Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật
Bảo quản vi sinh vật có tầm quan trọng đặc biệt, làm nền tảng cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh học, y học, nông nghiệp và môi trường. Nhiệm vụ quan trọng nhất của Bộ sưu tập chủng vi sinh vật là thu thập, làm giàu các chủng vi sinh vật hữu ích và bảo quản chúng theo phương pháp thích hợp. Việc thu thập các chủng vi sinh vật có thể bằng nhiều cách như phân lập, tuyển chọn từ môi trường, trao đổi trong nước và quốc tế. Các chủng vi sinh vật phải được định hướng theo từng mục tiêu cụ thể của từng Bộ sưu tập, ví dụ các chủng vi sinh vật chuẩn, các chủng có hoạt tính sinh học và các chủng làm cơ sở cho tra cứu khi nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật.
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Bài 13 Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật
1. Phiếu thông tin về chủng vi sinh vật bảo quản:
Đại học Quốc gia Hà Nội
Trung tâm Công nghệ Sinh học
Bảo tàng Giống chuẩn vi sinh vật (VTCC)
Thông tin chung về
chủng vi sinh vật bảo quản
1. Nấm sợi Nấm men Xạ khuẩn Vi khuẩn
2. Tên khoa học:
Giống (Genus) Loài (Species) Dưới loài (Subspecies)
Tên khác nếu có (synnonym):
3. Nguồn phân lập:
Nơi phân lập:
4. Thời gian bắt đầu bảo quản tại VTCC:
5. Người phân lập:
6. Người cung cấp: Nơi cung cấp:
7. Ký hiệu chủng VTCC:
8. Ký hiệu là lý lịch chủng từ các bảo tàng khác:
VTCC < < < < <
9. Chủng chuẩn (Type) Chủng tự nhiên (wild) Đột biến (cụ thể…)
10. Hình thức sinh sản:
11. Gây bệnh cho: Người Động vật Thực vật Không
12. Dấu chuẩn di truyền (nếu có):
13. Hình thái tế bào, khuẩn lạc:
14. Khả năng ứng dụng:
15. Tài liệu liên quan:
16. Các phương pháp bảo quản:
Đông khô Lạnh sâu Nitơ lỏng Cấy truyền
17. Môi trường nuôi cấy thích hợp:
18. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp:
19. Ghi chú:
2. Chức năng của bộ sưu tập vi sinh vật:
Bảo quản vi sinh vật có tầm quan trọng đặc biệt, làm nền tảng cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh học, y học, nông nghiệp và môi trường.
Nhiệm vụ quan trọng nhất của Bộ sưu tập chủng vi sinh vật là thu thập, làm giàu các chủng vi sinh vật hữu ích và bảo quản chúng theo phương pháp thích hợp. Việc thu thập các chủng vi sinh vật có thể bằng nhiều cách như phân lập, tuyển chọn từ môi trường, trao đổi trong nước và quốc tế. Các chủng vi sinh vật phải được định hướng theo từng mục tiêu cụ thể của từng Bộ sưu tập, ví dụ các chủng vi sinh vật chuẩn, các chủng có hoạt tính sinh học và các chủng làm cơ sở cho tra cứu khi nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật.
Bảo quản các chủng vi sinh vật là công việc không dễ dàng, xuất phát từ mục đích của bảo quản không những là duy trì khả năng sống của vi sinh vật, thuần chủng, tránh tạp nhiễm mà còn đảm bảo tính ổn định di truyền và các đặc tính sinh học trong suốt quá trình bảo quản. Thực tế không có một phương pháp bảo quản nào là vạn năng dùng chung cho các nhóm vi sinh vật mà mỗi nhóm vi sinh vật chỉ thích hợp với một vài phương pháp bảo quản nhất định.
Các chủng vi sinh vật bảo quản sẽ được cung cấp cho người sử dụng do đó nhiệm vụ quan trọng của bộ sưu tập vi sinh vật là thu thập và cung cấp các thông tin quan trọng của chủng vi sinh vật bảo quản cho người sử dụng như: môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, nhu cầu dinh dưỡng, tính an toàn sinh học, tên phân loại v.v..Như vậy yêu cầu đối với cán bộ phụ trách Bộ sưu tập vi sinh vật phải có kiến thức vững về vi sinh vật, di truyền học, sinh hoá học, sinh lý vi sinh vật và bệnh học vi sinh vật để kiểm soát được các đặc tính quan trọng của các vi sinh vật bảo quản.
