Giáo trình Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử

TS. CHU HOÀNG MẬU CƠ SỞ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Lời nói đầu.................................................................................................................................4 Chương 1: HỆ GENE..............................................................................................................5 §1. KHÁI NIỆM HỆ GENE (GENOME) ..................................................................5 §2. AXIT NUCLEIC ..................................................................................................9 §3. ADN VÀ TÁI BẢN ADN..................................................................................11 §4. ARN VÀ CƠ CHẾ PHIÊN MÃ .........................................................................19 THẢO LUẬN...........................................................................................................23 Chương 2: ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GENE CỦA SINH VẬT PROKARYOT VÀ EUKARYOT ...........................................................................................................25 §1. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GENE Ở PROKARYOT ..........................................25 §2. CẤU TRÚC PHÂN ĐOẠN GENE Ở EUKARYOT .........................................25 §3. MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN................................................................................27 THẢO LUẬN...........................................................................................................32 Chương 3: MỐI LIÊN HỆ GIỮA ADN, ARN, PROTEIN................................................33 §1. THÔNG TIN DI TRUYỀN VÀ MẬT MÃ DI TRUYỀN .................................33 §2. PROTEIN ...........................................................................................................39 §3. QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEIN.....................................................42 §4. ĐIỀU HOÀ BIỂU HIỆN GENE ........................................................................45 THẢO LUẬN......................................................................................................................49 Chương 4: ENZYME SỬ DỤNG TRONG KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ............50 §1. ENYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME HOẶC ENZYME CẮT HẠN CHẾ (RESTRICTION ENDONUCLEASE - RE) .............................................50 §2. CÁC NHÓM ENZYME KHÁC.........................................................................57 §3. ENZYME NUCLEASE......................................................................................60 THẢO LUẬN......................................................................................................................61 Chương 5: XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA PROTEIN VÀ ĐẶC TÍNH Ở SINH VẬT ...............................................................................................................62 §1. MỘT SỐ LOẠI PROTEIN CHỨC NĂNG........................................................62 §2. QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ PROTEIN..............................66 §3. KĨ THUẬT PHÂN TÍCH PROTEIN .................................................................67 §4. KĨ THUẬT PHÂN TÍCH ENZYME..................................................................74 §5. NGHIÊN CỨU RIPS BẰNG WESTERN BLOT ..............................................77 THẢO LUẬN......................................................................................................................78 Chương 6: KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH HỆ GENE SINH VẬT..........................................................................................................................79 §1. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN..............................................................79 §2. LAI PHÂN TỬ ...................................................................................................83 §3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA ADN ..........................................85 §4. RFLP TECHNOLOGY (Kĩ thuật phân tích hiện tượng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN).................................................................................................87 2 THẢO LUẬN......................................................................................................................91 Chương 7: PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE (POLIMERASE CHAIN REACTION - PCR)................................................................................................92 §1. PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE (PCR) ....................................................92 §2. PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA ADN ĐƯỢC NHÂN BẢN NGẪU NHIÊN (RANDQM AMPLIFIED PQLIMORPHIC DAN - RAPD) ................99 §4. PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CHIỀU DÀI CÁC PHÂN ĐOẠN ADN ĐƯỢC NHÂN BẢN CÓ CHỌN LỌC .........................................................................106 THẢO LUẬN.........................................................................................................108 Chương 8: TẾ BÀO CHỦ VÀ VECTOR ..........................................................................109 §1. TẾ BÀO CHỦ ..................................................................................................109 §2. VECTOR ..........................................................................................................111 §3. PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ ..122 THẢO LUẬN.........................................................................................................125 Chương 9: PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE......126 §1. PHÂN LẬP GENE ...........................................................................................126 §2. TÁCH DÒNG GENE .......................................................................................127 §3. BIỂU HIỆN GENE...........................................................................................139 THẢO LUẬN.........................................................................................................151 Tài liệu tham khảo chính .....................................................................................152 những công trình của tác giả cùng các cộng tác viên đã công bố.....................155 CƠ SỞ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ .....................................................162 3 Lời nói đầu Sinh học phân tử hiện đại đang phát triển mạnh và đã trở thành nòng cốt của Công nghệ sinh học. Ở Việt Nam, thành tựu nghiên cứu Sinh học phân tử và áp dụng kĩ thuật phân tử trong nghiên cứu Khoa học sự sốngvà Công nghệ sinh học đã có nhiều đóng góg trong việc chăm sóc, bảo vệ sức khoẻ con người; trong đánh giá tài nguyên sinh vật; trong chọn giống và sản xuất nông lâm ngư nghiệp. Sinh học phân tử là môn Sinh học hiện đại, được giảng dạy ở nhiều trường đại học và đang có những đóng góp nhất định trong đào tạo lớp người có tri thức về Công nghệ sinh học góp phần vào sự nghiệp Công nghiệp hoá, hiện đại hoá Cơ sở và phương pháp Sinh học phân tử được biên soạn từ nhiều tài liệu, bài giảng và công trình nghiêm cứu mới về Sinh học phân tử hiện đại của các tác giả trong và ngoài nước, nhằm cung cấp những kiến thức cơ bản về nguyên lí và ứng dụng của Sinh học phân tử, làm tài liệu cho nghiên cứu, giảng dạy và học tập môn này ở trường đại học. Cuốn Cơ sở và phương pháp Sinh học phân tử được cấu trúc bởi 9 chương: Chương 1. Hệ gene Chương 2. Đặc điểm cấu trúc gene của sinh vật Prokaryot và Eukryot Chương 3. Mối liên hệ giữa ADN, ARN, Protein Chương 4. Enzyme sử dụng trong kĩ thuật sinh học phân tử Chương 5. Xác định mối liên quan giữa protein và đặc tính ở sinh vật Chương 6. Kĩ thuật sinh học phân tử trong tích hệ gene ở sinh vật Chương 7. Phản ứng chuỗi polimerase (PCR) Chương 8. Tế bào chủ và Vector Chương 9. Phân lập gene, tách dòng phân tử và biểu hiện gene. Tác giả trân trọng cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Trọng Lạng, TS. Lương Thị Hồng Vân đã đọc và góp ý cho bản thảo, xin cảm ơn những đóng góp của Hội đồng nghiệm thu đánh giá giáo trình của trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và cảm ơn các ý kiến đóng góp quý báu của đông đảo các nhà khoa học. Trong quá trình biên soạn chắc chắn có những sai sót, tác giả rất mong nhận được những góp ý của bạn đọc. Mọi đóng góp xin gửi về Khoa Sinh - Kĩ thuật Nông nghiệp trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Tác giả 4 Chương 1: HỆ GENE Tóm tắt: Sự ra đời của sinh học phân tử được đánh dấu bằng thời điểm mà Oatsơn và Cric (1953) phát hiện ra cấu trúc ADN. Trải qua hơn 40 năm (1953 - 2000) sinh học phân tử đã đạt được những thành tựu vĩ đại mà đỉnh cao của sự phát triển này là những khám phá bản chất sinh học của sự sống ở cấp độ phân tử và xây dựng các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng váo thực tiễn. Geneomics và Proteomics là vấn đề đang được đặc biệt quan tâm hiện nay mà cơ sở của các lĩnh vực này là những phát hiện về cấu trúc và chức năng của axit nucleic, về đặc điểm của genome nhân, genome ti thể, genome lạp thể. Những điểm khác nhau về cấu trúc và chức năng của các hệ gene cho phép ứng dụng vào thực tế chọn giống và nghiên cứu ở người. Cùng với cấu trúc ADN và ARN còn có đặc điểm của quá trình tái bản ADN và phiên mã cũng được quan tâm, vì nó là cơ sở của những kĩ thuật sinh học phân tử - các thao tác ở ADN và ARN. Nội dung cơ bản của chương đề cập đến những cơ sở của sinh học phân tử. Nội dung của chương gồm 4 vấn đề cơ bản: (1). Khái niệm hệ gene; (2). Axit nucleic; (3). ADN vá tái bản ADN, (4). ARN và cơ chế phân mã. §1. KHÁI NIỆM HỆ GENE (GENOME) Quá trình sinh trưởng và phát triển của sinh vật trải qua rất nhiều giai đoạn và tất cả quá trình đó đều phụ thuộc vào sự điều khiển của các gene. Cấu trúc, chức năng của tế bào được quyết định trực tiếp bởi protein, đó là sản phẩm cuối cùng của sự biểu hiện gene. Quá trình thể hiện hoạt động của gene qua protein, bị ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố ngoại cảnh như ánh sáng, chế độ dinh dưỡng, sự cộng sinh và sự tương tác của các gene trong hệ gene của tế bào. Như vậy, giữa các thành phần của hệ gene trong tế bào sống có sự tương tác với nhau và có mối quan hệ với các yếu tố của môi trường. Trong tế bào, bên cạnh genome trong nhân, hệ thống di truyền còn phân bố trong lục lạp, ti thể và plasmid (vi khuẩn). Các cơ quan tử này cùng tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào. Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của các cơ thể sống, tế bào còn là đơn vị của sự di truyền. Hệ gene là toàn hộ các gene trong tế bào của cơ thể sinh vật, hệ gene hứa toàn bộ thông tin di truyền đặc trưng cho từng loài, cho từng cá thể trong loài. Ở sinh vật Prokaryot hệ gene gồm toàn bộ các gene trong tế bào; còn ở Eukaryot 5 hệ gene gồm toàn bộ các gene trong tế bào đơn bội (n). Tế bào đơn bội có một hệ gene, các sinh vật hoặc tế bào lưỡng bội có hai hệ gene, sinh vật đa bội có nhiều hệ gene. Hệ gene của sinh vật Eukaryot bao gồm hệ gene nhân (genome nhân), hệ gene ti thể (genome ti thể), hệ gene lục lạp (genome lục lạp). Hệ gene ở Prokaryot chỉ có một thành phần gồm các đoạn ADN không giống nhau; còn hệ gene ở Eukaryot có ba thành phần ADN không giống nhau: Các đoạn ADN lặp lại nhiều (chiếm khoảng 25%), các đoạn ADN lặp lại ít (30%) và các đoạn ADN không lặp lại (45%). 