Đề tài Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái của một số chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ______***______ KIỀU NGỌC BÍCH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. PHƢƠNG PHÚ CÔNG HÀ NỘI, 2012 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phương Phú Công đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn để em hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Khắc Thanh - trưởng phòng Vi Sinh Vật trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2, PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung và tập thể cán bộ phòng Vi Sinh Vật trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em học tập và rèn luyện trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp đại học. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2 đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập để em có được kết quả như ngày hôm nay. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó ! Hà Nội, tháng 05 năm 2012 Sinh Viên Kiều Ngọc Bích LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng mình. Các số liệu, các kết quả thu được trong khóa luận là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, tháng 05 năm 2012 Sinh Viên Kiều Ngọc Bích DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các dạng Hyphomycetes Hình 1.2. Giá sinh bào tử Coelomycetes Hình 1.3. Cấu tạo một Coelomycetes Hình 1.4. Các kiểu phát sinh bào tử trần Hình 1.5. Các kiểu phát triển của bào tử trần Hình 1.6. Các dạng phát triển của tế bào sinh bào tử trần Hình 1.7. Cuống sinh bào tử trần Hình 1.8. Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt Hình 1.9. Một số hình dạng bào tử trần Hình 1.10. Các hình dạng khác nhau của bào tử Hình 1.11 Chi Penicillium Link ex Fries. Các thành phần của chổi (bộ máy mang bào tử trần). Hình 1.12. Cấu tạo cơ quan sinh bào tử trần ở Aspergillus Hình 1.13. Cấu tạo khuẩn ti và cơ quan sinh bào tử trần của Penicillium Hình 1. 14. Cấu trúc không gian của cellulose Hình 1.15. Cấu trúc không gian của CMC Hình3.1. Hoạt tính cellulase của 3 chủng mạnh nhất Hình 3.2. Một số đặc điểm hình thái của chủng M 4V Hình 3.3 .Một số đặc điểm hình thái của chủng M 151 Hình 3.4 .Một số đặc điểm hình thái của chủng M 251 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả và đặc điểm các chủng nấm mốc phân lập được Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính 25 chúng nấm mốc phân lập được CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT CBH : Cellobiohydrolase CMC : Cacboxyl methyl cellulose CMC –ase : cacboxylmethylcellulase CS : Cộng sự E1 : Exoglucanase E2 : Endoglucanase UV : Tia cực tím A.glaucus : Aspergillus glaucus A.restricus : Aspergillus restricus A.cervinus : Aspergillus cervinus A.ornatus : Aspergillus ornatus A.nidulans : Aspergillus nidulans A.versicolor : Aspergillus versicolor Austus : Aspergillus ustus A.flavipes : Aspergillus flavipes A.wentii : Aspergillus wentii A.flavus : Aspergillus flavus A.niger : Aspergillus niger A.ocharaceus : Aspergillus ocharaceus A. sparsus : Aspergillus sparsus A. cremeus : Aspergillus cremeus A. candidus : Aspergillus candidus H1 : Hình 1 VSV : Vi sinh vật MỤC LỤC MỞ ĐẦU...............................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài..............................................................................................1 2. Mục đích của đề tài..........................................................................................2 3. Nội dung của đề tài..........................................................................................3 4. Ý nghĩa khoa học của đề tài.............................................................................3 5. Điểm mới của đề tài.........................................................................................3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về nấm mốc................................................................................4 1.1.1. Nấm bất toàn (Deuteromycetes).......................................................4 1.1.1.1. Hyphomycetes....................................................................................5 1.1.1.2. Coelomycetes.....................................................................................5 1.1.1.3. Agonomycetes....................................................................................7 1.1.2. Các kiểu phát triển bào tử trần trong sự phát sinh bào tử dạng nảy chồi.........................................................................................................8 1.1.3. Sự phát triển của các tế bào sinh bào tử trần............................................8 1.1.4. Cuống sinh bào tử trần.............................................................................9 1.1.5. Bào tử trần..............................................................................................10 1.2. Chi Aspergillus Micheli ex Fries...........................................................11 1.2.