Công nghệ tế bào thực vật

Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt Bài 1: LÀM QUEN PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ PHA CHẾ DUNG DỊCH MẸ. I. Giới thiệu hệ thống phòng thí nghiệm NCM&TBTV: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật hiện đại được thiết kế phù hợp với tính chất dây chuyền của loại công việc này có sơ đồ tổng quát như sau: 1 2 3 4 1. Phòng rửa, sản xuất nước cất và sấy, hấp 2. Phòng chuẩn bị môi trường 3. Phòng cấy vô trùng 4. Phòng nuôi Bên cạnh phòng thí nghiệm phải có hệ thống nhà kính, nhà lưới và vườn ươm để trồng cây lấy nguyên liệu nuôi cấy và trồng cây đã tái sinh trong quá trình chọn lọc in vitro. Các thiết bị chủ yếu của các phòng trên 1.1. Phòng rửa, sản xuất nước cất và sấy, hấp Máy cất nước 1 lần (12-20 lít/giờ) Máy cất nước 2 lần (4 lít/ giờ) Máy sản xuất nước khử ion Tủ sấy 60-6000C Nồi hấp môi trường (Autoclave) 1.2. Phòng cấy vô trùng Laminar Quạt thông gió Bộ dụng cụ cấy gồm dụng cụ cấy và bộ khử trùng 1.3. Phòng nuôi Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có chỗ chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux. Ở đây ta sử dụng đèn compact 18W có hệ thống cài thời gian tự động, tận dụng tối đa ánh sáng tự nhiên bằng các cửa kính. Máy điều hoà nhiệt độ, chỉnh t0 =±250C Máy lắc nằm ngang trong 100-200 vòng/ phút Báo cáo thực hành 1 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 1.4. Phòng chuẩn bị và pha môi trường Máy đo pH Máy khuấy từ Cân phân tích 10-4g Cân kỹ thuật 10-2g Bếp điện Microwave II. Pha Stock( dung dịch mẹ): 2.1. Chuẩn bị môi trường Murashige- Skoog (MS, 1962) Chia môi trường ra làm 5 phần: MS1, MS2, MS3, MS4, MS5 (Bảng 2.1) Dung dịch mẹ Nồng độ(mg/l) Nồng độ trong dung dịch mẹ (g/200 ml) Dung tích dùng cho 1 lít môi trường MS1: KNO3 KH2PO4 NH4NO3 MgSO4 1900 170 1650 370 19 1,7 (x10) 16,5 3,7 {20 ml MS2: CaCl2 440 (x 20) { 6,64 {10 ml MS3 : H3BO3 MnSO4.4H2O CoCl2.6H2O CuSO4.7H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O KI 6,2 22,3 0,025 0,025 8,6 0,25 0,83 0,124 0,338 0,5 mg (x20) 0,5 mg 0,213 5 mg 16,6 mg {10 ml MS4: FeSO4 Na2EDTA 27,8 37,3 0,556 (x20) 0,746 {10 ml MS5: Myo-Inositol Thiamine.HCl Pyridoxine.HCl Acid nicotic Glycine 100 0,1 0,5 0,5 2 2 2 mg (x20) 10 mg 10 mg 40 mg {10 ml Cách tiến hành pha các dung dịch MS trên: - Cân hóa chất trong bảng trên với số lượng đã ghi cụ thể ở cột 3 pha 200 ml nước cất 2 lần và trình tự tiến hành theo thứ tự hóa chất đã ghi ở bảng trên. Báo cáo thực hành 2 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt - Với hoá chất cân với số lượng có đơn vị g thì có thể dùng cân kỹ thuật, đối với đơn vị mg phải dùng cân phân tích. - Chú ý khi pha dung dịch mẹ thì chúng ta chỉ pha với lượng vừa phải (200 ml) và tránh hiện tượng