Khóa luận Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen gus vào giống đậu tương ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị cùng bạn bè, những người mà đã luôn quan tâm, ủng hộ và là chỗ dựa cho tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận này, cũng như trong cuộc sống. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Phương Thuận - chủ nhiệm bộ môn Hóa sinh - trường ĐH Khoa học tự nhiên Hà Nội, đã giúp đỡ hết sức tận tình để tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối tới TS. Nguyễn Văn Đồng đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ to lớn, những ý kiến đóng góp quý báu, sự hướng dẫn tận tình của Ths. Hà Văn Chiến trong quá trình tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền nông nghiệp về sự giúp đỡ nhiệt tình trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐH Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian học tập cũng như khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó. Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2010 Bùi Thúy Hiền KÝ HIỆU VIẾT TẮT AS : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) BAP : 6-benzylaminopurin CaMV : Cailiflower Mosaic Virus Car : Carbenicillin DNA : Deoxirionucleic Acid FAO : Food and Agriculture Organization GFP : Green Fluorescent Protein Gus : β-1,4-Glucuronidase HPT : Hygromycin Phosphotransferase ISAAA : International Services for the Acquisition of Agri-Biotech Ka : Kanamycin LB : Luria Bertani L-Cys : L-Cystein MS : Murashige and Skoog, 1962 α-NAA : α-Napthalene acetic acid NPT II : Neomycin Phosphotransferase II PCR : Polymerase Chain Reaction Ti-plasmid : Tumor-Including Plasmid T-DNA : Transfer-DNA USDA : United States Department of Agriculture Vir : virulence DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây 9 Bảng 2. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới trong những năm gần đây 9 Bảng 3. Các nước nhập khẩu đậu tương hàng đầu Châu Á (nghìn tấn) 10 Bảng 4. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam những năm gần đây 10 Bảng 5. Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes) 16 Bảng 6. Nồng độ và thời gian khử trùng của Ethanol và NaClO 37 Bảng 7. Kết quả thí nghiệm thử nồng độ và thời gian khử trùng 37 Bảng 8. Kết quả biểu hiện của ĐT26 đối với các chủng vi khuẩn 39 Bảng 9. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch 40 Bảng 10. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp 42 Bảng 11. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp 45 Bảng 12. môi trường MS (PH=5,6-5,8) 58 Bảng 13. Môi trường LB (PH = 7) 58 Bảng 14. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu 59 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i KÝ HIỆU VIