩm Xử lý dòng thải Thiết bị lên men 90 Sản phẩm của quá trình lên men  Sinh khối vi sinh vật: protein đơn bào  Sản phẩm của quá trình trao đổi chất thứ cấp: axit amin, axit hữu cơ, vitamin...  Sản phẩm của quá trình chuyển hóa sinh học: steroid, hoocmon...  Enzym: amylase, lipase... 91 Môi trường lên men - Dinh dưỡng vi sinh vật  Thành phần môi trường lên men - Cacbon - Nitơ - Năng lượng - Khoáng - Các dinh dưỡng khác như vitamin - Oxy/khí đối với quá trình hiếu khí - Nước  Yêu cầu môi trường lên men qui mô công nghiệp - Rẻ tiền, dễ dàng tìm được với giá và chất lượng thích hợp - Năng suất cao: tạo ra lượng sản phẩm lớn nhất trên 1 đơn vị cơ chất tiêu thụ - Tốc độ hình thành sản phẩm cao - Hạn chế tối đa việc hình thành các sản phẩm không mong muốn 92 Môi trường lên men - Dinh dưỡng vi sinh vật Khái niệm: các công cụ hóa học cần thiết để tổng hợp nên các monomer được gọi là các chất dinh dưỡng vi sinh vật  Cacbon - Ý nghĩa:mọi thành phần hữu cơ cấu tạo nên tế bào vi sinh vật đều là các hợp chất chứa cacbon. Hàm lượng trong tế bào: 50% - Nguyên tắc lựa chọn: 1. Thành phần hóa học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn 2. Đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật 3. Cấu tạo phân tử, đặc biệt là mức độ oxy hóa của nguyên tử C trong các nguồn thức ăn khác nhau - Nguồn cung cấp:  Hydrat cacbon + Rỉ đường: là nguồn carbonhydrate rẻ tiền nhất, ngoài việc cung cấp một lượng lớn đường còn chứa các cơ chất mang nitơ, vitamin và các nhân tố vi lượng khác. + Dịch chiết malt: là cơ chất thích hợp cho nấm men, nấm mốc và xạ khuẩn + Tinh bột và dextrin: được chuyển hóa trực tiếp nhờ enzym amylase có trong VSV + Cellulose: rẻ tiền, phong phú về số lượng dưới dạng phế thải của nông nghiệp và một số ngành công nghiệp (rơm, lõi ngô, phế thải gỗ, bã mía và phế thải giấy)  Methanol: rẻ tiền, nhưng ít phổ biến do chỉ một số ít VSV có thể chuyển hóa. Dùng làm cơ chất trong lên men sản xuất axit glutamic, serine và vitamin B12  Ethanol: được sử dụng rất phổ biên trong quá trình lên men  Alkane: chiều dài mạch từ C12 đến C18 93 Dinh dưỡng vi sinh vật (cont.)  Nitơ - Ý nghĩa: cung cấp nitơ tạo ra nhóm amin và imin trong phân tử axit amin, nucleotit, vitamin và 1 số hợp chất khác. Nitơ: chiếm khoảng 12% trọng lượng khô của tế bào - Nitơ vô cơ: amoniac, nitrate - Nitơ hữu cơ: + Cao ngô (hình thành trong quá trình sản xuất tinh bột từ ngô): chứa nhiều axit amin như alanine, arginine, axit glutamic, isoleucine, valine, phenylalanine, methionine và cystein + Cao nấm men: là cơ chất ưu thích của rất nhiều VSV. Chứa các axit amin và peptit, các vitamin tan trong nước, hydrate cacbon. + Pepton (các hợp chất thủy phân không triệt để protein): được nhiều vi sinh vật sử dụng nhưng đắt tiền nên chủ yếu được sử dụng trong giai đoạn nhân giống. Nguồn thu của pepton đa dạng từ thịt, casein, gelatin, keratin, hạt lạc, bột đậu, các hạt bông và các hạt hoa hướng dương.Thành phần pepton đa dạng