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới......................11 1.2.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus........................................................15 1.3. Sơ lược về Penicillium...........................................................................17 1.4. Cellulose va cellulase.............................................................................19 1.4.1. Celulose..................................................................................................19 1.4.2. Cellulase.................................................................................................21 1.4.3. Ứng dụng của cellulase 1.4.3.1. Ứng dụng enzyme cellulase trong chế biến thực phẩm...................22 1.4.3.2. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh..........23 1.5. Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose...................................................24 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu.....................................................................................26 2.1.1. Mẫu phân lập..........................................................................................26 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng cho nghiên cứu...............................26 2.2. Môi trường....................................................................................................27 2.3. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................27 2.3.1. Phương pháp phân lập............................................................................27 2.3.1.1. Thu thập mẫu..................................................................................27 2.3.1.2. Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản....................................27 2.3.1.3. Tiến hành phân lập..........................................................................28 2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính.....................................................................30 2.3.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp cấy chấm điểm....................................................................................................30 2.3.2.2. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch ( William, 1983)......................................................................30 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu định loại (Maren A. Klich, 2002)..................31 2.3.3.1. Phương pháp cấy chấm điểm các chủng nấm mốc lên môi trường Crapek- Dox cơ sở để nghiên cứu các đặc điểm vĩ mô................................31 2.3.3.2. Phương pháp cấy trên khối thạch để quan sát các đặc điểm vi mô (Robert A. Samson and Ellen S. Hoekstra, Jens C. Frisvad and Filtenborg, 1996)............................................................................................................31 2.3.4. Phương pháp quan sát các đặc điểm phân loại...........................................32 2.3.4.1. Quan sát các đặc điểm vĩ mô sau đây bằng mắt thường hoặc dưới kính hiển vi soi nổi.......................................................................................32 2.3.4.2. Quan sát các đặc điểm vi mô dưới kính hiển vi quang học và chụp ảnh qua kính hiển vi ( Axioskop).................................................................33 CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1.1. Kết quả phân lập........................................................................................34 1.2. Kết quả thử hoạt tính..................................................................................35 1.3. Kết quả định loại sơ bộ..............................................................................37 1.3.1. Bản mô tả chủng M4V...........................................................................37 1.3.2. Bản mô tả chủng M151..........................................................................40 1.3.3. Bản mô tả chủng M251..........................................................................43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................46 TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................47 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ trước đến nay, chăn nuôi luôn có vai trò quan trọng đối với nền nông nghiệp nước ta, giá trị chăn nuôi chiếm tỷ trọng khá, trên 27% cơ cấu của toàn ngành và tăng trưởng mỗi năm (giai đoạn 