Hoạt tính kháng viêm của các muối glucosamin

HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA CÁC MUỐI GLUCOSAMIN LƯU VĂN CHÍNH1 - NGÔ BÍCH ANH2 TRẦN VŨ HÙNG2 - VŨ MẠNH HÙNG3 VŨ HÀ3 - NGÔ THỊ THUẬN2 - CHÂU VĂN MINH1 1Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên-TTKHTN&CNQG 2Trờng Ðại học khoa học tự nhiên - ĐHQG Hà Nội 3Học viện Quân y - Bộ Quôc phòng I. MỞ ÐẦU Chitin và các dẫn xuất của nó có các đặc tính qúi như kháng nấm, kháng khuẩn, rất dễ phân huỷ sinh học, bởi vậy chitin và các dẫn xuất đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau [1, 2, 3]. Trong những năm gần đây các hoạt tính hạ cholesterol và kháng viêm của các dẫn xuất từ chitin được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm [4]. Ðối với các muối của glucosamin như glucosamin hydroclorid, glucosamin sulfat, glucosamin photsphat... thì hoạt tính kháng viêm được thể hiện tương đối mạnh, đặc biệt là viêm khớp. Các muối này tan rất tốt trong nước và có khả năng xâm nhập vào khớp rất nhanh do đó có hiệu quả một cách nhanh chóng [5]. Trong khuôn khổ công trình này chúng tôi nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của glucosamin hydroclorua (Glu-1). Các hoạt tính chống viêm khớp của glucosamin hydroclorid, glucosamin sulfat (Glu-2) và glucosamin phosphat (Glu-3) đã được chúng tôi nghiên cứu và sẽ báo cáo trong các công trình tiếp theo. II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Tổng hợp glucosamin hydroclorid Glucosamin hydroclorid được tổng hợp bằng cách thuỷ phân chitin bằng dung dịch HCl đặc (37%) trên nồi cách thuỷ trong 2 giờ. Sản phẩm được kết tinh và tinh chế lại đến độ sạch cần thiết. 2. Phổ của glucosamin hydroclorid Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Glu-1 được đo trên máy AVANCE 500 Bruker của Viện Hoá học - Trung tâm KHTN & CNQG, dung môi sử dụng là CDCl3.(D2O). 3. Hoạt tính kháng viêm của glucosamin hydroclorid Các nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của Glu-1 bao gồm nghiên cứu tác dụng giảm đau quặn, giảm đau trên mô hình gây đau bởi tấm nóng, tác dụng ức chế tăng tính thấm thành mạch, tác dụng ức chế phù viêm cấp và tác dụng ức chế viêm mạn thực nghiệm trên chuột nhắt trắng và chuột cống trắng [6]. - Tác dụng giảm đau quặn được nghiên cứu theo mô hình gây đau quặn của Vander Wende C, Witkin LB, Anderson KW trên chuột nhắt trắng. - Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau bởi tấm nóng được nghiên cứu theo phương pháp của Woolfe. G và Mc. Donald. AD. - Khả năng ức chế tăng tính thấm của thành mạch được khảo sát với chuột nhắt trắng theo mô hình của Jayne và các cộng sự, thuốc chuẩn sử dụng là Diclofenac - Khả năng ức chế phù viêm cấp của Glu-1 được nghiên cứu theo phương pháp của Piccini và các cộng sự trên chuột cống trắng. - Tác dụng ức chế viêm mạn thực nghiệm được áp dụng theo mô hình gây u hạt thực nghiệm trên chuột cống trắng theo phương pháp của Winter và Poster. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1- Kết quả tổng hợp và xác định cấu trúc Các dữ liệu về phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Glu-1 và sự minh chứng cấu trúc được đưa ra ở hình 1 và bảng 1 : Dựa vào phổ 13C-NMR ta tính được hàm lượng giữa dạng  :  là 89,67 : 10,33 Hình 1: Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Glucosamin hydroclorid Dạng ghế  Dạng ghế  Proton  (ppm) J (Hz) Proton  (ppm) J (Hz) H1 5,50 JH1-H2 : 3,6 H1 5,00 JH1-H2 : 8,4 H2 3,50 JH1-H2 : 3,6 H2 3,05 JH1-H2 : 8,4 JH2-H3 : 10,6 JH1-H2 : 10,6 H3,H4,H5,H6 3,54 - 3,9 H3,H4,H5,H6 3,05 - 3,9 Dạng ghế  Dạng ghế  Cac bon  (ppm) Cac bon  (ppm) Cac bon  (ppm) Cac bon  (ppm) C1 89,570 C4 70,134 C1 93,166 C4 76,602 C2 54,729 C5 72,021 C2 57,168 C5 70,135 C3 70,031 C6 60,607 C3 72,449 C6 60,960 Bảng 1: Các dữ kiện cấu trúc của glucosamin hydroclorid 2- Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của Glu-1 a) Kết quả tác dụng ức chế phù viêm cấp Hiệu quả tác dụng ức chế phù viêm cấp của Glu-1 và diclofenac trên mô hình gây phù viêm cấp chân chuột được trình bày ở các bảng 2 và 3 Bảng 2: Thể tích phù viêm chân chuột các thời điểm sau gây viêm Thể tích chân chuột ở các thời điểm sau gây viêm * Nhóm nghiên cứu Thể tích ban đầu 1 giờ 3 giờ 5 giờ 7 giờ 9 giờ 24 giờ 48 giờ Nhóm chứng NMSL (n=12) 5,41 ±0,37 6,98 ±0,42 8,39 ±0,49 9,35 ±0,45 9,52 ±0,42 10,08 ±0,56 7,67 ±0,46 6,96 ±0,52 Nhóm dùng Glu-1 (n=15) 5,53 ±0,57 6,64 ±0,46 7,54 ±0,58 8,18 ±0,43 8,39 ±0,53 8,74 ±0,64 7,19 ±0,51 6,56 ±0,58 Nhóm dùng Diclofenac (n=15) 5,57 ±0,54 6,49 ±0,56 7,18 ±0,48 7,85 ±0,49 7,98 ±0,58 8,21 ±0,56 6,42 ±0,62 6,36 ±0,48 Ðơn vị đo thể tích chân chuột là đơn vị tính của thể tích kế. Kết quả trên bảng 1 cho thấy, mức độ phù viêm cấp ở chân chuột ở nhóm điều trị bằng Glu-1 ở các thời điểm sau khi dùng thuốc đều thấp hơn so với nhóm chứng không dùng gì. Tuy nhiên, mức độ phù viêm chân chuột không giảm nhiều như nhóm dùng diclofenac. Tỷ lệ % ức chế phù viêm cấp cụ thể được trình bày ở bảng 3 Bảng 3: Mức độ ức chế phù viêm cấp chân chuột ở các nhóm nghiên cứu (X) (I %: tỷ lệ % ức chế phù viêm cấp chân chuột, V: thể tích chân (ttc); n: số chuột) Mức độ ức chế phù viêm ở các thời điểm sau điều trị Nhóm dùng Glu-1 (n=15) (2) Nhóm dùng diclofenac (n = 15) (3) Thời điểm sau gây viêm Nhóm chứng (n=12) Vc (1) Vt Vc-Vt I (%) Vt Vc-Vt I (%) Sau 1 giờ 1,57 1,11 0,64 29,3 1,11 0,92 41,4 Sau 3 giờ 2,69 1,81 0,98 24,3 1,81 1,61 40,1 Sau 5 giờ 3,94 2,65 1,36 35,1 2,65 2,28 42,1 Sau 7 giờ 4,11 2,86 1,39 30,4 2,86 2,45 40,3 Sau 9 giờ 4,67 3,21 1,52 31,2 3,21 2,61 44,1 Sau 24 giờ 2,26 1,16 