Chuyển gen và vaccine thực vật

Chuyển gen và vaccine thực vật Prof. Chu Hoang Mau Ph.D. Genetic and Molecular Biologist Vice President Thainguyen University Mobile: 0913383289 Mail: Mauchkstn@yahoo.com Mauchdhtn@gmail.com Nội dung Chuyển gen Vaccine thực vật Chuyển gen Khái niệm Vector chuyển gen và tế bào chủ Quy trình chuyển gen Khái niệm Chuyển gen (transgenesis): Đưa một đoạn DNA ngoại lai vào hệ gen (genome) của một cơ thể đa bào. Đoạn DNA ngoại lai sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại cho thế hệ sau. Khái niệm chuyển gen chỉ được sử dụng cho thực vật và động vật. Nấm men, vi khuẩn và tế bào nuôi cấy mang một đoạn DNA ngoại lai được gọi là các tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) hoặc tế bào biến nạp (transformed cell). Khái niệm Chuyển gen khác với liệu pháp gen (gene therapy). Có trường hợp các tế bào mầm không mang DNA ngoại lai. Thuật ngữ liệu pháp gen mầm (germinal gene therapy) cũng được sử dụng. Các tế bào mầm này mang DNA ngoại lai và được truyền lại cho thế hệ sau. Thuật ngữ GMO (Genetically modified organism)-Sinh vật biến đổi gen, được sử dụng chủ yếu để chỉ các thực vật chuyển gen được gieo trồng để cung cấp lương thực, thực phẩm Khái niệm Ðộng vật (Thực vật) chuyển gen là động vật (thực vật) có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào DNA genome của nó. Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào sinh sản mầm. Nếu dòng tế bào mầm bị biến đổi, các tính trạng bị biến đổi này sẽ được truyền cho các thế hệ kế tiếp thông qua sinh sản Nếu chỉ có dòng tế bào sinh dưỡng bị biến đổi, chỉ có cơ thể mang các tế bào sinh dưỡng đó bị ảnh hưởng và không di truyền lại cho thế hệ sau. Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật (thực vật) chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau Khái niệm: Gen chuyển Gen chuyển (transgene) là gen ngoại lai được chuyển từ một cơ thể sang một cơ thể mới bằng kỹ thuật di truyền. Các gen chuyển được sử dụng để tạo động vật, thực vật chuyển gen có nguồn gốc từ các loài sinh vật khác nhau Nguyên tắc cơ bản trong việc tạo động (thực vật) chuyển gen Nguyên tắc cơ bản trong việc tạo động vật (thực vật) chuyển gen là đưa một hoặc vài gen ngoại lai vào động vật (thực vật) (do con người chủ động tạo ra). Các gen ngoại lai này phải được truyền thông qua dòng mầm vì vậy mọi tế bào kể các tế bào mầm sinh sản của động vật (thực vật) đều chứa vật chất di truyền đã được sửa đổi như nhau. Cơ chế hợp nhất của DNA ngoại lai vào genome Sự hợp nhất của đoạn DNA ngoại lai vào genome được thực hiện với sự tham gia của các cơ chế sửa sai DNA của tế bào Sự hợp nhất của đoạn DNA ngoại lai vào genome diễn ra theo cơ chế tái tổ hợp tương và không tương đồng DNA ngoại lai hợp nhất vào genome nhờ quá trình tái tổ hợp không tương đồng Cơ chế thay thế gen bằng tái tổ hợp tương đồng Vector chuyển gen Vector là một phân tử DNA có khả năng mang một đoạn DNA ngoại lai và khi xâm nhập vào loại tế bào chủ thích hợp thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc vào sự sao chép của hệ gen tế bào chủ. Nói cách khác, vector là một phương tiện truyền thông tin di truyền trong cơ thể hoặc giữa các cơ thể khác nhau. Tế bào chủ thường là E.coli cho nên phần lớn các vector là các phân tử DNA dạng vòng nhỏ (plasmid) hoặc là bacteriophage. Vector có thể được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzym hạn chế và được nối với một đoạn DNA tương hợp khác nhờ enzym.  Các đặc tính của vector  Vector phải đủ lớn để mang DNA ngoại lai nhưng không quá lớn. Vector phải chứa các trình tự kiểm soát (control sequences) như khởi điểm tái bản (origin of replication), promoter. Vector phải mang một hoặc nhiều vị trí nhận biết của enzym hạn chế. Vector phải mang các gen marker chọn lọc (thường là các gen kháng chất kháng sinh). Các loại vector dùng trong chuyển gen ở động vật Vector thẳng tối thiểu (Minimum linear vectors) Vector transposon Vector retrovirus Sử dụng vector retrovirus để tạo động vật chuyển gen Các loại vector dùng trong chuyển gen ở Thực vật khi sử dụng Agrobacterium Sự gây ra các khối u do Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens và A. rhizogenes là hai loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp (crown gall) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm Sự sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sự sinh trưởng của mô thực vật in vitro. Bệnh khối u hình chóp ở cây mâm xôi (Rubus) do A.tumefaciens gây ra  Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid có kích thước khoảng 200-250 kb. Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 30oC. Trong khi hình thành khối u, T-DNA được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với genome nhân. T-DNA ổn định trong genome nhân T-DNA được phiên mã trong các tế bào khối u tạo ra nhiều mRNA polyadenyl. Cơ chế chuyển T-DNA Chuyển gen ở động vật Ðộng vật chuyển gen: Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong DNA genome của nó. Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm. Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau. Kỹ thuật chuyển gen ở động vật Tách chiết ADN, phân lập gen mong muốn Tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen Chuyển gen vào phôi động vật (vi tiêm, tế bào gốc phôi, vector virus) Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (đối với động vật bậc cao Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục Chuyển gen ở thực vật Quá trình đưa một DNA ngoại lai vào hệ gen của một sinh vật được gọi là quá trình biến nạp (transformation). Những cây được biến nạp được gọi là cây biến đổi gen (genetically modified plant-GMP) Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng lẽ, các mô hoặc cây hoàn chỉnh. Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm. Phân lập gen Gắn gen vào vector biểu hiện để biến nạp. Biến nạp vào E. coli. Tách chiết DNA plasmid. Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau đa kể trên. Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc. Tái sinh cây biến nạp. Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot...) Kh¸i niÖm miÔn dÞch Miễn dịch là khả năng tự vệ của cơ thể bằng sự thích ứng bảo vệ tự nhiên, cũng như khả năng chủ động của cơ thể chống lại bất kỳ một vật lạ xâm nhập vào cơ thể. Khoa học nghiên cứu về miễn dịch nói chung được gọi là miễn dịch học (immunology). Nếu nghiên cứu về cơ chế tác động phân tử và ảnh hưởng của yếu tố di truyền (hệ gen) lên miễn dịch, thi gọi là miễn dịch học phân tử (molecular immunology). Khái niệm Miễn dịch học là lĩnh vực khoa học đa dạng và rộng lớn, bao gồm: Nghiên cứu các quy luật và cơ chế bảo vệ của cơ thể trong quá trình sống. Nghiên cứu cơ năng tác động của hệ thần kinh trung ương trong việc điều hòa miễn dịch. Nghiên cứu các khả năng đáp ứng miễn dịch, các yếu tố miễn dịch của cơ thể đáp ứng theo các loại hình: miễn dịch dịch thể, miễn dịch