1.1. Hệ gene nhân Hệ gene nhân là genome lớn nhất trong tế bào xét về mặt khối lượng cũng như số lượng gene mã hoá. ADN nhân được sắp xếp gọn trong nhiễm sắc thể trong sự liên kết với protein chứa histone và không chứa histone. ADN có vai trò mã hoá thông tin di truyền, còn protein thì bảo vệ và tham gia điều khiển sự sao chép, phiên mã được chính xác. Quá trình cơ bản trong phát triển động, thực vật là sự nhân đôi vật chất di truyền và phân đều cho các tế bào con khi tế bào phân chia. Tế bào thực vật chứa một lượng lớn ADN, khối lượng này thay đổi theo loài. Arabidosis thaliana có lượng ADN nhỏ nhất (0.07 picogram). Allium cepa có lượng ADN nhiều hơn 33,5 pg/ haploid genome (hệ gene đơn bội). 1.2. Hệ gene lục lạp Cho đến năm 1962, người ta mới khám phá ra ADN và ribosom có trong lục lạp. Như vậy, lục lạp hoặc trong lạp thể chứa tất cả bộ máy cần thiết để tự mình biểu hiện hoạt động gene. Hệ gene lục lạp là toàn bộ các gene trong lục lạp hay toàn bộ lượng thông tin di truyền chứa trong ADN của lục lạp. Lượng ADN trong lục lạp rất lớn, chiếm tới 15% tổng lượng ADN cơ thể thực vật, ribosom chiếm 60% lượng ribosom của tế bào, ADN lục lạp được cấu tạo bởi các phân tử có cấu trúc mạch vòng, có trọng lượng phân tử 83 - 128 x 106, trong đó gần 85% phân tử ADN là mạch đơn. ADN lục lạp làm khuôn phiên mã tổng hợp mARN chloroplast. Ở đây các phân tử mARN chỉ có khoảng 20 nucleotit, chúng thực hiện sự tổng hợp protein tại chỗ trong chloroplast. Ribosom trong chloroplast là 70S bao gồm 30S và 50S. Sau khi tổng hợp xong protein được vận chuyển đến nơi mà lục lạp cần thiết. Về cơ bản hệ thống di truyền trong lục lạp tương tự với hệ thống di truyền của sinh vật Prokaryot. Do vậy đã có nhiều cuộc tranh luận, có phải vật liệu di truyền của sinh vật tiền nhân là nguồn gốc của ADN lục lạp? Ngoài ra ADN của lục lạp không chứa một số gene đặc trưng cho những sinh vật có nhân thật. Điều này đã tìm thấy trong ADN ở thuốc lá và ngô. Ribosom của lục lạp cũng giống 6 ribosom của sinh vật Procariot: 70S được cấu tạo bởi 2 tiểu phần 50S và 30S. Ribosom của E. coli và lục lạp thực vật có đặc tính miễn dịch giống nhau. Thông qua việc nghiên cứu sản phẩm biểu hiện gene là protein, người ta đã phát hiện giữa hệ gene lục lạp và hệ gene nhân trong tế bào thực vật có mối quan hệ chặt chẽ. - Genome của lục lạp không có khả năng tổng hợp tất cả các protein có trong chúng. - Phần lớn polipeptid của lục lạp được tổng hợp do genome trong nhân tế bào. - Những polipeptid này được chuyển vào lục lạp theo cơ chế sau dịch mã thực hiện qua vỏ lục lạp. - Hệ thống di truyền lục lạp điều khiển tổng hợp các protein cần cho sự phát triển của chúng với số lượng khoảng 100 polipeptid. Bảng 1.1. Kích thước một số ADN lục lạp (ct. ADN), ADN nhân và vi khuẩn AND Kích thước (bp) Kích thước vòng (μm) Plasmid 1≈ 200 x 103 - Trực khuẩn E-coli (chromosome) 3,8 x 106 - Trùng roi (Euglena) (ct. ADN) 1,4 x 105 44 - 44 Thuốc lá (Tabaco) (ct. ADN) 1,6 x 105 - Ngô (Maize) (ct. ADN) 1,36 x 105 43 Đậu xanh (mungbean) (ct. ADN) 1,21 x 105 39 - Polipeptid được mã hoá tổng hợp và ARN trong lục lạp đảm nhiệm chức năng của cơ quan tử liên quan đến quá trình quang hợp. Ở lúa người ta đã xác định được vị trí của các gene quan trọng điều khiển quá trình quang hợp như rbcl, atpBE, pSbA, pstA, psbA. Các gene này đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp protein ở hệ thống quang hoá II. 1.3. Hệ gene ti thể (Mitochondria Genome) Để nghiên cứu hệ gene ti thể điều quan trọng đầu tiên là thu được ADN ti thể. Có thể lấy ví dụ ở cây lúa theo Salech và cộng sự (1989), phương pháp phân tích ADN trong ti thể gồm các bước sau: - Li tâm với tốc độ chậm để loại bỏ nhân, lục lạp và các thành phần khác của tế bào. - Li tâm với tốc độ nhanh để tách ti thể. - Li tâm với tốc độ chậm để lấy nhân, lục lạp và các thành phần khác. 7 - Xử lí ADN- ase I để phân giải các chất ADN nhân dính trong ti thể. - Làm sạch ti thể. - Tách chiết mtADN từ ti thể (mtADN). Như vậy người ta có thể thu được ADN của mitochondria tinh sạch phục vụ cho các công tác nghiên cứu tiếp theo. mtADN thể hiện một sự khác biệt rất lớn về mặt kích thước và hình dạng. Đối với động vật, mtADN có dạng vòng và kích thước xấp xỉ 15 - 20kb. Ngược lại mtADN của thực vật có nhiều dạng (vòng.,thẳng vaà(cc dạng khác), cũng như có kích thước lớn hơn nhiều: ở cây bắp cải là 