Đề tài Tách chiết ADN

TÁCH CHIẾT ADN Tách chiết AND tổng số GS.TS Nguyễn Quang Thạch Viện Sinh hoc Nông nghiệp 1.Nguyên tắc và yêu cầu Tách chiết ADN là cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ gen đều tiến hành với ADN (hay ARN) ADN tách chiết được cần đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo trong công nghệ gen thực vật. * Có rất nhiều phương pháp tách chiết AND, tuỳ thuộc mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp tách ADN cho phù hợp 2.Các bước chính trong tách chiết ADN Phá vỡ vật liệu ban đầu (tế bào, mô) để mở tế bào và giải phóng axit nucleic (ADN và ARN) (nghiền trong ni tơ lỏng và hòa trong đệm chiết) Bổ sung các chất chống các chất hoạt hoá enzyme ADNase và làm biến tính các phân tử protein, dịch hữu cơ.v.v. Tách ADN khỏi các tạp chất khác (bằng máy ly tâm). Kết tủa , rửa và hòa tan ADN (rửa bằng dung dịch cồn, hòa tan trong TE hoặc nước cất) Một số hoá chất thông dụng dùng trong tách chiết axít nucleic Ni tơ lỏng: Thông thường để phá màng/vỏ tế bào chúng ta phải dùng nitơ lỏng, vì nitơ lỏng có 2 tác dụng chính đó là: + Làm cho màng bị cứng giòn, dễ bị vỡ khi nghiền + Và ni tơ lỏng giữ cho mẫu ở trạng thái lạnh, trạng thái mà các enzym phá huỷ axít nucleic không hoạt động cho tới khi chúng bị ức chế bằng hoá chất. Một số qui trình sử dụng vật liệu đông khô, bởi vật liệu đông khô dễ phá vỡ màng hơn, mặt khác sử dụng vật liệu đông khô không cần giữ mẫu ở trạng thái lạnh, vì trong môi trường khô tuyệt đối các ezim phá huỷ axít nucleic cũng vô tác dụng. - EDTA: Khi màng bị phá vỡ, một loạt các chất đựơc giải phóng ra dung dịch, trong số chúng có các loại emzim thuỷ phân axít nucleic thành những mảnh vụn, bởi vậy cần phải ức chế sự hoạt động của enzym này bằng EDTA. Các ion hoá trị hai như: Mg2+ và Ca2+.v.v. rất cần thiết cho sự hoạt động của enzym thuỷ phân axít nucleic. Nếu trong dung dịch có EDTA, chất này sẽ liên kết với các ion hoá trị hai nói trên, liên kết này dẫn tới sự ức chế hoạt động của enzym thuỷ phân axít nucleic, do vậy mà axít nucleic sẽ không bị phân huỷ. Tris: Axít nucleic còn bị ảnh hưởng rất lớn bởi độ axít và kiềm của dung dịch sử dụng trong tách chiết, axít có thể làm cho axít nucleic bị gãy, chẳng hạn axít clohydric (HCl) làm cho ADN bị đứt ở những vị trí purin, trong khi đó nếu ở nồng độ kiềm cao thì ADN sẽ bị tách thành sợi đơn. Để loại trừ ảnh hưởng của axít và kiềm người ta đã sử dụng Tris để điều chỉnh pH của dung dịch. CTAB (Cetryl Ammonium Bromide): Là hoá chất dùng trong chiết suất axít nucleic có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến hiện nay. CTAB dung dịch là một dung môi có khả năng hoà tan cao axít nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết axít nucleic. Để tăng hiệu quả hoạt động của CTAB, mẫu đựơc xử lý với nhiệt khoảng từ 55OC đến 65OC. Ở nhiệt độ như vậy, nó còn có tác dụng làm rách thêm màng tế bào và màng nhân để giải phóng tối đa lượng axít nucleic ra dung dịch và làm biến tính một số protein, đặc biệt là enzym thuỷ phân axít nucleic. Chloroform: Trong dung dịch tách chiết, ADN tạo thành liên kết với CTAB, để loại bỏ CTAB và đồng thời làm biến tính protein trong dung dịch cần sử dụng chloroform. Sau đó dung dịch tách chiết được ly tâm, loại bỏ các tạp chất (bị kéo xuống phần phía dưới ống nghiệm) còn lại axít nucleic hoà tan trong lớp dung dịch nằm phía trên và được chuyển sang một ống nghiệm mới. Ethanol hoặc isopropanol: Ethanol thường được dùng trong môi trường dung dịch có lực ion, hay nồng độ muối cao, trong điều kiện như vậy axít nucleic dễ dàng bị kết tủa, sự kết tủa của axít nucleic sẽ đạt hiệu quả cao hơn nếu như được xử lý trong môi trường lạnh. Isopropanol được dùng để kết tủa axít nucleic trong môi trường không cần có muối, tỷ lệ lượng isopropanol/mẫu theo thể tich là: 1/1. Sử dụng isopropanol có ưu việt là các axít nucleic có trọng lượng phân tử thấp như: những mảnh gãy ADN hoặc ARN.v.v. sẽ không bị kết tủa và chúng dễ dàng bị loại bỏ cùng dung dịch. Enzym RNnase và enzym Dnase: Khi kết tủa sẽ thu được axít nucleic gồm: ADN và ARN: Nếu mục tiêu là thu ADN, chúng cần phải loại bỏ ARN. Để loại bỏ ARN, ta dùng enzym RNase. Enzym RNase sẽ cắt ARN thành những mảnh vụn, do vậy sau khi ly tâm ADN lắng tủa và được giữ ở đáy ống nghiệm, còn những mảnh vụn ARN vẫn nằm trong dung dịch, bởi vậy khi loại bỏ dung dịch thì ARN cũng bị loại bỏ theo. Ngược lại nếu cần loại bỏ ADN, chúng ta dùng enzym DNase, cũng tương tự như việc loại bỏ ARN, ADN sẽ bị cắt vụn bởi DNase và chúng cũng bị loại bỏ cùng dung dịch - Nước cất và TE: Axít nucleic có thể đựơc hoà tan trong nước cất khử trùng hoặc dung dịch TE. Axít nucleic sẽ được bảo quản tốt hơn, nếu nó được hoà tan trong dung dịch TE, vì dung dịch này chứa Tris và EDTA. 3. Quy trình tách chiết ADN sử dụng CTAB Nghiền mẫu trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn Xử lý mẫu trong dung dịch CTAB (có bổ sung các chất khác) ở 65 0C để tiếp tục phá vỡ màng sinh chất, màng nhân để giải phóng ADN và các chất khác. Ly tâm lạnh, thu lấy dịch nổi và xử lý dịch này với chlorofomr/isoamyl alcohol để biến tính protein Tiếp tục ly tâm lạnh, thu lấy dịch nổi và xử lý dịch thu được với ARNaza để có ADN tinh khiết Tách ADN khỏi dung dịch bằng cách kết tủa ADN nhờ isopropanol. Rửa lại ADN bằng dung dịch cồn /axetat natri và làm khô. Hoà tan ADN trong nước hoặc dung dịch TE (Tris/HCl và EDTA), bảo quản ở 40C để sử dụng hoặc lâu dài ở (-200C đến -80 0C) 4. Xác định độ nguyên vẹn, độ tinh sạch và nồng độ ADN 1. Xác định độ nguyên vẹn Trong qui trình tách chiết, đã sử dụng các tác nhân lý, hoá học; vì thế mà ít nhiều ảnh hưởng đến độ nguyên vẹn của axít nucleic. Bởi vậy chúng ta phải kiểm tra mức độ nguyên vẹn của chúng. Để kiểm tra độ nguyên vẹn của ADN, mẫu được điện di trong gel agarose (0,8%), sau đó nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide và soi qua tia cực tím để phát hiện các băng ADN. Mẫu được xem là có độ nguyên vẹn cao khi các băng ADN gọn, tập trung và rõ nét. Qua kiểm tra độ nguyên vẹn của ADN cũng xác định được ADN còn lẫn ẢN hay không 2. Xác định độ tinh sạch của axít nucleic Để xác định độ tinh sạch của ADN, tiến hành tính chỉ số OD của ADN ở bước sóng 260nm và 280nm, sau đó tính tỷ số giữa hai chỉ số OD đó. ADN được coi là tinh sạch nếu tỷ số OD260/OD280 trong phạm vi từ 1,8 đến 2, nếu tỷ số này nhỏ hơn 1,8 thì mẫu ADN còn lẫn protein và những chất khác như phenol, nếu tỷ số > 2 mẫu có thể vẫn còn lẫn ARN. Đối với ARN, nếu tỷ số OD260/OD280 sấp xỉ bằng 2 thì mẫu ARN tách được coi là tinh sạch. 3. Xác định nồng độ axít nucleic Nồng độ axít nucleic có thể được xác định bằng hai cách: - Cách thứ nhất: điện di axít nucleic trong gel agarose cùng với những mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ. Sau đó nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide, soi qua tia cực tím và chụp ảnh. So sánh mẫu axít nucleic tách chiết với những mẫu chuẩn đã biết nồng độ, từ đó suy ra nồng độ của axít nucleic tách chiết được. Cách này không đạt độ chính xác cao mà chỉ ước lượng ở mức độ tương đối. - Cách thứ hai: đo chỉ số OD của axít nucleic bằng máy quang phổ ở bước sóng 260 nm. Một đơn vị OD ở bước sóng 260nm của ADN sợi đôi có nồng độ sấp xỉ 50mg/ml. ADN sợi đơn, ARN và các oligonucleotide có nồng độ tương ứng là 33mg/ml, 40mg/ml và 30mg/ml.