Đề tài Tạo dòng gen

Tạo dòng gen Tạo dòng một gen là công việc trung tâm của công nghệ DNA tái tổ hợp. Gen là đơn vị cơ sở của thông tin di truyền nằm trên nhiễm sắc thể của tế bào. Mỗi gen ghi rõ cấu trúc của một sản phẩm gen đặc biệt, thường là một protein. Các trình tự DNA Để thao tác gen, cần phải biết về tất cả các tổ chức của các trình tự DNA và các đơn vị chức năng của DNA tương tác với các các đơn vị khác trong tất cả các đơn vị di truyền của cơ thể (genome) là như thế nào. Việc phát hiện ra các enzyme hạn chế (restriction endonucleases, RE) của vi khuẩn cắt DNA ở những trình tự đặc trưng, đã giúp cho việc thao tác dễ dàng hơn, vì nó có thể giảm chiều dài của các phân tử DNA thành một tập hợp bao gồm các đoạn ngắn hơn. Các enzyme hạn chế hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế bào. DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của enzyme hạn chế, nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không thể bị nhận biết bởi các enzyme hạn chế. Mỗi enzyme hạn chế nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc biệt thường chứa bốn hoặc sáu cặp nucleotide. Ví dụ enzyme EcoRI chiết từ E. coli cắt trình tự GAATTC, enzyme BalI của Brevibacterium albidum cắt trình tự TGGCCA. Có hơn 500 enzyme hạn chế khác nhau được tinh sạch từ khoảng 250 vi sinh vật khác nhau. Các enzyme hạn chế cắt gãy các phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác nhau: - Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng. - Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng để tạo ra những phân tử đầu so le (đầu kết dính). Vì một enzyme hạn chế nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ. Các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di agarose gel để nghiên cứu. Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả các cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú tương hợp nhau về cấu trúc. Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác. Sự tương tự này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA mạch vòng đóng sợi đôi được dùng làm vector mang các đoạn DNA ngoại lai dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Sự kết hợp của các phân tử DNA Các phương thức cơ bản của công nghệ DNA tái tổ hợp là: (1) Kết hợp một đoạn DNA vào một phân tử DNA (như là vector) có thể tái bản (2) Cung cấp một môi trường cho phép sao chép phân tử DNA đã được kết hợp. Có ba loại vector phổ biến được dùng để tạo dòng các đoạn DNA ngoại lai và tái bản (sao chép) trong E. coli. Đó là plasmid, bacteriophage λ và cosmid. Tất cả những vector này phải có một số tính chất cần thiết sau: - Có khả năng tự tái bản trong E. coli. - Chứa các gen chỉ thị chọn lọc để dễ dàng phân biệt và tinh sạch vector của thể tái tổ hợp với các dạng khác. - Có các vùng DNA không cần thiết cho sự sinh sản trong vi khuẩn, vì thế DNA ngoại lai có thể được đưa vào trong các vùng này. - Có thể biến nạp vào tế bào vật chủ một cách dễ dàng. DNA plasmid có thể được phân lập từ nuôi cấy vi khuẩn chứa plasmid bằng cách bổ sung chất tẩy (như là sodium dodecyl sulfate6) và bằng cách ly tâm sự sinh tan (lysate). Phức hợp nhiễm sắc thể vi khuẩn, lớn hơn plasmid nhiều, sẽ lắng xuống đáy của tube ly tâm, plasmid siêu xoắn và các đoạn nhiễm sắc thể mạch thẳng giữ lại trong thể nổi. Plasmid siêu xoắn một lần nữa được phân tách bằng ly tâm sau khi xử lý với CsCl và EtBr. Plasmid chứa các gen mã hóa cho các enzyme thường có lợi cho vi khuẩn vật chủ. Các plasmid mang các kiểu hình khác nhau như: kháng kháng sinh, sản xuất kháng sinh, phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp, sản xuất các enzyme hạn chế và enzyme biến đổi (modification enzymes). Các plasmid có thể được chuyển vào trong vi khuẩn sau khi vi khuẩn được xử lý sao cho tế bào có thể thấm qua nhất thời các phân tử DNA nhỏ. Quá trình này được biết như là sự biến nạp (transformation). Vi khuẩn được biến nạp thành công có thể được chọn lọc dựa trên kiểu hình mới mà chúng nhận được từ plasmid, chẳng hạn khả năng kháng các kháng sinh. Một số plasmid hiện diện trong tế bào có số bản sao thấp (một hoặc một vài bản sao trên tế bào) do DNA plasmid chỉ sao chép một hoặc hai lần trước khi tế bào phân chia. Tuy nhiên, các plasmid khác tồn tại một số bản sao lớn hơn (10 tới 100 bản sao trên một tế bào) do DNA tái bản lặp lại cho đến khi đạt được số bản sao thích hợp. Các plasmid có số bản sao lớn được gọi là plasmid tái bản dạng lỏng lẽo (relaxed plasmid), và đây là một trong những tính chất hữu ích của vector tạo dòng. Plasmid vector pBR 322. Ampr và Tetr: gen kháng ampicillin và tetracycline, ori: trình tự khởi đầu sao chép, và một số vị trí nhận biết cho các RE. Hình trên trình bày một trong các vector plasmid dạng lỏng lẽo, pBR322 (thế hệ thứ hai), dài 4.363 bp, vector này chứa hai gen kháng kháng sinh là Ampicillin (Amp) và Tetracycline (Tet). Số thứ tự của các nucleotide trên vector được bắt đầu với vị trí EcoRI duy nhất: T đầu tiên trong chuỗi GAATTC được quy ước là nucleotide thứ nhất. Các số thứ tự sau đó được tiếp tục quanh phân tử vector theo hướng từ gen kháng Tet tới gen kháng Amp. Plasmid có thể được cắt ở một số thứ tự nào đó trong các vị trí xác định bằng enzyme hạn chế. Vì thế, các đoạn được tạo ra có thể tạo vòng bằng cách kết hợp các đầu kết dính bổ trợ. Hơn nữa, các đoạn được tạo ra bởi một enzyme đặc biệt hoạt động trên một phân tử DNA sẽ có cùng đầu kết dính với đoạn được tạo ra bởi cùng một enzyme hoạt động trên một phân tử DNA khác. Vì thế, các đoạn từ hai phân tử DNA khác nhau từ hai cơ thể khác nhau có thể kết hợp bằng các liên kết hydrogen thuận nghịch khi các đoạn này được trộn lại. Nếu sự kết hợp được gắn lại sau khi bắt cặp, thì các đoạn được kết hợp cố định bền vững, sự kết hợp của các đoạn này được thực hiện nhờ enzyme ligase (còn gọi là polynucleotide ligase) liên kết đồng hóa trị các phân tử tái tổ hợp bằng cách tạo ra liên kết phosphodiester giữa đầu 5’-PO4 của một polynucleotide với đầu 3’-OH của polynucleotide khác. Phương thức sản xuất DNA tái tổ hợp (tạo dòng gen) Plasmid được cắt ở các vị trí xác định bằng enzyme hạn chế. DNA của một genome ngoại lai được cắt cùng một loại enzyme, một số đoạn trong đó có thể có gen quan tâm. Plasmid và các đoạn của genome được phối trộn và kết hợp nhờ enzyme ligase. Các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn bằng đồng nuôi cấy plasmid và vi khuẩn.