qua trung gian tế bào và miễn dịch thực bào. Kh¸i niÖm… Miễn dịch học nghiên cứu ứng dụng các quy luật đó trong các phản ứng huyết thanh học, phản ứng dị ứng học, phản ứng hoá miễn dịch học, miễn dịch học phân tử, phóng xạ miễn dịch học, di truyền miễn dịch học v.v… để chẩn đoán, phòng chống bệnh và bảo vệ cơ thể. Miễn dịch học liên quan chặt chẽ với các ngành khoa học khác như: hoá học, hoá sinh học, sinh lý học, tế bào học, vật lý học, huyết thanh học, phóng xạ học, vi sinh vật học, sinh học phân tử và lượng tử… C¸c lo¹i miÔn dÞch  Miễn dịch tự nhiên (còn gọi là miễn dịch bẩm sinh, miễn dịch chủng loại hay miễn dịch có tính chất di truyền). Miễn dịch tự nhiên là loại có sẵn của chủng loại mang tính chất di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, khi sinh ra sinh vật đó đã được thừa hưởng. Có nhiều bệnh truyền nhiễm của động vật mà người không mắc. Ví dụ: người không mắc bệnh dịch tả của vịt hay không mắc bệnh dịch tả của lợn. Có nhiều bệnh truyền nhiễm của người mà động vật không mắc. Ví dụ: động vật không mắc bệnh thương hàn hay bệnh sởi của người. Có nhiều bệnh mà ở lứa tuổi này mắc, lứa tuổi khác không mắc: trẻ em dễ bị mắc bệnh bại liệt còn người lớn không mắc. Miễn dịch tiếp thu hay miễn dịch thu được Loại miễn dịch này không phải tự nhiên mà có mà là thu được trong quá trình sống của người hoặc động vật. Miễn dịch này phát sinh dưới những kích thích đặc hiệu (vi sinh vật gây bệnh, những sản phẩm độc của chúng) mà qua khỏi hoặc khi tiêm vaccin hay kháng huyết thanh v.v… Miễn dịch này có tính chất đặc dị tức là cơ thể động vật miễn dịch đối với vi sinh vật gây bệnh nhất định nhưng vẫn còn tính cảm thụ đối với vi sinh vật gây bệnh khác. Miễn dịch thu được chia làm 2 loại: miễn dịch thu được chủ động và miễn dịch thu được bị động. Vaccine an ®­îc Tiêm chủng là biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn ngừa các bệnh truyền nhiễm. Mỗi năm có một tỷ liều vaccine được sản xuất và phân phối. Nguồn thu từ vaccine đã tăng gần 3 lần trong vòng 20 năm qua, đạt 5,4 tỷ USD năm 2000 Mặt khác, do hiện tượng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn và sự gia tăng đáng báo động của các vi sinh vật mới và tái xuất hiện khiến cho nhu cầu về vaccine vẫn là ưu tiên số 1 Từ những năm 1990, đã xuất hiện một thuật ngữ mới "oral vaccine" (vaccine đường miệng) để chỉ loại vaccine không cần giữ lạnh, trong đó vaccine ăn được có nguồn gốc thực vật (plant edible vaccine) cũng thuộc nhóm này. Vaccine ăn ®­îc Vaccine ăn được có hoạt tính tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt. Nỗ lực sản xuất vaccine đầu tiên từ thực vật được ghi nhận vào năm 1990. Sau đó, nhiều thành công khác về vaccine thực vật cũng được công bố trên nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá, rau diếp, cà chua, khoai tây... Số lượng các nghiên cứu về vaccine ăn được gia tăng đã chứng tỏ tính ưu việt của thực vật như một hệ thống biểu hiện hiệu quả cao, chi phí sản xuất thấp, an toàn về mặt sinh học, sử dụng và bảo quản dễ dàng do không cần giữ lạnh. Thuât ngữ "plant edible vaccine" thường xuyên được nhắc đến trong nhiều hội thảo quốc tế về công nghệ sinh học thực vật những năm gần đây như một vaccine thế hệ mới VXAD từ thực vật là vaccine tiểu phần protein được sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu được protein làm kháng nguyên mong muốn. VXAD là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. (i)Vaccine là thuốc