Đề tài Khả năng ứng dụng vi khuẩn methylobacterium spp trong việc gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt giống cây trồng

TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 13, SỐ T3 - 2010 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Trang 49 KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SPP. TRONG VIỆC GIA TĂNG TỈ LỆ NẢY MẦM CỦA HẠT GIỐNG CÂY TRỒNG Kiều Phương Nam (1), Hồ Lê Trung Hiếu(2), Trần Minh Tuấn(1), Đỗ Thị Di Thiện(1), Bùi Văn Lệ(1) (1)Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (2) Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh (Bài nhận ngày 13 tháng 10 năm 2009, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 03 tháng 11 năm 2010) TÓM TẮT: Chi vi khuẩn Methylobacterium có khả năng kích thích sự sinh trưởng của thực vật, thông qua việc tiết các phytohormone. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩn thuộc chi Methylobaterium (M. thiocyanatum JCM 10863T (MT), M. radiotolerans JCM 2831T (MR), M. fujisawaense JCM 10890T (MJ), M. extorquens JCM 2802T (ME), M. oryzea 1021b, M. radiotolerans 1019 và M. fujisawaense 1024) lên sự nảy mầm của hạt giống (ñậu ñũa, ñậu xanh, ñậu cove và cà chua). Kết quả cho thấy: Các chủng ME, 1019, 1024, MT, MR, MJ, 1021b ñều có tác ñộng tích cực lên sự nảy mầm của các loại hạt giống và mỗi chủng ñặc hiệu với một hay một vài loại hạt. Phương pháp ñông khô sinh khối, hay ñồng khô sinh khối với cát hoặc than bùn không giữ hoạt tính của chủng vi khuẩn so với phương pháp dùng chính hạt giống cây trồng làm chất mang. Từ khóa: Methylobacterium, phytohormone, sự nảy mầm của hạt giống, chế phẩm 1. GIỚI THIỆU Methylobacterium là nhóm vi khuẩn có sắc tố hồng, dinh dưỡng methyl tùy ý (PPFM) [2]. Chúng hiện diện chủ yếu trên bề mặt thực vật và có ảnh hưởng tích cực tới sự sinh trưởng và phát triển của thực vật thông qua quá trình tiết các phytohormone (auxin, cytokinin), ACC deaminase (ñiều hòa ethylene), Urease và cố ñịnh nitơ [5], [8], [10], [11], [12]. Methylobacterium có khả năng gia tăng năng suất lúa, mía, hạn chế bệnh hại ở cây ñậu phộng, cam, chanh và kích thích sự phát sinh hình thái của cây thuốc lá, cây hông và cây saintpaulia nuôi cấy in vitro [1], [4]. Trong tự nhiên, vi khuẩn Methylobacterium lan truyền qua ñất, nước, không khí và cả hạt giống cây trồng [2], [3], [9]. Chính vì thế, vi khuẩn Methylobacterium có khả năng phục hồi khả năng nảy mầm của hạt giống sau bảo quản [3]. Trong khuôn khổ bài báo này, chúng tôi ñề cập tới tính ñặc hiệu với các loài thực vật của vi khuẩn Methylobacterium và phương pháp thích hợp cho việc tạo chế phẩm có tác dụng gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt từ vi khuẩn Methylobacterium. 