2001 - 2009) đạt 7-8%. Trong chăn nuôi việc tìm giải pháp nào để tăng năng suất vật nuôi, nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức ăn ở mức cao nhất và đặc biệt là không có hại đến sức khỏe con người là vấn đề đang cần được quan tâm. Một trong những giải pháp được đưa ra là có thể sử dụng các chế phẩm enzyme ( gồm nhiều loại enzyme, trong đó có cellulase) [2]. Nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là ngũ cốc và phụ phẩm của ngũ cốc. Ngoài protein, lipit, chất dinh dưỡng cung cấp năng lượng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate. Trong đó, các polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside. Các chất này làm tăng độ nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột hấp thụ các chất dinh dưỡng. Các chất này có trong vách tế bào thực vật, ngăn trở các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dưỡng như protein, tinh bột và lipit có trong bào chất, từ đó cản trở sự tiêu hóa, hấp thụ các chất dinh dưỡng này. Bổ sung cellulase, β-glucanase trực tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật.[3], [7]. Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu cellulose như rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang được triển khai ở nhiều nước, trong mọi lĩnh vực như sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc. Trong lĩnh vực này, nấm sợi thường được sử dụng lên men các nguồn 2 phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lượng các amino axit cân đối, các vitamin và tạo hương thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi [7]. Hàng năm, hoạt động trong ngành chăn nuôi đã thải ra môi trường hàng trăm ngàn tấn phế phẩm có thành phần chủ yếu là cellulose, hiện đã và đang là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường. Nếu không có biện pháp xử lý thì đây sẽ là nguồn gây ô nhiễm môi trường. Một số vi sinh vật có khả năng sinh cellulase như vi khuẩn, nấm mốc. Cellulase từ vi khuẩn trong nhiều trường hợp được nghiên cứu có hoạt tính cao hơn cellulase từ nấm mốc. Tuy nhiên, nhìn chung vi khuẩn sản xuất enzym ngoại bào số lượng thấp hơn nấm mốc. Nấm mốc là vi sinh vật hiếu khí, nhân chuẩn dị dưỡng, chúng thường có mặt trong đất, xác động thực vật và không khí. Một số loài nấm mốc có khả năng tổng hợp ra các enzyme, axit hữu cơ, vitamin, các kích thích tố tăng trưởng động thực vật như: Aspergillus niger, Aspergillus hennebergii [4], [6], với khả năng chống chịu pH và khả năng sử dụng nguồn cacbon, nguồn nitơ tốt. Do đó tôi chọn đề tài “ Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái của một số chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao” để nghiên cứu. 2. Mục đích của đề tài 2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase. 2.2. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của một số chủng nấm mốc phân lập được. 2.3. Bước đầu phân loại sơ bộ một số chủng có hoạt tính cellulase cao nhất. 3 3. Nội dung của đề tài Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp ở miền Bắc Việt Nam ( Mỹ Đức- Hà Nội, Tam Dương – Vĩnh Phúc ) Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase Định loại chủng mốc có khả năng sinh cellulase cao, nhằm chọn những chủng nấm mốc thuộc danh mục an toàn (thường dùng trong công nghệ sinh học). 4. Ý nghĩa của đề tài 4.1. Tìm hiểu sự đa dạng của các chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp ở miền Bắc Việt Nam. 4.2. Nâng cao khả năng nghiên cứu các đặc điểm phân loại của một số chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase ở Việt Nam. 4.3. Tìm ra những chủng nấm mốc thuộc danh mục an toàn sinh học có khả năng sinh cellulase cao nhằm ứng dụng có các nghiên cứu tiếp theo. 5. Điểm mới của đề tài Trong các chủng nấm mốc phân lập được, dựa theo phương pháp phân loại truyền thống, tôi xác định được chủng M 251 thuộc loài Aspergilus niger, đây là loài thuộc danh mục an toàn sinh học, có tiềm năng ứng dụng cao trong sản xuất enzyme bổ sung vào thức ăn vật nuôi. 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cƣơng về nấm mốc Phần lớn nấm mốc thuộc nhóm phân loại Deuteromycetes, một số là dạng sinh sản vô tính của các nhóm nấm túi (Ascomycetes) hoặc nhóm nấm đảm (Basidiomycetes). Deuteromycetes bao gồm khoảng 2400 chi trong đó có 1700 chi thuộc nhóm nấm Hyphomycetes và 700 chi thuộc nhóm Ceolomycetes. Theo E.Kiffer, M. Morelet, 2000, trong số các chi nấm thuộc tổ chi Phialoconidiae ( lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycetes) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài, tiếp theo là chi Aspergillus có khoảng 185 loài [16]. 1.1.1. Nấm bất toàn (Deuteromycetes) Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính của nấm túi hoặc nấm đảm. Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes (1953). Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm: Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá). Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào tử trần ở trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata. Nhóm Agonomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần. Ở đây chúng tôi giới thiệu 2 khoá phân loại đến chi của lớp nấm bất toàn. 5 Phân lớp của nấm bất toàn 1.1.1.1. Hyphomycetes (moniliaales- nấm bông, 1700 chi, 11000 loài) Các dạng hệ sợi nấm mang các bào tử trên sợi riêng rẽ hoặc trên cụm sợi nấm (như các đệm nấm, các bó giá), nhưng không ở trong các conidiomata (fruit body) riêng biệt. Hình 1.1. Các dạng Hyphomycetes 1.1.1.2. Coelomycetes (nấm xoang, 700 chi, 9000 spp) riêng rẽ Bào tử trần sinh ra trong các túi giá, đĩa giá, túi giá dạng cốc hoặc đệm giá. Hình 1.2. Giá sinh bào tử Coelomycetes 6 Hình 1.3. Cấu tạo một Coelomycetes 1. Bào tử trần, 2. Tế bào sinh bào tử trần, 3. Cuống sinh bào tử trần, 4. Sợi nấm Những bộ phận sinh sản vô tính Hypha (sợi nấm): Một trong các sợi trong hệ nấm là các tản của một sợi nấm. Các tản khác biệt với các phần sợi sinh dưỡng hấp phụ chất dinh dưỡng Bào tử trần: Một tế bào bất kỳ mà từ đó một bào tử được sinh ra trực tiếp. Các kiểu phát sinh bào tử trần: Tản (a ), nảy mầm ( b). Hình 1.4. Các kiểu phát sinh bào tử trần 7 1.1.1.3. Agonomycetes( mycelia sterilia - nấm bất thụ) Agonomycetes không có khả năng sinh sản bằng bào tử. Một số tạo thành cấu trúc gọi là sclerotina, các bào tử áo (chlamydospore ) hoặc các tế bào dày ( tế bào Hulle). Nói chung đây là nhóm không có các đặc điểm đặc trưng để phân loại ( Erick H.C.Mckenzie, 2004; Michael J.Carlie, Sarah C Watkinson, Graham, 1994) [18], [19]. Năm 1995, Hughes đã đưa ra khóa phân loại có tính liên kết và tổng quát hơn về nhóm Hyphomycetes. Ông chia nhóm này thành 8 tổ chi dựa vào đặc điểm của giá bào tử trần ( conidiophores) và bào tử trần ( conidia). Năm 1968, Baron lại đưa ra một khóa phân loại khác hoàn chỉnh hơn mà ngày này nhiều nhà nấm học vẫn sử dụng (H.L.Barneet & Barry B. Hunter, 1973), trong đó các đặc điểm của conidia, các kiểu tạo thành conidia từ các tế bào sinh ra nó, sự tiến hóa của các tế bào conidia và các tế bào sinh ra nó... là những đặc điểm quan trọng để phân loại ( Erick H.C. Mckenzie, 2004; E. Kifer & N Morelet, Robert K. Noyd, 2000) [18], [16], [21]. Gần đây, trong các khóa phân loại của mình E. Kifer & N. Morelet, Robert K. Noyd ( 2000) [16], [21] đã kết hợp khóa phân loại của Saccardo ( 1880 – 1884) và Grove ( 1919) để phân chia Deuteromycota thành 2 lớp lớn là Hyphomycetes và Coelomycetes dựa vào cách sắp xếp của các giá bào tử trần. Lớp Hyphomycetes: đặc trưng bởi các giá bào tử trần ( condiophores) tạo ra trên sợi nấm, không tạo thể quả vô tính. Lớp Coelomycetes: các giá bào tử trần ( conidiophores) được sinh ra trong các thể quả vô tính (axesual ascomata). 8 1.1.2. Các kiểu phát triển bào tử trần trong sự phát sinh bào tử dạng nảy chồi (blastic) (Theo Katsuhiko Ando, 2002) [15]. Sự phát sinh bào tử phân cắt hoàn toàn: Kiểu bào tử đính (Aleurio - type), một điểm trên tế bào sinh bào tử trần, bào tử đơn độc (H.1.5a ). Kiểu nảy chồi (Blasto - type): Cấu trúc màng đỉnh ở vị trí trên tế bào sinh bào tử trần và chuỗi bào tử với một vị trí để tạo thành mộ chuỗi liên tiếp không phân nhánh (chuỗi gốc già) ( H.1.5b ). Hình 1.5. Các kiểu phát triển của bào tử trần Phát sinh bào tử nội sinh: Dạng bình (Phialo - type), Các chuỗi bào tử ra khỏi tế bào sinh bào tử trần ở cùng một vị trí, đôi khi trong các chuỗi rời tế bào có thay đổi ( H.1.5c). Dạng phân đốt (Annello - type), Các chuỗi bào tử ra khỏi tế bào sinh bào tử trần ở các vị trí cao hơn, thỉnh thoảng trong các chuỗi rời, tế bào có thay đổi (H.1.5d ). 1.1.3. Sự phát triển của các tế bào sinh bào tử trần Tế bào sinh bào tử trần phát triển theo nhiều kiểu: Kiểu ổn định, kích thước của tế bào sinh bào tử trần là ổn định (H1.6a) . Kiểu kéo dài, tế bào sinh bào tử trần phát triển cùng với sự sản sinh các bào tử trần (H1.6b) . Kiểu giảm 9 dần, độ dài các tế bào sinh bào tử trần giảm đi khi mỗi bào tử trần được sinh ra (H1.6c). Hình 1.6. Các dạng phát triển của tế bào sinh bào tử trần 1.1.4. Cuống sinh bào tử trần Một sợi nấm phân nhánh hoặc đơn giản (một sợi nấm sinh sản) mang hoặc gồm có các tế bào sinh bào tử trần mà từ đó các bào tử trần được sinh ra. Đôi khi được dùng khi mô tả những cấu trúc biến đổi đối với các tế bào sinh bào tử trần. Hình 1.7. Cuống sinh bào tử trần 10 Có nhiều dạng: dạng có hoặc không có vách ngăn đơn giản không phân nhánh ( H1.8c), dạng cuống sinh bào tử trần kéo dài cùng với việc sinh bào tử trần (H1.8d ), dạng cuống có vách ngăn, phát triể