hoặc chế phẩm có chứa tác nhân hoặc các thành phần của tác nhân gây bệnh có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch để bảo vệ cơ thể tránh khỏi sự gây bệnh của tác nhân đó (ii) VXAD là một sản phẩm gây đáp ứng miễn dịch để bảo vệ cơ thể tránh được sự gây bệnh. Vaccine có thể đưa vào cơ thể qua đường tiêm, đường miệng và dạng sol khí. Vaccine ăn được Vaccine ăn được (iii) Ngoài ra, VXAD là vaccine tiểu phần bao gồm một hoặc nhiều chuỗi polypeptide của protein kháng nguyên trong vi sinh vật gây bệnh. Người ta chọn lọc những gen mã hoá cho các thành phần này, đưa vào vector, dựa vào hệ thống di truyền thực vật để khuếch đại gen và biểu hiện thành các kháng nguyên protein mong muốn. (iv) Cụm từ "an được" ở đây đề cập đến sự chấp nhận của cơ thể, tức là vaccine này bền vững trong dịch tiêu hoá, đi qua đường tiêu hoá mà không bị phân huỷ. Các thực vật ăn được có thể dùng để sản xuất kháng nguyên này là khoai tây, cà chua, chuối, rau diếp, gạo, lúa mì, đậu tương và ngô ( Chuyển gen tạo vaccine ăn được Điểm quan trọng nhất trong thiết kế vector biểu hiện là promoter, đây phải là promoter khoẻ, có ái lực mạnh với RNA - polymerase của vật chủ và hoạt động của promoter được điều hoà một cách dễ dàng Trong sản xuất vaccine ăn được, người ta thiết kế một vector gồm hai gen: Một gen mã hoá cho kháng nguyên virus và một gen kháng sinh Chuyển gen ổn định: Chuyển gen vào nhân là phương pháp chuyển gen ổn định do gắn gen quan tâm vào nhiễm sắc thể thực vật được ứng dụng phổ biến trong sản xuất protein đầy đủ chức năng Vaccin thực vật (vaccine ăn được) Vaccine ăn được là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào Vaccine ăn được nguồn gốc thực vật có hoạt tính tương tự như vaccine thông thường. Khác với vaccine thường là vaccine ăn được do thực vật sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt. Đặc điểm của vaccine thực vật Vaccin thực vật được chính mô và thành tế bào thực vật bao bọc, hạn chế được sự phá hủy và ổn định, bền vững trong cơ thể. Dễ sử dụng: đưa vào cơ thể theo đường tiêu hóa; Vaccin này có thể ăn tươi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ). Dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên, giá thành thấp. Tính ổn định cao, dễ bảo quản, dễ sử dụng và kinh tế cao. Độ an toàn cao, ít bị nhiễm với các tác nhân gây bệnh của động vật và người. Có thể không cần tinh sạch như các loại vacxin khác. Quy trình sản xuất Thiết kế vector chứa gen quan tâm Chuyển vector vào vi khuẩn Agrobacterium Chuyển gen quan tâm vào tế bào thực vật Phân tích biểu hiện gen trong cây Kiểm tra khả năng miễn dịch ở động vật Tinh sạch và sản xuất ~20% trọng lượng tươi 10% 20 000mg/kg Độ tinh sạch cao Protein ổn định, bảo quản dễ và lâu dài ~0,2% trọng lượng tươi Mức độ biểu hiện 1% 20mg/kg PROTEIN LÁ VÀ HẠT Virus cúm gia cầm H5N1 xuất hiện trên thế giới đã từ lâu. Năm 1988 đã giải mã được gen mã hoá hemagglutinin (gen H5) của virus cúm H5N1 phân lập ở Scotland. Năm 1997 18 trường hợp nhiễm cúm H5N1 phát hiện ở Hong Kong, 6 ca tử vong. Cuối năm 2003 đầu năm 2004 dịch cúm gia cầm đã lan rộng ra nhiều nước châu á bao gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia, Lào, Thái Lan và Indonesia. Hàng triệu gia cầm đã bị chết và bị tiêu huỷ do virus cúm H5N1. Virus H5N1 đã vượt ra khỏi phạm vi châu á và lan sang cả các nước châu âu như Rumani, Nga, Thuỵ điển, Thổ Nhĩ kỳ, Đức, Pháp v.v... Theo thông báo của WHO, trên thế giới