0,84 47,8 1,16 0,95 57,9 Sau 48 giờ 1,55 1,03 0,56 33,5 1,03 0,79 49,0 X ± SD 33,05 ± 4,24 44,9 ± 5,97 p1-2 < 0,05 ; p1-3< 0,05 với p là độ không tin cậy. SD: độ lệch chuẩn Mức độ phù viêm cấp chân chuột ở nhóm điều trị bằng Glu-1 với các mức liều 50mg/kg thể tích chân chuột giảm 33,05% nhưng vẫn thấp hơn diclofenac với mức liều sừ dụng 30mg/kg là 44,9% trong cùng điều kiện. Như vậy Glu-1 có tác dụng ức chế viêm cấp rõ và ở mức độ khá (so với diclofenac). b) Kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế tăng tính thấm thành mạch mạc treo ruột. Kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế tăng tính thấm thành mạch mạc treo ruột trên chuột bằng cách tiêm phúc mạc được trình bày ở bảng 4 Bảng 4: Hiệu quả ức chế tăng tính thấm thành mạch mạc treo ruột của Glu-1. STT Nhóm nghiên cưu n Liều độ thuốc (kg thể trọng) Đường dùng thuốc Nồng độ chất mầu (x105M) Tỷ lệ ức chế (%) P 1 Nhóm chứng NMSL 12 0,587 ±0,083 2 Glu-1 12 5 ml Tiêm phúc mạc 0,453 22,82 p1-2* < ±0,072 0,05 3 diclofenac 12 2,0 g 0,415 ±0,073 29,31 p2-3* < 0,05 p1-2*: So Sánh giữa nhóm dùng Glu-1 và nhóm chứng. p2-3 *: So sánh giữa nhóm dùng Glu-1 và diclofenac Kết quả nghiên cứu cho thấy, Glu-1 có tác dụng ức chế 22,8% lượng chất màu thoát ra khỏi lòng mạch so với nhóm chứng (P<0,05). Hiệu lực tác dụng của Glu-1 thấp hơn so với diclofenac, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). c) Tác dụng ức chế sự phát triển viêm mạn thực nghiệm Hiệu lực ức chế sự phát triển u hạt thực nghiệm của Glu-1 và diclofenac được trình bày ở bảng 5 Bảng 5: Tác dụng giảm trọng lượng u hạt thực nghiệm của các thuốc STT Nhóm nghiên cứu n Liều độ thuốc * Đường dùng thuốc Trọng lượng trung bình u hạt Tỷ lệ giảm trọng lượng u hạt (%) P 1 Nhóm chứng NMSL 14 - 148,21 ±11,63 2 Nhóm dùng Glu-1 16 50 mg 114,82 ±12,56 22,52 < 0,05 3 Nhóm dùng diclofenac 16 30 mg Tiêm phúc mạc 98,82 ±4,62 33,32 < 0,05 * Liều độ thuốc được tính theo 1 kg thể trọng chuột trong 1 ngày, chia 2 lần. Bảng 5 cho thấy. Glu-1 khi dùng liên tục trong 7 ngày (50mg/kg/thể trọng/ngày), có tác dụng giảm trọng lượng u hạt thực nghiệm 22,52% so với nhóm chứng (P<0,05) thấp hơn so với thuốc chuẩn diclofenac (30mg/kg/thể trọng/ngày) là 33,32% (P<0,05) và như vậy Glu-1 có tác dụng giảm sự phát triển viêm mạn thực nghiệm rõ rệt. d) Tác dụng giảm đau quặn của Glu-1 Sau khi tiêm phúc mạc dung dịch acid acetic 20 phút, số cơn đau quặn của chuột được trình bày ở bảng 6 Bảng 6: Tác dụng giảm đau quặn của Glu-1 STT Nhóm nghiên cứu n Liều thuốc (cho1kg thể trọng) Đường dùng thuốc Số cơn đau qu ạn trung bình Tỷ lệ giảm đau (%) P 1 Nhóm chứng NMSL 20 Tiêm phúc mạc 56 ±7 2 Nhóm dùng Glu- 1 20 50 mg 40 ±6 28,57 < 0,05 3 Nhóm dùng diclofenac 20 30 mg 33 ± 7 41,07 < 0,05 Trên mô hình đau quặn, Glu-1 (50mg/kg) có tác dụng ức chế 28,57% có cơn đau quặn so với 41,07% của diclofenac (20mg/kg). Như vậy Glu-1 có tác dụng giảm cơn đau quặn trên chuột tương đối yếu hơn so với diclofenac. e) Tác dụng giảm đau của Glu-1 trên mô hình gây đau bằng tấm nóng Mô hình gây đau bởi tấm nóng là mô hình nghiên cứu tác dụng của các thuốc giảm đau theo cơ chế trung tâm kiểu morphin. Các kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 7 Bảng 7: Tác dụng giảm đau của Glu-1 trên mô hình gây đau bằng tấm nóng Thời gian đáp ứng (giây) STT Nhóm nghiên cưu n Liều thuốc (../kg) Trước khi dùng thuốc Sau khi dùng thuốc Tỷ lệ giảm đau (%) P 1 Nhóm chứng NMSL 15 16,36 ±4,29 16,43 ±4,28 2 Nhóm dùng Glu- 1 15 50 mg 16,21 ±4,25 16,92 ±3,46 4,38 > 0,05 3 Nhóm dùng diclofenac 15 30 mg 16,72 ±5,37 18,21 ±4,29 9,19 > 0,05 4 Nhóm dùng morphin 15 4 mg 16,59 ±4,56 26,87 ±7,78 61,51 < 0,05 Trên mô hình này Glu-1 và diclofenac đều không có tác dụng giảm đau. Các thông số đau ở thời điểm trước và sau khi dùng thuốc không có ý nghĩa thống kê (p>0,05), còn mức độ giảm đau của morphin là 61,51%. V. KẾT LUẬN - Ðã tổng hợp Glu-1 và xác định được cấu trúc bằng các phương pháp hiện đại, có độ chính xác cao. - Ðã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của Glu-1 trên chuột nhắt trắng và chuột cống trắng. Kết quả cho thấy Glu-1 có khả năng kháng viêm rõ rệt so với diclofenac là thuốc chuẩn hiện nay vẫn dùng ở cùng điều kiện thử nghiệm. Summary Glucosamine salts were synthesized from chitin. The structure of these compounds were elucidated by spectral methods. The results of study on anti-inflammatory activity showed that these derivatives have significant activity in comparision with diclofenac in the same experimental conditions. Tài liệu tham khảo 1. Keisuke Kurita (1988), Chemistry and Application of Chitin and Chitosan, Polymer Degradation and Stability, 59, pp. 117-120 2. Chempluvier, B; F. Marchal and P.G. Rouxhet (1987). Immobilization of lactase on yeast cells retained in a glass woll matrix, Enzyme Microb. Technol. 11(7), pp 422 - 430 3. Muzzarelli. R.A.A (1983). Chitin and its derivatives: New trends of applied research, Carbohydrate polymers, 3, pp. 53 - 57 4. Lưu Văn Chính, Châu Văn Minh , Phạm Hữu Ðiển, Vũ Mạnh Hùng, Ngô Thị Thuận (2000). Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol máu của N,N,N-trimetylchitosan, Tạp chí Dược học số 9, Tr. 9 - 11. 5.Mc. Alindon T (2001). Glucosamine for osteoarthritis: dawn of a new era? Lancet 357: pp. 251 - 256. 6. Lê Minh Hà (2002). Nghiên cứu các thành phần hóa học của cây xà sàng (Cnidium monnieri (L.) Cuss.) và cây gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) Việt Nam. Luận án tiến sĩ Hóa học. ___________________________ Tạp chí Dược học -Số 4/2003Trang 21-24