3. Một số điểm lưu ý đối với một Bộ sưu tập vi sinh vật:
3.1. Duy trì khả năng sống của vi sinh vật bảo quản:
Trong khi thực hiện các phương pháp bảo quản và trong quá trình bảo quản các tế bào vi sinh vật sẽ bị chết do đó phải áp dụng phương pháp bảo quản thích hợp nhằm hạn chế thấp nhất khả năng chết của tế bào.
3.2. Quan tâm đến số lượng tế bào khi tiến hành bảo quản:
Trong quá trình bảo quản thì số lượng tế bào vi sinh vật giảm dần theo thời gian do vậy cần tính toán số lượng vi sinh vật tại thời điểm bảo quản thích hợp để duy trì số lượng vi sinh vật sống trong thời gian bảo quản dài.
3.3. Duy trì đặc tính di truyền ổn định của chủng vi sinh vật bảo quản:
Nói chung với các chủng vi sinh vật bảo quản, đặc biệt với các chủng vi sinh vật chuẩn, các chủng vi sinh vật có ứng dụng trong công nghiệp thì yêu cầu duy trì đặc tính sinh học, tính trạng di truyền là rất quan trọng. Các phương pháp bảo quản không thích hợp có thể dẫn đến đột biến hoặc mất plasmid. Vì vậy cần phải chọn các phương pháp bảo quản thích hợp cho các chủng này.
3.4. Tính thuần chủng của vi sinh vật bảo quản:
Chủng vi sinh vật từ khi bảo quản đến khi sử dụng phải đảm bảo thuần chủng đúng theo tên và các đặc điểm sinh học đặc trưng. Đây cũng là yêu cầu tiên quyết đối với công việc của một Bảo tàng vi sinh vật, do vậy mà các thao tác và phương pháp tiến hành phải được thực hiện sao cho hạn chế tới mức tối thiểu đối với các chủng bảo quản nhằm tránh tạp nhiễm.
3.5. Kinh phí cần cho Bộ sưu tập vi sinh vật:
Kinh phí bao gồm kinh phí về lương cho cán bộ, thiết bị, vật tư hoá chất, nhà xưởng và điện nước tiêu hao. Các kinh phí này tuỳ thuộc vào quy mô của Bộ sưu tập giống vi sinh vật và phương pháp bảo quản, phạm vi dịch vụ thực hiện đối với khách hàng.
Tên Bảo tàng vi sinh vật (viết tắt)
Nước
Số lượng chủng vi sinh vật
ATCC
Mỹ
73507
DSMZ
Đức
14460
NBRC
Nhật
18300
Bảng 1. Quy mô của một số bộ sưu tập giống vi sinh vật.
STT
Tên Bảo tàng vi sinh vật, Nước
Giá thành (USD)
1
ATCC, Mỹ
80
2
CBS, Hà Lan
60
3
VKM, Nga
45
4
Thái Lan
40
Bảng 2. Giá thành cho bảo quản mỗi chủng vi sinh vật hàng năm
3.6. Bảo quản các chủng có giá trị:
Đối với các chủng vi sinh vật có giá trị thì tuỳ theo yêu cầu mà cần thực hiện nhiều phương pháp khác nhau cũng như bảo quản tại các nơi khác nhau để hạn chế khả năng mất các đặc tính quý cũng như mất chủng do những rủi ro ngẫu nhiên (cháy nổ, động đất, chiến tranh v.v..).
3.7. Cung cấp chủng giống cho khách hàng:
Đối với các chủng cần cung cấp nhiều cho khách hàng (hoặc các chủng cần cho nghiên cứu thường xuyên) thì cần phải bảo quản với số lượng lớn với phương pháp thích hợp cho việc vận chuyển đến khách hàng.
3.8. Cung cấp các thông tin liên quan đến chủng bảo quản:
Chất lượng của Bộ sưu tập giống liên quan đến các số liệu, thông tin về từng chủng vi sinh vật bảo quản. Do đó, nhu cầu nghiên cứu để thu nhận các thông tin cần thiết cung cấp cho khách hàng là rất quan trọng.
3.9. Kiểm tra chất lượng chủng vi sinh vật bảo quản:
Các chủng của Bộ sưu tập vi sinh vật cần phải tuân theo các qui định nghiêm ngặt kiểm tra định kỳ theo từng thời gian bảo quản như tỷ lệ sống sót, mức tạp nhiễm, thay đổi đặc tính di truyền như dấu chuẩn di truyền, sự tồn tại của plasmid, đặc điểm phân loại, khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học…Một trong các cách đánh giá khả năng sống sót của chủng vi sinh vật bảo quản là dựa theo phương trình sau:
t = 8Log(So/Log So-Log Sac)
Trong đó: t - Thời gian của mẫu bảo quản trong ampoule.
So - Số lượng tế bào sống sót ngay sau khi bảo quản.
Sac - Số lượng tế bào sống sót ngay sau khi tiến hành thí nghiệm.
3.10. Cơ sở dữ liệu của Bộ sưu tập vi sinh vật:
Ngày nay, khi tin học là lĩnh vực xâm nhập và làm thay đổi sâu sắc đến mọi lĩnh vực đời sống thì việc quản lý Bộ sưu tập vi sinh vật không còn là một ngoại lệ. Người ta đã ứng dụng các phần mềm máy tính phù hợp để quản lý các chủng vi sinh vật bảo quản, các thông tin liên quan cũng như chương trình kiểm tra chất lượng định kỳ. Sử dụng tin học là công việc có tiện ích lớn, nó giúp cho người quản lý nắm bắt được toàn bộ thông tin cũng như lý lịch của các chủng vi sinh vật và dễ dàng tra cứu, làm báo cáo khoa học theo các tiêu chí riêng. Nói chung với các bộ sưu tập có số lượng vi sinh vật không lớn thì có thể sử dụng phần mềm: Microsoft Access, Access Visual Basic.
4. Giới thiệu chung về một số phương pháp bảo quản vi sinh vật:
Trong phần này chúng tôi mô tả các phương pháp được dùng chung cho các đối tượng vi sinh vật chính (vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn, vi tảo).
4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật:
Hình 1. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch
Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản này như: Staphylococi, Coliform... có thể sống được vài năm theo cách này. Cho dù phương pháp này là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng đang dùng cho nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:
- Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc.
- Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản.
- Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản.
- Tốn nhiều công sức để cấy truyền.
- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp.
- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền.
* Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản:
Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men. Theo phương pháp này các chủng vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất mang phổ biến như sau:
a. Trên đất, cát và silicagel. Các nghiên cứu cho thấy là bào tử nấm có thể sống 4-5 năm khi bị làm khô trong đất mà không bị thay đổi các đặc tính sinh học. Ngày nay silicagel là chất mang được dùng phổ biến và có hiệu quả đối với bảo quản nấm men, nấm sợi.
b. Bảo quản trên giấy: Các chủng nấm men và nấm sợi được làm khô trên giấy và sau đó được bọc bằng giấy bạc và đựng trong hộp kín. Ưu thế của phương pháp này là bảo quản được lượng mẫu lớn.
c. Bảo quản trên gelatin: Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật trong môi trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu được làm khô trong đĩa petri. Phương pháp này có thể bảo quản được vi khuẩn trong vài năm.
Nhìn chung, không có phương pháp nào là vạn năng cho bảo quản các nhóm vi sinh vật khác nhau. Thực ra là rất khó khi đánh giá một cách đầy đủ xét theo mọi yêu cầu đã được đặt ra ở trên. Chính vì vậy mà các phương pháp bảo quản phải được kiểm nghiệm thực tế với từng loại vi sinh vật, từ kết quả đó có thể chọn ra phương pháp thích hợp hoặc đồng thời sử dụng các phương pháp khác nhau.
4.2. Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp:
a. Phương pháp đông khô:
Hình 2. Đông khô vi sinh vật.
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật.
b. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying):
Ngoài phương pháp đông khô như mô tả ở trên, còn có phương pháp đông khô trực tiếp. Khác biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước. Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn không có khả năng sống trong nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông. Các thông số quan trọng cần được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là:
- Tuổi của vi sinh vật bảo quản.
- Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật.
- Tốc độ đông khô.
- Nhiệt độ đông khô thấp nhất.
- Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu.
Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu. Thông thường theo phương pháp này vi sinh vật được bảo quản từ 10-20 năm. Nói chung cả hai phương pháp này có nhiều ưu điểm so với các phương pháp trước như thời gian bảo quản lâu, tiết kiệm được công sức và sai sót nhãn mác và tạp nhiễm. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành thiết bị. Độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau. Hơn thế nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi trường thích hợp một số lần để phục hồi các đặc tính sinh học.
4.3. Phương pháp bảo quản lạnh sâu:
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C).
Hình 3. Bảo quản lạnh sâu
Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C và -196° C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30° C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut.
Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ... Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô.
Hình 4. Bảo quản trong nitơ lỏng.
5. Một số phương pháp phổ biến sử dụng trong bảo quản các nhóm vi sinh vật cụ thể:
Trong phần này chúng tôi giới thiệu cụ thể một số phương pháp thông dụng nhất.
5.1. Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn:
Bảo quản vi khuẩn:
a. Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization):
Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới. Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi sinh vật và bảo quản được trong một thời gian dài.
Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tại NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh).
1, Nuôi vi khuẩn cho đông khô:
Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log.
2, Chuẩn bị đệm mẫu:
Có thể dùng một trong hai loại đệm sau:
+ Đệm huyết thanh- inositol;
Meso-inositol: 5 gam
Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml
Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào các bình vô trùng.
+ Đệm inositol:
Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam
Meso-inositol: 5 gam
Nước cất: đủ 100 ml.
Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121OC.
3, Chuẩn bị dịch tế bào:
Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bảo quản. Thông thường có thể thu sinh khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào. Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010 (đối với vi sinh vật không có bào tử). Mật độ trên có thể giảm với các vi sinh vật có bào tử. Hai đệm pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trường hợp enterobacteria thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn dịch của vi khuẩn.
4, Chuẩn bị ống đông khô:
Ống đông khô được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống được thanh trùng khô hoặc khử trùng theo phương pháp thông thường.
5, Chuẩn bị mẫu trước khi đông khô:
Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml. Chú ý mọi thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía trên của ống đông khô.
6, Bước tiền đông khô:
Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước có thể bị lạnh đông tạo đá. Trước khi tiến hành đông khô mẫu được chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày ở trên) sau đó bước tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ thống đông khô và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành khoảng 3 giờ.
7, Tạo chỗ thắt trên ống đông khô:
Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt. Việc tạo vết thắt được thực hiện với hệ thống đèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay các cơ sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn và tạo vết thắt trên thiết bị tự động.
8, Hậu đông khô:
Trong bước này mẫu lại tiếp tục được làm khô cho đến độ ẩm cuối cùng đạt khoảng 1%. Thời gian cho bước này có thể thay đổi từ 1-2 giờ.
9, Hàn ống đông khô:
Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm và cẩn thận. Trước hết phải tiến hành khoá van và sau đó mới thực hiện thao tác hàn ống đông khô.
10, Kiểm tra độ chân không của ống đông khô:
Người ta sử dụng thiết bị là đèn phát hiện mức độ chân không. Với các mẫu đạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt. Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc màu tím đậm.
11, Kiểm tra khả năng sống của mẫu:
Đếm số lượng tế bào là phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản. Việc đếm được thực hiện trước khi và ngay sau khi đông khô. Các bước kiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượng của mẫu đông khô. Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm. Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì yêu cầu phải được tiến hành theo đúng qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy.
12, Bảo quản mẫu:
Mẫu thông thường được bảo quản tại 4OC hay nhiệt độ phòng.
b. Phương pháp giữ trong lạnh sâu:
1, Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu:
Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log.
2, Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106.
3, Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0.05% để phát hiện các ống bị rò rỉ).
Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng.
Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3 OC/phút để đạt tới nhiệt độ -30OC ban đầu. Sau đó mẫu được làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 10-15 OC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100OC đến -80 OC). Hiện nay, đã có các thiết bị làm lạnh sâu được chương trình hoá với tốc độ mong muốn. Tuy nhiên, cũng có thể đơn giản hơn là mẫu ban đầu được đặt trong đá khô sau đó lại đưa vào tủ lạnh sâu và đặt thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ -65OC.
4, Hoạt hoá mẫu: mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ l