kết tủa giữa các hoá chất trong cùng một dung dịch MS. Mỗi dung dịch MS Nên để trong một lọ đựng dung dịch riêng rẽ và được bảo quản trong tủ lạnh ở ngăn 40C để tránh hỏng hóa chất. - Phải đánh tan từng hoá chất 1 trong các cốc thuỷ tinh nhỏ với 1 lượng nước vừa đủ sau đó tráng lại kỹ( với tổng cộng lượng nước phải không lớn hơn tổng thể tích MS cần thiết, ở đây là <=200ml) - Riêng đối với dung dịch MS4 phải cho vào trong lọ thủy tinh màu hoặc bọc giấy hoặc nilon đen để bảo quản. - Ghi nhãn dán trên thành bình hoá chất gồm tên nhóm pha, ngày pha, nồng độ, tên hóa chất. 2.2. Chuẩn bị môi trường WP Pha môi trường WP1, WP2, WP4 Bảng 2.2. Hóa chất Nồng độ Mg/l Dung dịch stock g/200 ml Dùng cho 1 lít môi trường WP1 NH4NO3 MgSO4.7H2O KHSO4 K2SO4 400 370 170 990 8 (x 20) 7,4 3,4 19,8 10ml WP2 CaCl2 Ca(NO3)2.4H2O 96 556 (x 20) 1,45 11,12 10ml WP4 Na2EDTA Fe2SO4.7H2O 37,3 27,8 (x 20) 0,746 0,556 10 ml Cách tiến hành pha môi trường WP cũng tương tự như môi trường MS, nhưng một điều nên chú ý rằng môi trường WP này chủ yếu sử dụng cho cây thân gỗ. Đối với WP4 chúng ta cũng bảo quản lạnh trong lọ màu Báo cáo thực hành 3 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt BÀI 2. MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG NHÂN CHỒI CẨM CHƯỚNG VÀ ĐỒNG TIỀN 1. Dụng cụ, thiết bị và hoá chất 1.1. Dụng cụ và thiết bị -Cốc chịu nhiệt, nồi inox 3 lit, ống đong, đũa thuỷ tinh…để pha môi trường dinh dưỡng -Nồi Autoclave -Cân kĩ thuật 10-2gam -Máy cất nước -Máy đo pH -Bếp điện -Nhãn dán 1.2. Hoá chất -MS (từ MS1 đến MS5) -KIN: 1 mg/l -BA: 1 mg/l -Agar -Saccharose -Cồn 70% 2. Cách tiến hành 2.1. Pha môi trường nhân nhanh chồi đồng tiền (Gd.a) 1 lít Công thức môi trường: MS + 1mg/l BA +1 mg/l KIN + 30g sac + 8 agar pH = 5,8 - Lấy MS đầy đủ theo tuần tự MS1: 20ml ; MS2 ; MS3 ; MS4 ; MS5 mỗi MS này 10ml. - Dùng micropipet hút 1mg/l BA và 1 mg/l KIN. Tất cả cho vào cốc 500ml. Đặt lên bếp khuấy từ, bỏ cục khuấy từ vào cốc, lấy thiết bị đo pH vào cốc cho ngập đầu, đầu thiết bị đo pH đựơc bảo quản trong dung dịch KCl 3M. Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 0,1N hoặc HCl 0,1N để chỉnh pH = 5,8. .Đo pH xong rửa đầu pH bằng nước cất, Báo cáo thực hành 4 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt dùng giấy mềm lau khô rồi ngâm vào dung dịch bảo quản, tắt bếp khuấy từ, lấy cục khuấy từ ra rửa lại bằng nước cất, lau sạch, để lại vào đĩa petri. Bổ sung nước cất đến 400ml. - Cân 30g saccharo, 8g agar (dùng cho 1l môi trường). Cho agar vào nồi thêm 500ml nước tiến hành khuấy đều, đun sôi trên bếp điện vài phút. Trộn chung agar và dung dịch đã pha chất kích thích sinh trưởng đã đo pH lại với nhau,cho thêm nước cất cho đủ 1lít, phân phối môi trường vào trong các chai, bình tam giác thủy tinh. Dùng túi nilon và dây chun buộc chặt nắp bình. Dán nhãn có ghi tên môi trường đồng tiền nhân chồi là Gd.a lên bình môi trường. - Kiểm tra nước trong và ngoài nồi khử trùng Autoclave. Xếp các bình môi trường vào giỏ của nồi. Đậy nắp và nhấn nút Star, tiến hành hấp môi trường ở mode 2 (1210C/25 phút) hấp xong lấy ra, dựng đứng các chai môi trường, để nguội. 2.2. Pha môi trường nhân chồi cẩm chướng (D.a) Công thức môi trường: MS + 30 g sac + 8 g agar + 0,3 mg/l BA +0,2 mg/l IBA pH = 5,8 Để pha môi trường nhân chồi cẩm chướng ta thực hiện các thao tác tương tự như pha môi trường đồng tiền chỉ khác chất điều khiển sinh trưởng ở đây là 0,3 mg/l BA và 0,2 mg/l IBA. Dán nhãn ghi tên môi trường là D.a Báo cáo thực hành 5 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt BÀI 3. CẤY CHUYỀN CHỒI ĐỒNG TIỀN VÀ CẨM CHƯỚNG - Chuẩn bị dụng cụ cho 1 box cấy: + Panh kẹp: 2 cái + Đĩa inox: 2 cái + Đèn cồn: 2 cái + Ống đựng cồn: 2 cái + Dao: 2 cái + Kéo: 2 cái + Đĩa petri: 2 cái + Cồn 70% - Khử trùng box cấy: Dùng bông thấm cồn lau bề mặt trong và thành trong của box cấy, đặt các dụng cụ vào box, phủ rèm và bật công tắc nguồn, bật quạt và đèn UV trong thời gian 30 phút. Mẫu: Bình cẩm chướng đã phát triển thành nhiều chồi, mẫu có màu hơi trắng do bệnh thuỷ tinh thể. Môi trường D.a đã pha sẵn hôm trước lấy bông thấm cồn lau xung quanh thành bình , xếp vào rổ để cạnh box cấy. - Tiến hành: + Box cấy sau khi tắt UV, bật đèn sáng, bật quạt, thắp đèn cồn. + Trước khi cấy phải tiến hành rửa tay sạch sẽ bằng xà phòng, lau khô và dùng cồn lau lại thật kỹ. Khử trùng đĩa petri, đĩa inox bằng cách đổ 1 ít cồn vào đĩa dàn đều và đốt, đối với panh kẹp, kéo và dao nhúng cồn và hơ trên ngọn lửa cho cháy đỏ, để thật nguội. + Bình mẫu mở nắp, hơ miệng bình để tránh mẫu có thể nhiễm bởi vi sinh vật bám trên miệng bình, dùng panh gắp mẫu ra đĩa inox, tách riêng từng chồi đối với những chồi nhỏ ở gốc mẫu cấy, bỏ bớt lá vàng và những phần quá trắng do bệnh thuỷ tinh thể, bỏ rễ và phần agar dính ở gốc. Đối với những đoạn thân dài thì dùng dao hoặc kéo cắt thành từng đoạn 1 sao cho mỗi đoạn có ít nhất 1 chồi nách. Mỗi lần chỉ cắt1 ít mẫu để trên dĩa vừa đủ cấy cho 1 đến 2 bình tam giác để tránh mẫu bị khô, héo, do sức nóng của đèn cồn hay quạt gió Báo cáo thực hành 6 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt + Mở nắp miệng bình môi trường và hơ qua ngọn lửa đèn cồn, dùng panh gắp mẫu vừa tách cấy xuống mặt thạch (chồi, đỉnh hướng lên trên). Một bình cấy chuyền ít nhất phải được 6-10 chồi tuỳ mẫu và tuỳ bình môi trường lớn hoặc nhỏ. Hơ qua nắp trên ngọn lửa đèn cồn, đậy nắp cột thun, ghi thông số: tên người cấy, nhóm cấy, ngày cấy. Chú ý thao tác phải hết sức cẩn thận, không cho tay đưa lên không gian phía trên đĩa mẫu và các thao tác thực hiện hoàn toàn trong điều kiện vô trùng. + Sau khi tiến hành cấy xong, làm vệ sinh box cấy, tắt nguồn tủ cấy, rửa dụng cụ cấy cho sạch và cho vào tủ sấy ở 1600C Kết quả: Sau 2 ngày cấy quan sát thấy có 1/5 bình xuất hiện 1 đám mốc, còn các bình còn lại không quan sát thấy hiện tượng nhiễm vi sinh vật cho đến các ngày hôm sau. Mẫu cấy phát triển bình thường, sau 2 tuần vẫn chưa thấy nhiễm. Các mẫu cấy phát triển sinh khối bình thường, màu sắc của mẫu cấy có xanh hơn so với lúc đầu nhưng vẫn bị mọng nước. Báo cáo thực hành 7 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt Bài 4. PHA MÔI TRƯỜNG VÀO HẠT KEO LAI 4.1. Pha môi trường vào hạt keo lai Pha môi trường cây keo lai, áp dụng công thức của cây thông đỏ. Cách tiến hành Môi trường vào hạt keo lai: 1/2WP + 7g agar +20g sac pH = 5,8 Các bước tiến hành tương tự pha môi trường nhân chồi đồng tiền và cẩm chướng chỉ khác thay MS bằng WP, và không có chất điều khiển sinh trưởng. Đối với WP ta pha: 10ml mỗi loại từ WP1 đến WP5 4.2 2. Qúa trình gieo hạt trong phòng thí nghiệm. - Chuẩn bị dụng cụ cho 1 box cấy: + Dụng cụ: 2Panh kẹp Bình nước cất 2 lần đã thanh trùng Cồn tuyệt đối, thuỷ ngân clorua 1% 2 Bộ khử trùng, 2đĩa inox, 2đĩa petri, cốc đố nước thừa 1000ml, ống đong 50ml (pha cồn, thuỷ ngân clorua). Đèn cồn, quẹt lửa, đồng hồ. Tất cả được lau cồn trước khi để vào box, box cũng đã được lau bằng cồn. + Bật box cấy: bật công tắc nguồn, bật quạt, bật đèn UV khử 30 phút. + Hạt keo lai đã rửa qua nước sạch, được ngâm trong nước ấm 600C, để qua đêm được dùng để vào mẫu. + Môi trường A.e đã chuẩn bị hôm trước, lấy bông thấm cồn lau lại và xếp vào rổ, để bên cạnh box cấy. - Tiến hành: + Box sau 30 phút, tắt UV, bật đèn, vặn quạt nhỏ lại. Trước khi tiến hành làm phải rửa sạch tay bằng xà phòng dưới vòi nước, lau lại bằng cồn, trang phục tóc tai gọn gàng. + Hạt keo để ráo nước cho vào bình lắc. Tiến hành lắc bằng cồn 70 % trong 30s(cồn 99,50 pha thành cồn 700 bằng ống đong: ≈15ml nước/ ≈35ml cồn 99,50 ), tráng lại Báo cáo thực hành 8 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt mẫu bằng nước cất 5 lần. Tiếp tục khử trùng thủy ngân 0,1%/ 10 phút (được pha từ HgCl21%: 5ml HgCl21% / 45ml nước cất khử trùng ), lắc đều tay, không nghỉ. Và tráng bằng nước cất lại mẫu 5 lần. Đổ nước thừa vào cốc 1000ml đã chuẩn bị. + Môi trường chuẩn bị sẵn, bật đèn cồn. Khử trùng đĩa petri, đĩa inox, panh cấy. + Lấy hạt từ bình lắc ra đĩa inox. Dùng panh cấy gắp từng hạt cấy vào môi trường thạch. Lượng hạt cấy vào phụ thuộc vào bình to hay nhỏ. Sau đó đậy nắp nilon lại và dán nhãn lên thành bình: tên người cấy, nhóm cấy, ngày cấy. + Sau khi xong việc cấy hạt, tiến hành vệ sinh box, rửa sạch dụng cụ, để ráo, cho vào tủ sấy. Trong quá trình làm phải cẩn thận không được để tay lên trong phạm vi khu vực đĩa cấy. Báo cáo thực hành 9 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt BÀI 5. NHÂN CHỒI KEO LAI - Dụng cụ chuẩn bị cho 1 box cấy tương tự như nhân chồi cẩm chướng, đồng tiền: + Đĩa inox, đĩa petri, panh cấy, dao, kéo + Ống đựng cồn. + Đèn cồn, quẹt lửa. + Bật box cấy. + Mẫu: Bình keo lai cấy đã phát triển thành nhiều chồi, có rễ và dài (cao) + Môi trường chuẩn bị sẵn từ hôm trrước, lau bằng cồn, xếp vào rổ để cạnh box cấy. - Tiến hành: + Box sau khi tắt UV, bật nguồn, bật đèn sáng, bật quạt. Vệ sinh tay bằng xà phòng dưới vòi nước chảy. Để khô tay và lau lại bằng cồn, thắp đèn cồn. Khử trùng đĩa petri, đĩa inox bằng cồn và đốt cháy. Panh và kéo (hoặc dao) đem đốt trên ngọn lửa đèn cồn cho cháy đỏ để nguội. + Bình mẫu mở nắp, dùng panh gắp mẫu ra để đĩa inox, cắt từng đoạn 1 – 2cm, bỏ bớt lá, bỏ rễ. Tiếp tục dùng môi trường đã pha tiến hành lấy panh gắp cấy bằng cách cắm đoạn thân, chồi vừa cắt xuống mặt thạch (chồi, đỉnh hướng lên trên). Chú ý trong quá trình cấy bình luôn dăt nghiêng 1 góc 450 so với mặt tủ, các thao tác thực hiện trong không gian cách đền cồn 20 cm và tuyệt đối không để tay lên phía trên đĩa mẫu. Một bình cấy chuyền ít nhất phải được 4 – 5 đoạn thân. Lượng chồi cấy vào phụ thuộc bình to hay nhỏ. Hơ miệng bình trên ngọn lửa đèn cồn, đậy nắp nhãn: tên người cấy, nhóm cấy, ngày. + Sau khi xong việc cấy hạt, tiến hành vệ sinh box, rửa sạch dụng cụ, để ráo, cho vào tủ sấy. Trong quá trình làm phải cẩn thận không được để tay lên trong phạm vi khu vực đĩa cấy. KẾT QUẢ: sau khi cấy vài ngày quan sát thấy các bình sau khi cấy phất triển rất tốt trừ những bình bị nhiễm do thao tác cấy không cẩn thận. Báo cáo thực hành 10 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt BÀI 6. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NHÂN CALLUS CẨM CHƯỚNG (D.c) Tiến hành pha 3 lít môi trường:- 2 lít rắn - 1 lít lỏng Công thức môi trường đặc nhân callus cẩm chướng: MS + 30g sac + 7g agar + 1mg/l 2,4D + 0,5 mg/l BA pH = 5,8 Công thức môi trường lỏng nhân callus cẩm chướng: MS + 30g sac + 1mg/l 2,4D + 0,5 mg/l BA pH = 5,8 Các hoá chất và dụng cụ cũng chuẩn bị như những lần pha khác nhưng chỉ thay chất điều hoà sinh trưởng là 1mg/l 2,4D và 0,5 mg/l BA. Mọi thao tác còn lại tiến hành tương tự như những lần pha môi trường trước. Chú ý đối với môi trường lỏng không bổ sung agar, thay vì đun agar ta sẽ đun nước cất. Báo cáo thực hành 11 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt BÀI 7. NHÂN CALLUS CẨM CHƯỚNG - Chuẩn bị dụng cụ: + Đĩa inox, đĩa petri. + Panh cấy, dao kéo. + Đèn cồn, quẹt lửa +Ống chứa cồn Thao tác khử trùng box cấy cũng tương tự như những lần cấy trước. - Mẫu callus là những bình callus cẩm chướng. Lau xung quanh bình