2. THỰC NGHIỆM 2.1Vật liệu - Các chủng vi khuẩn M. oryzea 1021b, M. radiotolerans 1019 và M. fujisawaense 1024; M. thiocyanatum JCM 10863T (MT), M. radiotolerans JCM 2831T (MR), M. fujisawaense JCM 10890T (MJ), Science & Technology Development, Vol 13, No.T3- 2010 Trang 50 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Methylobacterium. extorquens JCM 2802T (ME) từ Bộ môn CNSH Thực vật và chuyển hóa Sinh học – Đại học khoa học Tự nhiên TP HCM [5]. - Hạt giống ñậu ñũa, ñậu xanh, ñậu cove và cà chua của Công ty giống cây trồng Thành phố Hồ Chí Minh, 97 Nghĩa Thục, Phường 5, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2 Phương pháp 2.2.1 Xác ñịnh tính ñặc hiệu của các chủng Methylobacterium sp. lên sự nảy mầm của từng loại hạt giống Dịch khuẩn của các chủng Methylobacterium spp. ñược nuôi cấy lắc 4 ngày trên môi trường CMS (thành phần khoáng môi trường Murashige & Skoog-1962- bổ sung 30 g/l sucrose, 2 g/L cao thịt, 2 g/l peptone from casein), Sinh khối của 50 ml canh trường (mật ñộ tế bào 5,4 1012 tế bào/ml) sau khi ñược rửa sạch với dung dịch nước muối sinh lý ñược trộn với 400 hạt giống, sau ñó ñem gieo vào giá thể ñã ñược khử trùng, ñể ở nhiệt ñộ phòng, theo dõi thường xuyên ñể giữ ñộ ẩm thích hợp cho sự nảy mầm của hạt. Trong quá trình nảy mầm ghi nhận các chỉ tiêu sau: - Tỉ lệ nảy mầm (percentage germination) là tỉ lệ phần trăm số hạt mọc thành cây mầm bình thường, ñược tính theo công thức: Tỉ lệ nảy mầm (%) = m n x 100 với n: số hạt nảy mầm m: tổng số hạt ñem gieo - Sức nảy mầm của hạt ñược ñánh giá theo ñộ ñồng ñều của lô hạt giống, sức nảy mầm cao cho thấy tính chất ñồng ñều của lô hạt giống, khi gieo trồng ñảm bảo quần thể tăng trưởng ñồng ñều, mật ñộ phù hợp, cây giống tăng trưởng mạnh và sức sống cao. Sức nảy mầm ñược xác ñịnh bằng tỉ lệ phần trăm số hạt nảy mầm sau một thời gian nhất ñịnh tùy thuộc vào loại hạt giống. Đối với các loại hạt giống sử dụng trong bài báo này, chúng tôi xác ñịnh sức nảy mầm sau 2 ngày gieo hạt và tỉ lệ nảy mầm sau 4 ngày. 2.2.2 Khảo sát ñiều kiện và chất mang thích hợp ñể bảo quản sinh khối của chủng Methylobacterium ñặc hiệu nhất Thí nghiệm này ñược tiến hành trên chủng 1021b và hạt ñậu xanh. Trong ñó sinh khối ñược xử lý với hạt theo các nghiệm thức như sau: A. Sinh khối từ 50 ml dịch canh trường (mật ñộ 5,4 1012 tế bào/ml), trộn với hạt, sau ñó ñể khô tự nhiên và bảo quản ở nhiệt ñộ phòng với các thời gian 4, 6 tuần. B. Sinh khối ñã ñông khô (với giá thể than bùn hay cát theo tỉ lệ 1:1) của vi khuẩn ñược bảo quản ở nhiệt ñộ -20 hay 4 ñộ C với các thời gian 4 tuần hoặc 6 tuần. Sau ñó trộn với hạt với mật ñộ tương ñương nghiệm thức A. Giá thể và ñiều kiện bảo quản thích hợp ñược ñánh giá thông qua tỉ lệ nảy mầm, sức nảy mầm của hạt giống và mật ñộ tế bào sau bảo quản. Trong ñó, mật ñộ tế bào ñược xác ñịnh bằng phương pháp ñổ ñĩa trên môi trường khoáng MMS [3] bổ sung 1% nguồn carbon chọn lọc là methanol và sinh khối tế bào sau khi ñông khô hay trong hạt giống ñược huyền phù trong nước muối sinh lý với thể tích bằng TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 13, SỐ T3 - 2010 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Trang 51 thể tích canh trường dùng ñể thu sinh khối. Sau ñó, tiếp tục pha loãng thành nhiều nồng ñộ khác nhau và trải lên ñĩa ñể xác ñịnh mật ñộ tế bào. 2.2.3 Xác ñịnh hiệu quả tác dụng của chế phẩm khi kết hợp các chủng ñặc hiệu trên các loại hạt giống Sinh khối các chủng vi khuẩn có hiệu quả cao và thích hợp với từng loại hạt giống ñược trộn với nhau và với các loại hạt giống. Các lô hạt giống này cũng ñược xác ñịnh tỉ lệ nảy mầm và sức nảy mầm sau thời gian bảo quản ñể khảo sát phổ tác dụng và hiệu quả của chế phẩm trên từng loại hạt giống khác nhau. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác ñịnh tính ñặc hiệu của các chủng Methylobacterium sp. lên sự nảy mầm của từng loại hạt giống Hiệu quả tác dụng của các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. khác nhau lên sự nảy mầm của hạt giống ñược ghi nhận trong bảng 1. Kết quả cho thấy, bên cạnh khả năng kích thích sự nảy nầm ở hạt cây mía [9] thì vi khuẩn Methylobacterium spp. còn có hoạt tính trên nhiều loại hạt khác (ñậu ñũa, ñậu xanh, cà chua và lúa [6]). Phân tích về hiệu quả tác ñộng của từng chủng vi khuẩn lên từng loại hạt, có thể thấy ở vi khuẩn Methylobacterium có tính ñặc hiệu chủng. Mỗi chủng tác ñộng mạnh nhất ñối với một loại hạt nhất ñịnh. Tuy nhiên, vẫn có một vài chủng có phổ hoạt tính rộng, ñiển hình là chủng 1021b. Các chủng Methylobacterium không chỉ làm tăng tỉ lệ nảy mầm và sức nảy mầm của hạt mà còn tăng kích thước và chiều cao của cây con. Hiệu quả này ñược giải thích dựa trên hoạt ñộng của các chất ñiều hòa tăng trưởng thực vật (auxin, cytokinin, gibberelin) do chính vi khuẩn Methylobacterium sinh tổng hợp nên [3], [6], [7], [9]. Bên cạnh ñó, cũng có thể do hàm lượng các chất ñiều hòa tăng trưởng thực vật của các chủng sinh tổng hợp không giống nhau [6], [7], [11] là nguyên nhân chính của tính ñặc hiệu chủng và làm giảm khả năng nảy mầm ở một số nghiệm thức (tỉ lệ nảy mầm của hạt ñậu xanh, 74,75 % ñối với chủng MT và 76,00 % ñối với lô ñối chứng) vì mỗi loài thực vật ñáp ứng với một nồng ñộ hormone nhất ñịnh. Tuy nhiên, ñây cũng chỉ là giả thiết và vấn ñề tính ñặc hiệu ñối với mỗi loài thực vật của mỗi chủng Methylobacterium vẫn cần có các nghiên cứu sâu thêm ñể làm sáng tỏ. Bảng 1. Tỉ lệ nảy mầm và sức nảy mầm của các loại hạt thí nghiệm (NC: nghiệm thức ñối chứng) Sức nảy mầm (%) Chủng Hạt NC 1021b MR MT MJ 1019 1024 ME Đậu ñũa 62,68 70,45 62,22 81,34 76,59 58,89 54,44 65,56 Đậu xanh 67,27 84,81 79,93 68,67 79,33 73,40 78,80 77,42 Đậu cove 73,35 80,68 74,73 65,98 66,07 72,07 72,67 73,98 Science & Technology Development, Vol 13, No.T3- 2010 Trang 52 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Cà chua 60,68 78,66 67,33 70,73 60,04 75,26 64,68 67,40 Tỉ lệ nảy mầm (%) Chủng Hạt NC 1021b MR MT MJ 1019 1024 ME Đậu ñũa 71,18 76,79 70,12 81,25 85,56 68,89 62,30 72,58 Đậu xanh 76,00 87,99 85,33 74,75 85,42 80,03 78,80 82,77 Đậu cove 81,37 84,73 79,87 73,93 70,72 76,65 76,69 77,32 Cà chua 66,07 81,93 70,53 76,70 65,20 78,73 67,33 70,67 3.2 Khảo sát ñiều kiện và chất mang thích hợp ñể bảo quản sinh khối của chủng Methylobacterium ñặc hiệu nhất Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Methylobacterium lên tỉ lệ nảy mầm và sức nảy mầm của các loại hạt (bảng 1), chúng tôi nhận thấy chủng 1021b có tác dụng mạnh ñối với nhiều loại hạt, và hạt ñậu xanh là loại hạt có giá thành thấp, dễ xử lý và có phản ứng rõ ràng. Vì thế, chúng tôi chọn chủng 1021b ñể khảo sát loại giá thể và ñiều kiện bảo quản thích hợp cho sinh khối vi khuẩn Methylobacterium (vì vi khuẩn Methylobacterium không sinh bào tử, nên khó bảo quản trong ñiều kiện bình thường) và hiệu quả của các nghiệm thức ñược ñánh giá trên khả năng gia tăng tỉ lệ nảy mầm và sức nảy mầm của hạt ñậu xanh. Để thuận tiện cho việc theo dõi, chúng tôi trình bày kết quả của nghiệm thức ñể khô tự nhiên (bảo quản ở nhiệt ñộ phòng) chung với các nghiệm thức khác: So sánh các kết quả cho thấy (hình 1): chỉ có nghiệm thức ñể khô tự nhiên vẫn có tác dụng gia tăng rõ rệt tỉ lệ nảy mầm và sức nảy mầm của hạt; sinh khối tế bào ñông khô không giá thể cũng còn hoạt tính nhưng không cao hơn nhiều so với nghiệm thức ñối chứng. Đồng thời các kết quả cũng chỉ ra không có sự khác biệt lớn giữa thời gian bảo quản (4 tuần, 6 tuần) và ñiều kiện bảo quản (-20oC, 4oC). Bên cạnh ñó căn cứ vào mật ñộ tế bào trước và sau bảo quản ta có thể giải thích ñược tại sao phương pháp lây nhiễm trực tiếp vi khuẩn trên hạt lại cho kết quả cao nhất vì mật ñộ tế bào vi khuẩn ban ñầu (4,85.1012 tế bào/ml) không cao hơn so với sau khi bảo quản 4 tuần (4,47.1010 tế bào/ml) và 6 tuần (4,68.1010 tế bào/ml). So sánh với tỉ lệ tế bào còn sống của các phương pháp bảo quản khác (bảng 2) cho thấy phương pháp lây nhiễm vi khuẩn vào hạt là một phương pháp ñơn giản, chi phí thấp mà vẫn ñảm bảo hoạt tính cao vì ñây là một phương pháp rất tự nhiên, vi khuẩn Methylobacterium lan truyền qua hạt và chính các ñiều kiện trong hạt giống ñảm bảo cho vi khuẩn tồn tại [3]. Ngoài ra, nhiệt ñộ bảo quản chỉ là nhiệt ñộ phòng còn cho thấy tính khả thi và chi phí thấp trong việc tạo ra chế phẩm có vai trò gia tăng phẩm chất của hạt giống. TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 13, SỐ T3 - 2010 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Trang 53 Hình 1. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ nảy mầm và sức nảy mầm của hạt ñậu xanh trong các ñiều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn khác nhau Bảng 2. Mật ñộ tế bào sau khi bảo quản bằng phương pháp ñông khô (tế bào/ml) Giá thể Điều kiện Trước bảo quản (tế bào/ml) Than bùn (tế bào/ml) Cát (tế bào/ml) Không giá thể (tế bào/ml) 4 tuần. -20oC 3,20.103 2,03.104 4,25.104 4 tuần. 4oC 3,06.103 2,41.104 4,42.104 6 tuần. -20oC 3,17.103 2,27.104 4,33.104 6 tuần. 4oC 4,85.1012 3,31.103 2,16.104 4,16.104 3.4 Kết hợp các chủng ñặc hiệu ñể tạo thành chế phẩm Với mục tiêu tạo ra chế phẩm ñể có thể áp dụng trên nhiều loại cây trồng, chúng tôi khảo sát hoạt tính của hỗn hợp các chủng vi khuẩn Methylobacterium trên các loại hạt giống. Trên cơ sở các kết quản này có thể ñịnh hướng phương án tạo chế phẩm là lây nhiễm từng chủng trên từng loại hạt chuyên biệt hay có thể lây nhiệm một hỗn hợp các chủng vi khuẩn khác nhau cho tất cả các loại hạt. Science & Technology Development, Vol 13, No.T3- 2010 Trang 54 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Hình 2. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ nảy mầm và sức nảy của các loại hạt thí nghiệm khi xử lý hạt với hỗn hợp nhiều chủng vi khuẩn Methylobacterium spp. Kết quả thí nghiệm cho thấy một hiệu quả cộng gộp. Hỗn hợp sinh khối của nhiều chủng có tác dụng gia tăng ñáng kể tỉ lệ nảy mầm và sức nảy mầm của nhiều loại hạt so với tác dụng ñơn chủng (Bảng 1, Hình 2). Như vậy, hỗn hợp các chủng vi khuẩn không những thích hợp cho nhiều loại cây mà còn làm gia tăng hiệu quả nảy mầm, chính sự tương tác giữa các chủng vi khuẩn với hạt giống ñã tạo nên hiệu quả này. 4. KẾT LUẬN Từ các kết quả ñạt ñược, chúng tôi nhận thấy: phương pháp lây nhiễm trực tiếp một hỗn hợp các chủng vi khuẩn Methylobacterium vào các loại hạt giống là một biện pháp giúp gia tăng khả năng nảy mầm của hạt giống. Đây là phương pháp có chi phí thấp, không sử dụng các trang thiết bị chuyên dùng và ñiều kiện bảo quản ñơn giản. Tuy nhiên, vẫn cần phải có các nghiên cứu trên quy mô rộng hơn và nhiều loại hạt giống hơn, ñể chế phẩm này có thể tới tay người tiêu dùng. Bên cạnh ñó, kết quả còn cho thấy các chủng vi khuẩn Methylobacterium: ME, 1019, 1024, MT, MR, MJ, 1021b ñều có tác dụng tích cực lên sự nảy mầm của các loại hạt giống và mỗi chủng ñặc hiệu với một hay một vài loại hạt. Trong ñó, chủng 1021b là chủng có tác dụng tích cực trên nhiều loại hạt nhất và cũng là chủng có hoạt tính mạnh nhất. TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 13, SỐ T3 - 2010 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Trang 55 INCREASE THE RATIO OF SEED GERMINATION BY USING METHYLOBACTERIUM SPP. Kieu Phuong Nam (1), Ho Le Trung Hieu(2), Tran Minh Tuan(1), Do Thi Di Thien(1), Bui Van Le(1) (1) University of Sciences, VNU-HCM; (2) Ho Chi Minh City Open University ABSTRACT: The genus Methylobacterium was reported about the ability to stimulate plant growth by producing phytohormones. In this research, we investigate the effect of several Methylobacterium strain (M.. thiocyanatum JCM 10863T (MT), M.. radiotolerans JCM 2831T (MR), M. fujisawaense JCM 10890T (MJ), M. extorquens JCM 2802T (ME), M. oryzea 1021b, M. radiotolerans 1019 và M. fujisawaense 1024) on the germination of, tomato, green bean, yard long bean and bean pole. The results showed that all strains positively affected seed germination and every strain was specific on one or some kinds of seed. The biomass lyophilizing method or lyophilizing with activated charcoal did not maintain the activity of bacteria while the use of seeds as carrier ensured the effect of those strains. Key words: Methylobacterium, phytohormone, seed germination. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. W. L. Araújo, J. Marcon., W. Jr. Maccheroni, J. D. Van Elsas, J. W. L. Van Vuurde, J. L. Azevedo, Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with Xyllella fastidiosa in citrus plants, Applied and Enviromental Microbiology, 68(10): 4906-4914. (2002). [2]. P. N. Green, The Genus Methylobacterium, 2342-2345. In Balows A., Trüper H. G., Dworkin M., Harder V., Schleifer K. H. (ed.) The Prokaryote, 2nd ed., Springer-Verlag, Berlin. (1992). [3]. M. A. Holland, J. C. Polacco, PPFMs and other covert contaminants: is there more to plant physiology than just plant?, Plant Physiology, 45: 197-209. (1994) [4]. Kiều Phương Nam, Đỗ Thị Di Thiện, Trần Minh Tuấn, Bùi Văn Lệ, Ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 lên sự phát sinh cơ quan ở thực vật. Tạp chí khoa học Lâm Nghiệp, ISSN: 1859-0373, 4: 1071-1076. (2009) [5]. Kiều Phương Nam, Trần Minh Tuấn, Đỗ Thị Di Thiện, Biện Tuấn An, Phan Trung Hậu, Cao Đăng Việt, Bùi Văn Lệ, Định danh các chủng vi khuẩn phân lập ñược ở vùng Đông Nam Bộ bằng kỹ thuật rDNA 16S và xác ñịnh quan hệ di truyền của chúng trong chi Methylobacterium. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, ISSN 0866-7020, 3: 44-49. (2010a) [6]. Kiều Phương Nam, Trần Minh Tuấn, Đỗ Thị Di Thiện, Lê Thị Thùy Dương, Trần Thị Trinh, Phạm Vũ Việt Dũng, Bùi Văn Science & Technology Development, Vol 13, No.T3- 2010 Trang 56 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Lệ, Sinh tổng hợp giberelin (gibberellin) ở vi khuẩn Methylobacterium spp.. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, ISSN 0866-7020, 5: 51-54. (2010b) [7]. M. E. Lidstrom, L. Chistoserdova, Plants in the pink: cytokinin production by Methylobacterium, Journal of bacteriology 184(7): 1818. (2002) [8]. M. Madhaiyan, S. Poonguzhali, M. Senthilkumar, S. Seshdri, H. Chung, J. Yang, S. Sundaram., Growth promotion and induction of systemic resistance in rice cultivar Co-47 (Oryza sativa L.) by Methylobacterium spp., Bot. Bull. Acad. Sin., 45: 315-324. (2004). [9]. M. Madhaiyan, S. Poongguzhali, H. S. Lee, K. Hari, S. P. Sundaram, T. M. Sa., Pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria accelerate germination, growth and yield of sugarcane clone Co86032 (Saccharum officinarum L.), Biology and fertility of soils, 41(5): 350-358. (2005) [10]. M. Madhaiyan, S. Poonguzhali, S.P. Sundaram, Sa. Tongmin, A new insight into foliar applied methanol influencing phylloplane methylotrophic dynamics and growth promotion of cotton (Gossypium hirsutum L.) and sugarcane (Saccharum officinarum L.), Environmental and Experimental Botany, 57(1-2): 168- 176. (2006). [11]. Z. S. Omer, R. Tombolini, A. Broberg, B. Gerhardson, Indole-3-acetic acid production by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria, Plant Growth Regulation 43: 93-96. (2004). [12]. A. Sy, E. Giraud, P. Jourand, N. Garcia, A. Willems, P. De Lajudie, Y. Prin, M. Neyra, M. Gillis, C. Boivin-Masson, B. Dreyfus, Methylotrophic Methylobacterium bacteria nodulate and fix nitrogen in symbiosis with legumes, Journal of Bacteriology, 183(1): 214–220. (2001). TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 13, SỐ T3 - 2010 Bản quyền thuộc ĐHQG-HCM Trang 57 Hình 3. Hạt ñậu xanh nảy mầm sau 4 ngày gieo hạt A: Hạt ñược xử lý với hỗn hợp các chủng vi khuẩn Methylobacterium B: Nghiệm thức ñối chứng, hạt ñược xử lý với nước cất.