phụ thuộc vào nguồn thu. VD: Pepton thu từ gelatin giàu proline và hydroxyproline nhưng hầu như không có các axit amin chứa lưu huỳnh. Pepton từ keratin giàu proline và xystine nhưng thiếu lysine. Pepton từ thực vật chứa nhiều hydrate cacbon + Bột đậu nành- phần còn lại của đậu sau khi chiết dầu là một cơ chất phức tạp. Thành phần gồm: protein chiếm 50%, hydrate cacbon chiếm 30% (sucrose, stachyose, rafinose, arabinoglucan, arabinan và polysaccarit), chất béo chiếm 1% và lecithin chiếm 1,8%. Thường được sử dụng trong các quá trình lên men khàng sinh 94 Dinh dưỡng vi sinh vật (cont.)  Đa lượng - Photpho (50%): tồn tại trong tự nhiên ở dạng phosphate vô cơ và hữu cơ. Cần thiết cho quá trình tổng hợp axit nucleic và phospholipid. Tạo ra tính đệm cho môi trường. - Lưu huỳnh: phần lớn lưu huỳnh trong tế bào có nguồn gốc vô cơ như sulfate (SO4) hoặc sunsit (HS). Cần thiết cho quá trình tổng hợp axit amin cystein và methionine cũng như một số loại vitamin như thiamine, biotin. - Mangan (Mn): thành phần của một số enzym xúc tác cho quá trình hô hấp tế bào - Kẽm (Zn): cofactor của nhiều enzym - Magiê: cần cho nhiều hoạt động của enzym (cofactor) cũng như cần thiết để làm ổn định ribosome, màng tế bào và axit nucleic. - Canxi : cầu nối trung gian giữa các thành phần quan trọng của tế bào - Sắt:giúp vi sinh vật tổng hợp một số enzym loai porphyrin (catalase, peroxydase...), sắc tố quang hợp  Vi lượng: chủ yếu là kim loại, đóng vai trò quan trọng trong chức năng xúc tác của enzym  Nhân tố phát triển: là các hợp chất hữu cơ như vitamin, axit amin, purine và pyrimidine, được yêu cầu với một lượng nhỏ 95 Dinh dưỡng vi sinh vật (cont.)  Nước - Chất lượng nước phụ thuộc: + pH + Thành phần và hàm lượng các muối tan + Các chất khoáng + Các loại vi sinh vật nhiễm + Hàm lượng Clo - Xử lý trước lên men + deion hóa + một số phương pháp làm mềm nước 96 Chủng giống công nghiệp  Tiêu chuẩn giống vi sinh vật công nghiệp - Thuần khiết, sinh trưởng mạnh trên các nguồn nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có. - Tạo ra sản phẩm mong muốn với năng suất cao, chất lượng tốt. - Tạo ra ít sản phẩm phụ - Bảo quản dễ dàng và giữ được các đặc tính tối ưu trong quá trình sử dụng và bảo quản - Có khả năng thay đổi các đặc tính di truyền bằng các phương pháp biến đổi gen - Các sản phẩm trao đổi chất và sinh khối của tế bào dễ dàng tách ra khỏi dịch lên men  Phương pháp tạo giống vi sinh vật - Gây đột biến nhân tạo và lựa chọn các chủng vi sinh vật có hiệu quả cho sản xuất cao - Sử dụng DNA tái tổ hợp tạo ra các cá thể mới mang các đặc tính mong muốn - Lựa chọn các chủng vi sinh vật được sử dụng trong sản xuất  Các nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của các VSV công nghiệp - Nguồn cacbon và nitơ - Kích thước và sinh khối tế bào - Môi trường vật lý và hóa học - Duy trì năng lượng cung cấp cho sự sống sót của các tế bào - Phương pháp lên men: liên tục và theo mẻ - Tốc độ sinh trưởng 97 Sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật  Pha mở đầu - Thời gian: bắt đầu cấy cho đến khi vi sinh vật đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại (3-4h) - Đặc điểm: + Tế bào chưa phân chia + Thể tích và trọng lượng tế bào tăng + Thời gian phụ thuộc vào ống giống và môi trường (tế bào càng già thi thời gian pha mở đầu càng lớn) + Chức năng: giúp tế bào thích nghi với môi trường dinh dưỡng và sinh tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể.  Pha lũy tiến (pha logarit) - Thời gian: 5-12h - Đặc điểm: + Vi sinh vật phát triển và sinh trưởng theo lũy thừa + Kích thước tế bào, thành phần hóa học, họat tính sinh lý không thay đổi theo thời gian  Pha ổn định (pha cân bằng) - Thời gian: vài h đến vài ngày - Đặc điểm: + Quần thể tế bào cân bằng động học + Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất  Pha tử vong - Thời gian: 2-3 ngày đến hàng tháng - Đặc điểm: số lượng tế bào có khả năng sống giảm rất nhanh theo lũy thừa - Nguyên nhân: + Môi trường cạn thức ăn + Môi trường bị nhiễm độc 98 Các yếu tố ảnh hưởng đến vi sinh vật  Các yếu tố môi trường - Yếu tố vật lý - Yếu tố hóa học - Yếu tố sinh học  Những biến đổi gây ra đối với vi sinh vật - Phá hủy thành tế bào - Thay đổi tính thấm của màng tế bào chất - Thay đổi đặc tính keo của nguyên sinh chất - Kìm hãm họat tính của enzym - Phá hủy các quá trình sinh tổng hợp 99 Các yếu tố vật lý  Độ ẩm môi trường - Chức năng: hòa tan và khuếch tán chất dinh dưỡng vào tế bào - Tác động: loại nước ra khỏi tế bào, trao đổi chất giảm, tế bào chết  Áp lực môi trường - Áp suất thẩm thấu: ưu trương – co nguyên sinh chất;nhược trương- trương nguyên sinh chất tế bào chết - Áp suất thủy tĩnh: làm VSV chậm hoặc mất khả năng di chuyển, làm ngừng sinh trưởng, làm thay đổi quá trình trao đổi chất nhưng không làm chết tế bào (vi sinh vật ở các mỏ dầu: 200-300atm)  Âm thanh (sóng siêu âm) - Tác động trực tiếp: làm tăng độ nhớt môi trường, tăng sức căng bề mặt - Tác động gián tiếp: làm ion hóa một phần các chất khí hòa tan và tạo thành H2O2 và NO, độc hại cho vi sinh vật  Nhiệt độ - Nhiệt độ cao: 60-70oC - làm chết tế bào VSV, nấm men, nấm mốc - Nhiệt độ thấp: không thể hiện hoạt động sống nhưng vẫn giữ được khả năng sống  Sức căng bề mặt: giúp VSV sinh trưởng và khuếch tán đồng đều trong dung dichj - Chất làm giảm sức căng bề mặt: axit béo, alcohol, hydrocacbon - Chất làm tăng sức căng bề mặt: muối vô cơ  Các tia bức xạ - Tia tử ngoại (10-300nm):gây đột biến hoặc chết vi sinh vật tùy loại VSV và cường độ chiếu, thời gian chiếu - Sóng vô tuyển điện (10-50nm; <10nm): nhiệt độ môi trường tăng rất cao và nhanh, làm chết VSV 100 Các yếu tố hóa học  pH  Các chất diệt khuẩn - Phenol và các hợp chất của phenol: phá hủy tính bán thấm của màng tế bào và làm biến tính protein - Alcohol: phân tử càng cao diệt khuẩn càng mạnh. Gây kết tủa protein. - Halogen: khí clo và các hợp chất như cloramin, cloran, I2 - Kim loại nặng