mẫu bằng cồn. Môi trường cũng được lau sạch bằng dung dịch cồn, xếp vào rổ để vào box cấy. - Sau 30 phút, tắt UV, bật đèn sáng, bật quạt, rửa tay sạch sẽ bằng xà phòng dưới vòi nước, tay áo xắn cao, có đồng hồ, nhẫn, vòng tay tháo hết ra, bật đèn cồn. Tiến hành quá trình cấy chuyền callus. + Hơ bình mẫu qua ngọn lửa đèn cồn. + Đĩa inox, đĩa petri đốt cháy bằng đèn cồn. + Dao cắt, panh cấy được đốt cháy đỏ, để nguội. + Ống đựng cồn, dao cấy sau mỗi lần sử dụng nhúng vào để đốt lại khử trùng. + Lấy mẫu callus ra đĩa inox, cắt nhỏ, khoảng 1–2 mm2, mỗi bình cấy khoảng 5 mẫu. + Miệng bình môi trường được hơ qua ngọn lửa đèn cồn, dùng panh gắp mẫu callus đã cắt cho vào bình và nhấn nhẹ xuống môi trường thạch. + Cấy vào môi trường lỏng với mẫu tương đương nhưng chỉ cần gắp bỏ vào là được. Hơ lại trên đèn cồn. Đậy nắp buộc dây thun ghi kết quả, thông số. - Sau khi cấy xong được 10 bình lỏng. Bình lỏng cho vào máy lỏng lắc, vận tốc là 65 vòng/ phút, trong 10 ngày. - Sau khi cấy tiến hành vệ sinh box cấy, khu vực làm việc, rửa dụng cụ sạch sẽ, cho vào tủ sấy, bật tủ sấy ở 1600C. KẾT QUẢ: Sau khi cấy 2 tuần quan sát thấy callus cấy trong môi trường rắn bị nhiễm 3 bình. Callus cấy trong môi trường lỏng bị nhiễm 1bình. So sánh sự phát triển của callus trong nuôi cấy lỏng lắc và lỏng tĩnh cho thấy:Cả hai phương pháp nuôi cấy các bình callus đều phát triển sinh khối nhưng ở phương pháp nuôi cấy lắc callus phát triển nhanh hơn. Báo cáo thực hành 12 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt Bài 8. PHA MÔI TRƯỜNG RA RỄ CÚC Công thức môi trường: ½ MS + 25 g sac + 7 g agar + 0,2 NAA + 0,5 g than pH = 5,8 Dụng cụ và hoá chất cũng được chuẩn bị như những lần pha môi trường trước, sau khi đo pH ta mới cho than vào, khuấy cho than phân tán đều trong dung dịch. Môi trường sau khi đun xong, phân phối vào trong các bình tam giác 250 ml. Tiến hành xếp bịch để đổ môi trường, cho toàn bộ bịch vừa gấp xong vào 1 bao lớn hấp cùng với các bình tam giác môi trường kèm theo khăn để tránh phỏng tay khi đổ môi trường sau này. Kiểm tra nước trước khi sử dụng thiết bị, xếp giỏ môi trường vào, khởi động nồi hấp ở chế độ 1210C/ 25 phút, tiến hành đồng thời với khử trùng tủ cấy để tiến hành đổ môi trường vào trong bịch. Sau khi hấp xong nhiệt độ xuống khoảng 980C là có thể đổ môi trường vào bịch. Việc đổ môi trường vào các bịch được tiến hành ở trong box vô trùng. Phân phối môi trường từ bình tam giác vào các bịch nilon sao cho mỗi bịch khoảng 50ml môi trường, gấp mép bịch lại chú ý tay không được chạm mép bịch dùng ghim để cố định mép bịch. Dán nhãn, ghi tên môi trường, để nguội xếp trong các kệ ta được các bịch môi trường ra rễ cúc. Làm vệ sinh box cấy. Báo cáo thực hành 13 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu