Di truyền học vi khuẩn và virus

DI TRUYỀN HỌC VI KHUẨN VÀ VIRUS I. Những đặc điểm trong nghiên cứu DTH vi khuẩn. II. Các phương thức trao đổi vật chất di truyền ở vi khuẩn và ứng dụng trong nghiên cứu DTH. I. Những đặc điểm trong nghiên cứu DTH vi khuẩn Dễ nuôi cấy, sinh sản nhanh, có nhiều đột biến. Các loại đột biến: 1. Vi khuẩn không có khả năng sử dụng một loại chất dinh dưỡng để sinh trưởng. Ví dụ: không sử dụng được galactose- gal- 2. Vi khuẩn phụ thuộc vào một loại chất dinh dưỡng để sinh trưởng. Ví dụ: cần bổ sung alanine: ala-, đột biến khuyết dưỡng alanine. 3. Vi khuẩn mẫn cảm hoặc kháng với một loại thuốc hoặc phage. Ví dụ tetr. 4. Đột biến có điều kiện. Ví dụ: mẫn cảm nhiệt độ (42 hoặc 10oC). Vật chất di truyền của vi khuẩn Nhiễm sắc thể vi khuẩn: 1 phân tử ADN mạch kép, dạng vòng kết hợp với protein. Các plasmid (plasmid giới tính, plasmid kháng kháng sinh…) II. Các phương thức trao đổi vật chất di truyền ở vi khuẩn Biến nạp (transformation) : Không cần sự tiếp xúc giữa tế bào thể cho và thể nhận. Thể nhận tự lấy ADN từ ngoài vào. Tiếp hợp (conjugation): Cần sự tiếp xúc tế bào thể cho và thể nhận. Vật chất di truyền được truyền qua ống tiếp hợp. Tải nạp (transduction): Có sự tham gia của phage hay thể thực khuẩn (virus lây nhiễm vi khuẩn). A. Biến nạp (transformation) 1. Khái niệm 2. Xây dựng bản đồ di truyền bằng biến nạp A. Biến nạp (transformation) 1. Khái niệm Là quá trình truyền ADN được tách chiết hay ADN trực tiếp từ tế bào cho sang tế bào nhận. Tế bào khả biến (competent): Tế bào dễ dàng tiếp nhận ADN thể cho Vi khuẩn khả biến tự nhiên: Diplococcus pneumoniae, Bacillus subtilis Vi khuẩn cần xử lý trước khi biến nạp: Escherichia coli Khám phá hiện tượng biến nạp: Fredrich Griffith (1928) với vi khuẩn gây viêm phổi Streptococcus pneumoniae Biến nạp tự nhiên ở B. subtilis 2. Xây dựng bản đồ di truyền bằng biến nạp Tần số biến nạp; tần số đồng biến nạp VD: Tần số biến nạp đơn của mỗi gen là 1/103. Hai gen xa nhau: tần số đồng biến nạp (biến nạp đồng thời cả hai gen) = 1/103 x 1/103 = 1/106. Nếu hai gen rất gần nhau thì tần số đồng biến nạp xấp xỉ tần số biến nạp đơn. Từ tần số đồng biến nạp  xác định liên kết gen và trật tự các gen trên NST. Ví dụ B. Tiếp hợp Khái niệm Khám phá ra hiện tượng tiếp hợp Nhân tố F, tế bào F+ và F- và sự tiếp hợp F+ và F- Tế bào Hfr và Sự tiếp hợp giữa Hfr và F- Lập bản đồ di truyền bằng tiếp hợp ở vi khuẩn Plasmid F’ B. Tiếp hợp (conjugation) 1. Khái niệm Là hiện tượng tiếp xúc trực tiếp giữa hai tế bào vi khuẩn và kèm theo việc truyền vật chất di truyền từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận Sơ đồ sự tiếp hợp giữa hai tế bào vi khuẩn 2. Khám phá ra hiện tượng tiếp hợp Lederberg và Tatum (1956 ) Escherichia coli Chủng A: met−bio−thr+leu+thi+ Chủng B: met+bio+thr−leu−thi− Trộn lẫn A và B vài giờ, cấy lên MT Xuất hiện khuẩn lạc sinh trưởng bình thường Kết luận: Có hiện tượng tái tổ hợp di truyền giữa hai dạng A và B, hình thành dạng lai: met+bio+thr+leu+thi+ Không sống được trên môi trường tối thiểu (MM) Hiện tượng tái tổ hợp di truyền giữa các tế bào E.coli: dạng A(met−bio−thr+leu+thi+) dạng B (met+bio+thr−leu−thi−) không thể sinh trưởng trên môi trường tối thiểu (MM) 3. Nhân tố F, tế bào F+ và F- và sự tiếp hợp F+ và F- Plasmid Plasmid F (nhân tố F – nhân tố giới tính): plasmid chứa gen truyền, gen quy định lông giới tính Tế bào cho: F+ (mang nhân tố F) Tế bào nhận: F- (không mang nhân tố F) Quá trình tiếp hợp giữa F+ và F- Hai tế bào vi khuẩn tiến sát vào nhau Hình thành cầu tiếp hợp Nhân tố F từ tế bào F+ đứt ở một mạch, mạch đứt đó được truyền sang tế bào F-. Quá trình tổng hợp sợi bổ sung của F được thực hiện ở cả hai tế bào Kết quả: hình thành hai tế bào F+ 4. Tế bào Hfr và Sự tiếp hợp giữa Hfr và F- Các tế bào Hfr Là các tế bào vi khuẩn mang nhân tố F đã được lồng ghép vào NST của vi khuẩn Khi tiếp hợp với tế bào nhận, có khả năng truyền đi một số gen của NST tế bào vi khuẩn qua ống tiếp hợp Có tần số tái tổ hợp cao. Xen nhân tố F vào nhiễm sắc thể E. coli bằng trao đổi chéo  Tiếp hợp giữa Hfr và F- Hai tế bào hình thành ống tiếp hợp. Nhân tố F từ thể cho được tách do mở ADN mạch vòng ở vị trí bất kỳ. Hai sợi đơn của phân tử ADN kép được tách nhau ra, một đầu chui qua ống tiếp hợp, kéo theo một số gen của NST, được truyền sang tế bào nhận, sợi bổ trợ còn lại được tổng hợp bên tế bào nhận. Nếu các gen nằm trong phân tử ADN được truyền sang có những đoạn tương đồng với NST tế bào nhận thì có thể xảy ra hiện tượng trao đổi chéo, tái tổ hợp và có thể được phát hiện, nghiên cứu. Nếu toàn bộ một sợi đơn của NST vi khuẩn cho và phần còn lại của nhân tố F được truyền sang tế bào nhận, tế bào nhận F- sẽ trở thành tế bào F+, tuy nhiên rẩt hiếm khi như vậy. Điểm khác biệt trong sự tiếp hợp ở F- và Hfr Trình tự truyền gen từ các chủng Hfr thể cho sang thể nhận khác nhau vì nhân tố F có thể lồng ghép ở các vị trí khác nhau trên NST vi khuẩn. Quá trình truyền ADN ở Hfr thường bị đứt quãng. Vì vậy trong tiếp hợp Hfr  F-, sau khi được truyền, F- vẫn là F- vì đoạn cuối của nhân tố F không được truyền sang. Đoạn ADN của Hfr được truyền sang tế bào nhận không tạo thành mạch vòng, không tự sao chép được. Có trao đổi chéo, tái tổ hợp với NST thể nhận. Tóm tắt các sự kiện diễn ra trong quá trình tiếp hợp ở E. coli 5. Lập bản đồ di truyền bằng tiếp hợp ở vi khuẩn Phương pháp ngắt quãng tiếp hợp: + Lai Hfr azi+ton+lac+gal+  F−azi−ton−lac−gal− + Làm đứt cầu tiếp hợp tại những thời điểm xác định khác nhau. + Dùng môi trường chọn lọc để xác định các gen được truyền. + Lập biểu đồ tần số tái tổ hợp hình thành qua tiếp hợp theo thời gian. + Xác định trật tự các gen trên NST (bằng thời gian truyền gen)  Trật tự các gen được truyền là azi, ton, lac, gal Thí nghiệm ngắt quãng tiếp hợp ở vi khuẩn E. coli. Để lập bản đồ gen vi khuẩn cần phải sử dụng nhiều chủng Hfr khác nhau. Thí nghiệm sẽ cho các kết quả truyền gen theo những trật tự khác nhau vì mỗi chủng Hfr có hướng truyền gen khác nhau. Đó cũng là bằng chứng cho thấy NST vi khuẩn có mạch vòng. Ví dụ: Thí nghiệm ngắt quãng tiếp hợp với 4 chủng Hfr ở E. coli cho kết quả truyền gen như sau: + Chủng 1: Q W D M T + Chủng 2: A X P T M + Chủng 3: B N C A X + Chủng 4: B Q W D M Kết quả thí nghiệm cho thấy trật tự các gen, vị trí lồng ghép nhân tố F và hướng truyền gen của các chủng Hfr như hình bên. Bản đồ gen của E. coli NST mạch vòng. Dài khoảng 4800 Kb. Đã xác định được khoảng 2000 locus. Thời gian truyền toàn bộ hệ gen từ thể cho sang thể nhận khoảng 100 phút. 6. Plasmid F’ Là plasmid F bị cắt bỏ khỏi NST vi khuẩn sau khi lồng ghép. Vi khuẩn từ Hfr trở thành F+. Quá trình cắt bỏ thường không chính xác nên một số gen của vi khuẩn cũng bị cắt theo. Khi cho F’ tiếp hợp vào vi khuẩn, nó sẽ sinh ra thể lưỡng bội một phần. F’ được sử dụng để phân tích bổ trợ Ví dụ: Thu được 2 chủng đột biến cùng khuyết dưỡng arginine, ký hiệu argC và argB. Hai đột biến trên cùng 1 gen hay ở 2 gen khác nhau? Tạo F’ có kiểu gen argC+argB rồi lai với 2 chủng đột biến. Nếu hai đột biến đều mọc được trên môi trường chọn lọc => 2 chủng đều mang đột biến ở gen C. Nếu một chủng mọc được thì chủng đó mang đột biến ở C. Nếu cả hai chủng đều không mọc được thì cả hai đều mang đột biến ở B. C. Tải nạp 1. Khái niệm 2. Các chu trình sống của phage 3. Tải nạp chung & Tải nạp đặc hiệu C. Tải nạp (transduction) 1. Khái niệm Là quá trình truyền vật chẩt di truyền (ADN) từ thể cho sang thể nhận nhờ phage. 2. Các chu trình sống của phage2.1. Chu trình sinh tan Có những phage luôn làm tan tế bào vi khuẩn khi chúng xâm nhập VK này, đây là các phage sinh tan. Ví dụ: phage T2, T4. Phage độc xâm nhập vi khuẩn, sử dụng nguyên liệu của tế bào vi khuẩn để tái bản ADN của chúng, tạo vỏ protein rồi phá vỡ tế bào vi khuẩn và giải phóng ra các phage con. Các phage tạo thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào vi khuẩn liền kề. Virus lây nhiễm tế bào vi khuẩn 2.2. Tái tổ hợp di truyền trong chu trình sinh tan Hai phage có kiểu gen khác nhau cùng xâm nhiễm một tế bào vi khuẩn, chúng có thể tái tổ hợp với nhau tạo ra phage con có kiểu hình tái tổ hợp VD: Hai thể đột biến phage T4 cùng xâm nhiễm E. coli: một dạng là tạo vết tan đục, rộng, dạng kia là tạo vết tan sáng, nhỏ. Sau một chu trình sinh tan, chúng có thể tạo ra các phage con có kiểu hình mới: tạo vết tan đục, nhỏ hoặc tạo vết tan sáng, rộng. Người ta cũng có thể lập bản đồ di truyền cho phage bằng cách sử dụng tái tổ hợp ở phage. Lây nhiễm kép E. coli bởi hai phage. Các dạng vết tan phage thế hệ sau từ phép lai h−r+ × h+r− 2.3. Chu trình tiềm tan Phage sau khi xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn chủ ADN của phage lồng ghép với ADN NST vi khuẩn và không phá vỡ tể bào vi khuẩn (thể tiềm tan), còn ADN phage nằm trên NST vi khuẩn được gọi là prophage. Thể tiềm tan phân bào tạo thành các thể tiềm tan con. Nếu môi trường không thuận lợi, prophage có thể được hoạt hóa, tách khỏi NST vi khuẩn và tạo vỏ bọc protein rồi bắt đầu chu trình sinh tan, phá vỡ tế bào chủ, giải phóng các phage con Các chu kỳ khác nhau của phage tiềm tan đối với tế bào chủ của nó Lồng ghép ADN phage với NST vi khuẩn Ở phage , ADN có dạng mạch thẳng với hai đầu có trình tự bổ trợ nhau (là các đầu dính), có thể tạo thành dạng vòng. ADN phage và ADN vi khuẩn có chứa vị trí đặc thù gọi là vị trí đính (attachment site - att). Tại vị trí đính, ADN vòng cuả phage và ADN vi khuẩn đính vào nhau sau đó đứt nối và xảy ra quá trình trao đổi chéo để tạo ra NST lồng ghép, với sự xúc tác của enzyme đặc hiệu. Mô hình hợp nhất ADN phage λ vào NST E. coli. Tái tổ hợp tương hỗ xảy ra giữa vị trí đính đặc hiệu trên λ ADN vòng và vùng đặc hiệu trên NST vi khuẩn ở giữa hai gen gal và bio. 2.3 Thí nghiệm phát hiện hiện tượng tải nạp Joshua Lederberg và Norton Zinder (1951) Salmonella typhimurium Hai chủng vi khuẩn (A và B) được nuôi trong ống hình chữ U, có màng ngăn vi khuẩn A: phe−trp−tyr− met+his+ × B: phe+trp+tyr+ met−his− Tạo ra thể tái tổ hợp phe+trp+tyr+met+his+ Tác nhân giúp cho sự hình thành thể tái tổ hợp được xác định là phage P22 3. Tải nạp chung & Tải nạp đặc hiệu 3.1 Tải nạp chung Tải nạp chung là sự tải nạp trong đó bất kỳ gen nào của thể cho cũng có thể được truyền sang thể nhận bởi phage. VD: Phage T1 xâm nhiễm E. coli là một phage tải nạp chung. Cơ chế tải nạp chung. Chỉ một tỉ lệ nhỏ các phage thế hệ con (khoảng 1/10000) mang gen của thể cho.  Cơ chế tải nạp chung Phage T1 tạo ra enzyme nuclease cắt ADN vi khuẩn thể cho thành các đoạn có kích thước tương đương với ADN phage. Hình thành hạt tải nạp (phage mang gen của thể cho) chứa các đoạn cắt ngẫu nhiên từ NST vi khuẩn. Hạt tải nạp xâm nhiễm tế bào vi khuẩn E. coli khác, chúng có thể trao đổi chéo tại các đoạn tương đồng với NST vi khuẩn nhận. Sử dụng môi trường chọn lọc, người ta có thể phát hiện các thể tái tổ hợp này.  Phân tích di truyền bằng tải nạp chung Có thể dùng tải nạp chung để lập bản đồ gen Các gen nằm xa nhau trên NST ít khi được truyền cùng nhau sang tế bào nhận Hiện tượng tải nạp cả hai gen đang xét (các gen đánh dấu) được gọi là đồng tải nạp Tần số đồng tải nạp tỉ lệ nghịch với khoảng cách các gen Việc nghiên cứu đồng tải nạp có thể xác định được trật tự các gen, giúp xây dựng bản đồ di truyền 3.2 Tải nạp đặc hiệu Là hiện tượng tải nạp trong đó phage chỉ có thể truyền một số gen nhất định từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận. Tải nạp đặc hiệu xảy ra do phage tiềm tan vi khuẩn chủ, ADN của nó xen vào NST vi khuẩn chủ tại vị trí nhất định.  Cơ chế tải nạp đặc hiệu Trong điều kiện cụ thể, ở các tế bào tiềm tan, sự sinh tan bắt đầu. Khi ADN phage tách khỏi NST vi khuẩn, nó có thể bị cắt không chính xác nên tạo ra ADN phage mang một số gen nào đó của vi khuẩn. Khi xâm nhiễm tế bào vi khuẩn khác, phage mang gen vi khuẩn có thể trao đổi chéo ở các đoạn tương đồng và truyền gen sang vi khuẩn nhận. Cơ chế tải nạp đặc hiệu ở phage 