Ag, Hg, Cu ,Ar: bất họat nhóm –SH trong cấu trúc của protein và kết tủa protein - Các chất oxi hóa mạnh H2O2, KMnO4: kìm hãm nhóm –SH - Thuốc nhuộm: tác dụng liên kết với protein trong tế bào dẫn đến những biến đổi có hại cho tế bào - Xà phòng: là muôi kali hoặc natri của các axit béo bậc cao. Loại bỏ VSV khỏi bề mặt do làm giảm sức căng bề mặt - Sản phẩm của quá trình trao đổi chất: quá lớn sẽ ức chế ngược VSV chuyển hóa 101 Sản phẩm của quá trình sinh trưởng VSV  Chuyển hóa bậc 1 - sản phẩm sơ cấp: dạng chuyển hóa hình thành trong pha sinh trưởng lũy tiến  Chuyển hóa bậc 2 - sản phẩm thứ cấp: dạng chuyển hóa hình thành trong cuối pha sinh trưởng cân lũy tiến và cuối pha sinh trường cân bằng - Các sản phẩm thứ cấp không cần thiết cho sự sinh trưởng và tái tạo - Sự hình thành sản phẩm thứ cấp phụ thuộc hoàn toàn vào điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường - Tạo ra với một lượng lớn hơn hẳn sản phẩm sơ cấp - Được tạo ra không chỉ từ cơ chất mà có thể từ sản phẩm sơ cấp và các sản phẩm trung gian tích lũy trong quá trình nuôi cấy  Mối quan hệ giữa sản phẩm sơ cấp và thứ cấp - Các con đường trao đổi chất của sản phẩm thứ cấp đều nảy sinh từ quá trình trao đổi sơ cấp 102 Bản chất của quá trình lên men  Khái niệm: lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học được thực hiện nhờ các họat động sống của vi sinh vật (enzym) nhằm cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cần thiết cho chúng.  Quá trình lên men: 2 pha  Pha sinh trưởng - Chức năng:Sinh tổng hợp protein và xây dựng tế bào - Tế bào VSV: sinh trưởng nhanh - Thời gian: nhân giống cho đến khi sinh khối ngừng phát triển, tích lũy nhiều sản phẩm lên men - Môi trường: giàu C, N, P - Sản phẩm trao đổi chất: hàm lượng rất thấp  Pha tích tụ các sản phẩm trao đổi thứ cấp - Chức năng: tích tụ sản phẩm trao đổi chất - Môi trường: cạn dần dinh dưỡng - Tế bào VSV: sinh khối giảm dần 103 Phương pháp lên men  Phân loại theo hình thức lên men - Phương pháp lên men tĩnh (theo mẻ): dịch ngâm các vật liệu thô được chuyển vào tăng lên men. pH và nhiệt độ được điều chỉnh kèm theo việc bổ sung các chất dinh dưỡng vào dịch ngâm. Dịch ngâm sau đó được thanh trùng hơi và chủng giống vi sinh vật được bổ sung vào. Sau 1 thời gian thích hợp, sản phẩm được lấy ra khỏi tăng lên men. - Phương pháp lên men liên tục: Cơ chất được bổ sung vào tăng lên men liên tục với tốc độ cố định.Vi sinh vật được giữ phát triển trong pha sinh trường lũy tiến. Sản phẩm được lấy ra liên tục.  Phân loại theo cách thức hô hấp - Phương pháp lên men hiếu khí: là quá trình lên men diễn ra dưới điều kiện phải cung cấp oxi. Oxi là chất nhận điện tử cuối cùng. Yêu cầu quá trình khuấy trộn và thông khí - Phương pháp lên men yếm khí: là quá trình lên men diễn ra dưới điều kiện không có oxy. Yêu cầu quá trình thông khí nhẹ cho pha sinh trưởng khởi đầu và khuấy trộn để hòa trộn môi trường và duy trì nhiệt độ nuôi cấy.  Phân loại theo cách thức nuôi cấy - Phương pháp lên men bề mặt: vi sinh vật sinh trưởng trên bề mặt của môi trường lỏng không thông khí. Sau một thời gian nuôi cấy, dịch lọc được phân tách khỏi sinh khối và thu hồi sản phẩm mong muốn. Phương pháp này đòi hỏi thời gian dài, không gian lên men rộng. - Phương pháp lên men chìm: vi sinh vật sinh trưởng trong môi trường lỏng được thông khí và khuấy trộn mạnh mẽ môi trường nuôi cấy được lấy ra phụ thuộc vào tốc độ tạo thành sản phẩm và tốc độ dòng môi trường mới bổ sung. - Phương pháp lên men bán rắn hoặc bán rắn: môi trường nuôi cấy được tẩm lên trên vật liệu mang như bã mía, bã bột mỳ, bột nhào khoai tây ... Và vi sinh vật sẽ sinh trưởng trên giá thể này. Bề mặt sinh trưởng lớn, Thu hồi sản phẩm dễ dàng. 104 Thiết bị lên men  Vật liệu: thép không rỉ  Cấu trúc và qui mô: hình trụ với thể tích phong phú từ 5-10l đến 500.000l - Binh tam giác - Qui mô lên men phòng thí nghiệm: 1-10l - Qui mô lên men thực nghiệm: 300-3000l - Qui mô lên men thương mại: 10.000-500.000l  Thiết bị làm lạnh - Lớp áo lạnh: luân chuyển hơi hoặc nước - Ống ruột gà  Thiết bị phun khí: các lỗ trên vòng kim loại hoặc vòi phun. Dưới áp suất cao, khí được đẩy vào thiết bị lên men dưới dạng các bong bóng nhỏ và oxy được khuếch tán vào môi trường lên men  Thiết bị khuấy trộn - Hòa trộn các bong bóng khí vào chất lỏng - Hòa trộn các vi sinh vật vào dịch lên men đề đồng nhất về mặt dinh dưỡng 105 Thu hồi sản phẩm  Phân tách tế bào và các cơ chất không tan ra khỏi dịch lên men - Lọc hoặc lắng - Ly tâm  Phá vỡ tế bào - Phương pháp vật lý - Phương pháp sinh học  Cô đặc sản phẩm  Các yếu tố cho phép lựa chọn phương thức thu hồi - Vị trí tồn tại của sản phẩm: nội bào hay ngoại bào - Hàm lượng sản phẩm trong dịch lên men - Giá thành của sản phẩm - Mục đích sử dụng cuối cùng của sản phẩm - Các tiêu chuẩn tối thiểu của sản phẩm - Các tạp chất có mặt trong sản phẩm lên men và đặc tính tự nhiên của nó có thể ảnh hưởng đến các giai đoạn trong quá trình thu hồi sản phẩm 106 Quá trình thanh trùng  Thanh trùng môi trường - Điều kiện thanh trùng phụ thuộc + Thành phần môi trường + Thể tích môi trường - Chế độ thanh trùng phổ biến: thanh trùng bằng hơi nước bão hòa ở 121oC, 20-40 phút - Thành phần nhạy cảm nhiệt: phin lọc (vitamin, nhân tố vi lượng…)  Thanh trùng thiết bị lên men - Sử dụng hơi nước bão hòa - VD thiết bị lên men 3000l cần 2-3h để đạt 121oC, 20-60 phút thành trùng và làm lạnh mất 1h.  Thanh trùng khí - Phin lọc 107 Quá trình nhân giống và bảo quản giống  Nhân giống - Giống đông khô - Giống thạch nghiêng - Giống nuôi lắc - Nhân giống trong hệ thống nhân giống  Bảo quản giống - Môi trường thạch nghiêng: đơn giản, tiện lợi nhưng thời gian cấy truyền ngắn. Dễ mất các hoạt tính ban đầu. - Lạnh đông (-25oC): đơn giản, thời gian bảo quản dài - Đông khô: thăng hoa phần nước có trong môi trường vi sinh vật ở áp suất thấp. Tỷ lệ sống của VSV cao, các đặc tính di truyền không bị thay đổi, thời gian giữ giống dài.