200kb, hoặc ở một loại dưa là 2500 kb. Do vậy genome ti thể thực vật tương đối lớn và gồm một vài phân tử ADN. Lượng mtADN trong thực vật chiếm khoảng 0,5 - 1% lượng ADN của tế bào nhưng nó đóng vai trò sống còn cho sự phát triển và sinh sản thực vật. Chức năng của mtADN giống như ctADN. Nó có khả năng mã hoóatổng hợp một số lượng nhỏ pohlieptid nhưng rất quan trọng.,phục vụ cho những hoạt động của chính nó. Những sản phẩm chính mà mtADN điều khiển tổng hợp là 3 tiểu phần của cytochromoxydaza, 2 tiểu phần của phức chất cytochrom bc và một số thành phần khác (Andre, 1991). Ngoài ra mtADN còn đóng vai trò quan trọng trong hiện tượng bất dục đực tế bào chất (CMS). Đây là một đặc tính được khai thác trong sản xuất các dòng lai ở nhiều cây trồng như lúa, ngô... Spruill và cộng sự (1981) đã chỉ ra ở cây ngô có sự khác nhau giữa mtADN trong tế bào cây thường và trong tế bào cây có hiện tượng CMS. Khi phân tích sản phẩm protein thì những mtADN ở cây CMS có khả năng tổng hợp chuỗi peptid 130000 MW, nhưng nó mất khả năng tổng hợp chuỗi polipeptid 21000 MW ở nguyên sinh chất tế bào cây bình thường. Mặt khác người ta còn thấy hiện tượng bất dục tế bào chất còn liên quan đến những phân tử ADN giống như plasmid tìm thấy trong ti thể. Chẳng hạn ở ngô trong tế bào chất của cây CMS có mang hai phân tử AND mạch thẳng với kích thước 6,2 kb và 5,2 kb. Việc sử dụng code mã hóa tổng hợp protein của mtADN có những điểm cần lưu ý: trong hệ thống hoạt động mã di truyền thông thường code UGA cung cấp tín hiệu kết thúc quá trình tổng hợp một chuỗi polipeptid, nhưng ở ADN của ti thể nó lại là code của tryptophan. Ngược lại ở ADN nhân code CGG mã hoá cho tryptophan thì ở ti thể nó lại mã hoá arginin. Ngoài ra người ta đã phát hiện một dạng mới của mARN trong genome ti thể cây trồng và nó được gọi là ARN - Editing. Đây là một vấn đề thể hiện sự tiến hoá của thực vật bậc cao, giúp cho nó có khả năng 8 thích nghi hơn với điều kiện ngoại cảnh. §2. AXIT NUCLEIC 2.1. Axit nucleic là vật chất di truyền Axit nucleic bao gồm axit deoxyribonucleie (ADN) hoặc axit ribonucleic (ARN) đều đáp ứng tiêu chuẩn của vật chất di truyền. Có rất nhiều bằng chứng đã chứng tỏ ra axit nucleic là một vật chất di truyền ở cấp độ phân tử. Axit nucleic hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 260nm và điều này phù hợp một cách chính xác với bước sóng mà tia tử ngoại có thể gây đột biến tối đa ở tế bào, trong khi đó protein ở bước sóng 280nm. - Năm 1928 F. Grifflth phát hiện thấy nòi phế cầu khuẩn S, khuẩn lạc nhẵn do có vỏ bọc polisaccharid (vi khuẩn gây viêm phổi) của vi khuẩn Diplococus pneumoniae làm chuột chết khi tiêm vào cơ thể chuột. Trong khi đó khuẩn lạc R (khuẩn lạc không có vỏ bọc polisaccharid) không gây độc hại gì. Hỗn hợp các phế cầu khuẩn R còn sống và phế cầu khuẩn S đã chết thì làm cho chuột bị viêm phổi, chết và từ máu của chúng đã phân lập được vi khuẩn S sống. Như vậy tác nhân nào đó từ phế cầu khuẩn đã biến nạp và làm cho phế cầu khuẩn R thành S. Người ta đã chứng minh được rằng: ADN tách từ vi khuẩn S nếu được đưa vào vi khuẩn R thì gây nên sự biến đổi kiểu R → S, phát hiện này được khẳng định ADN là vật chất di truyền. Năm 1944 O. T Avery, Mc Leod và Mc Carti đã chứng minh được rằng tác nhân biến nạp là ADN. Phế cầu khuẩn S bị xử lí bằng protease hoặc ARN- aza thì hoạt tính biến nạp vẫn còn: những nếu phế cầu khuẩn S bị xử lí bởi ADN-aza thì hoạt tính biến nạp không còn nữa. Hình 1.1. Sơ đồ chứng minh vật chất di truyền là ARN Năm 1957, H. Fraen Kel - Conrat và B. Singer công bố thí nghiệm ở virut đốm thuốc lá có lõi ARN và vỏ protein, có hai dạng a và b. Các thí nghiệm lắp ráp lõi ARN của dạng này với protein của dạng kia và ngược lại đã thành công tạo ra virut có vỏ và lõi thuộc hai dạng khác nhau. Sau đó đem gây nhiễm vào 9 thuốc lá, kết quả các virut con phân lập được từ vết đốm đều mang cả vỏ protein và lõi ARN thuộc cùng một dạng là dạng của lõi ARN mang nhiễm chứ không phải của vỏ protein. Như vậy thông tin di truyền được chứa đựng trong ARN chứ không