Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT F 7 G GIÁO TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GS.TS. MAI XUÂN LƯƠNG 2005 Công nghệ Sinh học thực vật - 1 - MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................- 1 - PHẦN I. NHÂN GIỐNG IN VITRO ....................................................................- 3 - MỞ ĐẦU ..............................................................................................................- 3 - CHƯƠNG I. NHỮNG NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ ............................- 5 - TRONG CÔNG TÁC VI NHÂN GIỐNG.............................................................- 5 - I. GIỚI THIỆU CHUNG...................................................................................- 5 - II. TÁI SINH CÂY CON TRONG NUÔI CẤY MÔ.........................................- 6 - 1. Nhân giống từ hạt trong điều kiện vô trùng. .............................................- 6 - 2. Nuôi cấy phôi............................................................................................- 6 - 3. Nuôi cấy tế bào trứng................................................................................- 6 - III. NHÂN GIỐNG CÂY CON BẰNG BIỆN PHÁP NUÔI CẤY MÔ.............- 7 - 1.Giai đoạn I. Kiến lập và ổn định mẫu cấy. ................................................- 7 - 2.Giai đoạn 2: nhân giống.............................................................................- 9 - 3.Giai đoạn 3: hình thành rễ. ........................................................................- 9 - 4.Giai đoạn 4. Làm cho các cây tái sinh thích nghi khí hậu........................ - 10 - IV. SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT.- 11 - CHƯƠNG II. PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT. - 15 - I. BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG......................................................... - 15 - 1. Ý nghĩa cuả vô trùng trong nuôi cấy mô thực vật. .................................. - 15 - 2. Nguồn nhiễm tạp. .................................................................................. - 15 - 3. Vô trùng dụng cu ïthủy tinh, nút đậy và môi trường. ............................... - 15 - 4. Vô trùng mô cấy. .................................................................................... - 16 - 5. Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng. ......................................... - 17 - II. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG....................................................................... - 17 - 1. Đường. .................................................................................................... - 18 - 2. Các muối khoáng đa lượng. .................................................................... - 18 - 3. Các muối khoáng vi lượng. ..................................................................... - 19 - 4.Các vitamin.............................................................................................. - 19 - 5. Các chất kích thích sinh trưởng (phytohormone). ................................... - 20 - 6. Các chất hữu cơ khác. ............................................................................. - 21 - 7. Chuẩn bị các dung dịch đậm đặc và dung dịch làm việc. ....................... - 21 - 8. Vấn đề lựa chọn môi trường.................................................................... - 23 - III. CHỌN VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY. .................................................................. - 23 - IV. PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT. ........................... - 24 - 1.Cách bố trí phòng thí nghiệm nuôi cấy mô. ............................................. - 24 - 2. Các thiết bị chủ yếu của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật. ......... - 24 - CHƯƠNg III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ...................................... - 26 - I. NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG............................................................ - 26 - 1/ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây khoai tây................................................. - 27 - 2/ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây địa lan..................................................... - 29 - II. NHÂN GIỐNG BẰNG CON ĐƯỜNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH ...... - 32 - III. NHÂN GIỐNG BẰNG CÁCH TẠO MÔ SẸO (CALLUS). ..................... - 34 - IV. NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI CẤY LÁT MỎNG.................................... - 36 - GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 2 - V. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT VI GHÉP TRONG NHÂN GIỐNG. ................ - 38 - VI. NUÔI CẤY TÚI PHẤN........................................................................... - 41 - 1.Chọn vật liệu khởi nguyên....................................................................... - 41 - 2.Tạo các tổ hợp gen mới bằng phương pháp lai hữu tính. ......................... - 41 - 3.Nuôi cấy túi phấn cây lai. ........................................................................ - 42 - VII. NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP PROTOPLAST Ở THỰC VẬT ................ - 45 - 1. Tách và nuôi cấy protoplast thực vật. ................................................. - 46 - 2. Dung hợp protoplast................................................................................ - 48 - VIII. CHUYỂN GEN THỰC VẬT ................................................................. - 51 - 1. Agrobacterium. ....................................................................................... - 51 - 2. Chuyển gen nhờ Agrobacterium............................................................. - 52 - PHẦN II. NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRONG VƯỜM ƯƠM............................. - 54 - CHƯƠNG I. YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG CỦA NHÂN GIỐNG........................... - 54 - I. CÁC YẾU TỐ CƠ BẢN VỀ VI KHÍ HẬU CỦA MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG. .......................................................................................................... - 54 - 1.Aùnh sáng .................................................................................................. - 54 - 2. Nước và độ ẩm. ....................................................................................... - 55 - 3. Nhiệt độ. ................................................................................................. - 55 - 4. Khí và trao đổi khí. ................................................................................. - 55 - 5. Dinh dưỡng khoáng................................................................................. - 55 - II. KHAY, CHẬU TRỒNG CÂY.................................................................... - 56 - 1.Khay phẳng đáy. ...................................................................................... - 56 - 2. Chậu đất nung. ........................................................................................ - 56 - 3. Chậu plastic. ........................................................................................... - 56 - 4. Chậu sợi. ................................................................................................. - 56 - 5. Chậu giấy................................................................................................ - 57 - 6. Túi polyethylene..................................................................................... - 57 - 7. Khay trồng bằng gỗ. ............................................................................... - 57 - III. QUẢN LÝ CÁC YẾU TỐ THỔ NHƯỠNG TRONG NHÂN GIỐNG VÀ SẢN XUẤT CÂY GIỐNG.............................................................................. - 57 - CHƯƠNG II. KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG MỘT SỐ CÂY PHỔ BIẾN. ........... - 63 - I. KÍCH THÍCH TẠO RỄ. .............................................................................. - 63 - II. SỬ DỤNG PHYTOHORMONE KÍCH THÍCH CÀNH CHIẾT RA RỄ. ... - 64 - III. NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG TỪ RỄ. .................................................... - 65 - IV. NHÂN GIỐNG TỪ VẢY CỦ ................................................................... - 69 - V. NHÂN GIỐNG TỪ LÁ. ............................................................................. - 70 - VI. NHÂN GIỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÀNH......................... - 72 - VII. NHÂN GIỐNG CÂY ĐỖ QUYÊN. ........................................................ - 73 - VIII. GHÉP CÀNH. ........................................................................................ - 74 - GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 3 - PHẦN I. NHÂN GIỐNG IN VITRO MỞ ĐẦU Giống là một khâu rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Công tác giống chủ yếu bao gồm các khâu thu thập nguồn gen, bảo quản quỹ gen, lai tạo, tuyển chọn, thử nghiệm giống và nhân giống. Nhờ phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nên ngày nay phần lớn các công việc này được thực hiện một cách khá thuận lợi và nhanh chóng. Sự hình thành và phát triển của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của những phát hiện sau đây trong lĩnh vực sinh lý thực vật và di truyền học phân tử: 1. Tính toàn thể (potipotency) của mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi tách rời; 2. Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn, từ đó tạo các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo; 3. Khả năng hấp thu ADN ngoại lai vào tế bào thực vật và khả năng chuyển gen để gây biến đổi (transformation) ở thực vật do ADN ngoại lai nhờ công nghệ gen (genetic engineering); 4. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật dẫn đến khả năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao để phục vụ cho công tác tạo giống; 5. Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast, tái sinh cây hoàn chỉnh từ protoplast lai (cybrid); 6. Khả năng loại trừ virus bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính; 7. Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh một số cây trồng; 8. Khả năng sử dụng phương pháp nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa; 9. Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm; 10. Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp mà không mất tính toàn thể của tế bào. Nuôi cấy mô tế bào thực vật không chỉ góp phần giải quyết một cách có hiệu quả công tác giống cây trồng mà còn mở ra một chân trời mới trong nghiên cứu di GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 4 - truyền thực vật, các cơ chế sinh tổng hợp ở thực vật, sinh lý phát triển, vai trò của phytohormone trong đời sống thực vật và nhiều vấn đề sinh học cơ bản khác. Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là công cụ để thu nhận các chất có hoạt tính sinh học (alcaloid, steroid...) qua nuôi cấy mô tế bào cây thuốc ở quy mô lớn. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 5 - CHƯƠNG I. NHỮNG NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ TRONG CÔNG TÁC VI NHÂN GIỐNG I. GIỚI THIỆU CHUNG. Khả năng kiến lập và duy trì các cơ quan và các mô thực vật (phôi, đỉnh sinh trưởng, rễ, hoa tế bào, callus, tế bào trần) trong nhân giống vô trùng để tái sinh những cây mới từ chúng là kết quả của những nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng trong các phòng thí nghiệm thực vật học, bệnh học và di truyền học từ cuối thế kỷ 19. Công việc này được gọi chung là nuôi cấy mô và cơ quan, nuôi cấy trong ống nghiệm, vi nhân giống và thuật ngữ mới nhất là công nghệ sinh học. Các quy trình chính của công nghệ sinh học bao gồm tái sinh chồi, tái sinh cây con, tạo callus và tạo phôi vô tính. Vi nhân giống khác với phương pháp nhân giống truyền thống ở chỗ quá trình được chia thành nhiều giai đoạn để có thể kiểm mỗi khía cạnh của quá trình tái sinh và phát triển cây con. Mỗi bước của trật tự công việc có thể được thao tác (hoặc lập chương trình) bằng cách chọn mẫu cấy và kiểm tra môi trường nhân giống. Nhìn sâu vào các cơ chế sinh học của mỗi quá trình vi nhân giống sẽ có thể tìm thấy khả năng ứng dụng nó trong phương pháp nhân giốngcây con phục vụ sản xuất đại trà. Trong chương này sẽ mô tả các công việc đã nêu và xác định các cơ sở hình thái, sinh lý và di truyền của quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trong nuôi cấy mô. Trước hết hãy cùng nhau nắm vững ý nghĩa của một số thuật ngữ quan trọng. • Nuôi cấy mô. Thuật ngữ này dùng cho một trật tự các thao tác dùng để duy trì và sinh trưởng của các mô thực vật (tạo callus, tế bào, tế bào trần), của các cơ quan trong nuôi cấy vô trùng. Kỹ thuật này dùng để nhân giống, cải biến genotype (tức tạo giống mới), sản xuất sinh khối chứa các sản phẩm hóa sinh học, nghiên cứu bệnh học thực vật, bảo quản phôi và các nghiên cứu khoa học. Tất cả các thao tác này đều được gọi chung là công nghệ sinh học. • Vi nhân giống. Thuật ngữ dùng để ám chỉ công việc nhân giống thực vật trong ống nghiệm. Có 4 giai đoạn phát triển đặc trưng của công việc này là kiến lập, nhân chồi, tạo rễ và làm cho cây con tái sinh thích nghi với khí hậu. • Mẫu cấy. Đó là mẫu thực vật dùng để nhân giống. Mẫu cấy có thể là đoạn cành cắt, lát mỏng, chồi hoặc hạt. • Tạo phôi vô tính. Sự hình thành phôi từ các tế bào sinh dưỡng chứ không phải từ hợp tử sau khi thụ phấn. • Callus. Sự hình thành các tế bào không phân hóa (thường là từ các tế bào nhu mô). GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 6 - II. TÁI SINH CÂY CON TRONG NUÔI CẤY MÔ. Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm có thể được sử dụng có hiệu quả trong hàng loạt kiểu thao tác cho nẩy mầm và tái sinh cây con nếu có biện pháp bảo vệ để tránh sự nhiễm tạp và khi những trở ngại mang tính di trưyền của mẫu cấy được khắc phục. 1. Nhân giống từ hạt trong điều kiện vô trùng. Thành công của phương pháp nhân giống từ hạt đạt được đối với hạt hoa lan. Hạt hoa lan rất bé, không chứa chất dinh dưỡng dự trữ và nói chung phụ thuộc vào quan hệ cộng sinh với một số loại nấm đặc hiệu để tiếp nhận chất dinh dưỡng. Người ta đã tính được khoảng 30.000 hạt trong một quả Catleya. Năm 1922 Levis Knudson thông báo kết quả nuôi cấy thành công hoa lan trong môi trường nuôi cấy không cộng sinh có cung cấp muối khoáng và đường saccharose. Cơ sở của sự thành công này là sự phát hiện rằng calcium hypochloride có thể được sử dụng để khử trùng bề mặt mà không gây độc cho phôi đang nẩy mầm. Quy trình này đã rút ngắn đáng kể thời gian nhân giống. Hiện nay nó vẫn được sử dụng để cho nẩy mầm các hạt lai. 2. Nuôi cấy phôi. Nuôi cấy phôi bao gồm tách phôi từ hạt và cho nó nẩy mầm trong môi trường vô trùng. Công dụng chủ yếu của kỹ thuật này là “cứu” các phôi không thể nẩy mầm bên trong hạt trước khi quả chín. Rất nhiều cây lai giữa các loài bước đầu được nhân giống bằng phương pháp này rất có kết quả nhưng đôi khi phôi bị hỏng trong quá trình phát triển (hiện tượng bất thụ của phôi vô tính). Những dòng chín sớm của nhiều loại cây ăn quả có xu hướng cho quả chín trước khi phôi của chúng phát triển đầy đủ. Trong điều kiện tự nhiên những phôi này dễ bị hỏng nhưng nếu tách chúng và nuôi chúng trong môi trường nuôi cấy thích hợp thì có thể làm cho chúng nẩy mầm. Ứng dụng thứ hai của nuôi cấy phôi là kích thích nẩy mầm những hạt chín đang ngủ để rút ngắn chu trình nhân giống. 3. Nuôi cấy tế bào trứng. Hệ thống này bao gồm nuôi cấy vô trùng trứng tách rời, noãn (đã thụ phấn hoặc chưa thụ phấn), và thực giá noãn gắn bên trong tế bào trứng. Mặc dù kỹ thuật này đã được sử dụng lần đầu tiên để nghiên cứu các vấn đề về cây ăn quả và sự phát triển của hạt, quy trình thích hợp đã được sử dụng trong nhân giống, đặc biệt là trong việc làm hoàn thiện bộ gen. Tế bào trứng chưa thụ tinh được tách và cấy trong môi trường dinh dưỡng cùng với phấn hoa và sau đó cho thụ phấn trong ống nghiệm. Quy trình này đã được sử dụng rất có hiệu quả đối với những cây có nhiều loại tế bào trứng. Phấn hoa có thể đặt trực tiếp vào thực giá noãn để ống phấn có thể phát triển trực tiếp vào tế bào trứng. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 7 - Tế bào trứng nuôi cấy rất có hiệu quả trong việc cứu phôi khi còn rất non nếu như chúng chưa bị tách khỏi cây mẹ. Đây là kỹ thuật đơn giản hơn nhiều so với nuôi cấy phôi. Các tế bào trứng có thể được khử trùng dễ dàng hơn và nói chung có thể sinh trưởng dễ dàng trong môi trường cơ bản có chứa muối khoáng, đường và đôi khi cần thêm một số phytohormone. Kỹ thuật nuôi tế bào trứng ít phổ biến và có nhu cầu dinh dưỡng khoáng thay đổi. Đối với đa số các loài môi trường cơ bản về muối khoáng vô cơ và đường là quan trọng, nhưng auxin có thể cần được sử dụng để kích thích sinh trưởng. III. NHÂN GIỐNG CÂY CON BẰNG BIỆN PHÁP NUÔI CẤY MÔ. Vi nhân giống phần lớn cây trồng bao gồm 4 giai đoạn chủ yếu được thực hiện trên các môi trường khác nhau và chịu các biện pháp kiểm tra khác nhau: - Giai đoạn I: Kiến lập, tức tạo các điều kiện cần thiết để tái sinh cây con từ mẫu cấy; - Giai đoạn II: Nhân cây giống - Giai đoạn III: Tạo rễ; - Giai đoạn IV: Làm cho các cây tái sinh thích nghi khí hậu. 1.Giai đoạn I. Kiến lập và ổn định mẫu cấy. Mục tiêu của giai đoạn I là đặt thành công mẫu cấy vào môi trường vô trùng bằng cách tránh bị nhiễm tạp và chuẩn bị đầy đủ môi trường trong ống nghiệm để tái sinh được cây con một cách ổn định. Giai đoạn này bao gồm các nội dung sau: 1/ Chọn mẫu cấy. Sự lựa chọn và duy trì nguồn thực vật là yếu tố quan trọng đảm bảo sự thành công của vi nhân giống. Có 3 khía cạnh đòi hỏi phải đặc biệt quan tâm: a/ Đặc điểm di truyền và phát sinh cá thể của nguồn thực vật dùng để nhân giống. b/ Kiểm tra nguồn gây bệnh. c/ Điều kiện sinh lý của cây cho phép sử dụng nó trong nhân giống. Trước hết, xác định đúng đặc điểm di truyền là rất quan trọng bởi vì sự nhầm lẫn ở giai đoạn này có thể làm nẩy sinh những vấn đề phức tạp và gây nên sự thiệt