đã có tới hơn một trăm trường hợp nhiễm cúm H5N1, trong đó có hơn sáu mươi trường hợp tử vong. Dịch cúm A/H5N1 và tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới Dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới H5N1 có thể nhiễm từ gia cầm sang người với các triệu chứng lâm sàng rất trầm trọng và gây ra nhiều ca tử vong Cúm A/H5N1 Virus cúm có tính chất đặc biệt: - Bộ gen phân cắt sẵn thành 8 phân đoạn khác nhau - Hai gen thuộc phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho hai kháng nguyên quan trọng nhất trên bề mặt củavirus là hemagglutinin(HA) và Neuraminidase (NA) Virus cúm A/H5N1 Vaccine cúm A/H5N1 và biện pháp phòng chống Cúm gia cầm H5N1do virus thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Những năm gần đây đã gây nên đại dịch gây thiệt hại lớn về kinh tế và con người các nước trên trên thế giới, đặc biệt là các nước Đông nam Á. Biện pháp tốt nhất để ngăn chặn dịch cúm là dùng vaccine. Với sự tiến bộ của khoa học và công nghệ, một số vaccine phòng chống virus cúm A đã được nghiên cứu và thử nghiệm thành công, bao gồm: Vacxin bất hoạt (inactivated vaccine) Vacxin nhược độc (attenuated vaccine) Vacxin thế hệ mới: - vacxin tái tổ hợp (recombination vaccine) - vacxin thực vật (plant-base vaccine), ... Vaccine cúm A/H5N1 và biện pháp phòng chống Tiêm phòng vacxin là phương pháp phòng chống sự lây lan của nguồn bệnh với vật nuôi và con người. Có nhiều loại vacxin đang được sử dụng và nghiên cứu, trong đó vacxin thế hệ mới có nhiều ưu điểm nổi bật, có ý nghĩa kinh tế, an toàn và hiệu quả cao. Vacxin ăn được có nguồn gốc từ thực vật cũng sẽ là vacxin có tính ưu việt, giá thành thấp, dễ bảo quản và phân phối, an toàn và hiệu quả. Chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virut H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vacxin thực vật Mục tiêu nghiên cứu Tạo cây đậu tương chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virut H5N1, làm cơ sở để sản xuất vacxin ăn được cho gia cầm Nội dung nghiên cứu Thiết kế gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào vector thích hợp chuyển gen ở thực vật Chuyển gen mã hóa protein bề mặt virus H5N1 vào cây mô hình Chuyển gen mã hóa protein bề mặt virus H5N1 vào cây đậu tương Phân tích và đánh giá các dòng cây đậu tương chuyển gen Phương pháp Thiết kế vector chuyển gen bao gồm: Phương pháp PCR Phương pháp ghép nối DNA Kiểm tra vector tái tổ hợp bằng cắt enzim hạn chế Đọc và phân tích trình tự gen Biến nạp gen vào thực vật Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào Agrobacterium tumefacien bằng xung điện Kiểm tra chủng mang vector quan tâm bằng colony-PCR và cắt enzim hạn chế. Phương pháp biến nạp vào cây trồng thông qua Agrobacterium. Phân tích cây chuyển gen ở mức độ phòng thí nghiệm bằng chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh và PCR. Phân tích đánh giá cây chuyển gen ở nhà kính Kiểm tra sự ổn định gen chuyển bằng PCR và Southernblot Kiểm tra mức độ biểu hiện gen bằng lai Northern và Western blot Dự kiến kết quả nghiên cứu Thiết kế đoạn gen quan tâm vào vector thích hợp mang promotor chuyên dụng phục vụ chuyển gen vào hạt cây trồng và biểu hiện trong vi khuẩn. Chuyển gen quan tâm vào cây mô hình, phân tích mức độ biểu hiện của gen quan tâm từ đó lựa chọn những vector có khả năng biểu hiện cao trong hạt để chuyển vào cây đậu tương. Chuyển gen quan tâm vào cây đậu tương. Phân tích đánh giá cây đậu tương chuyển gen.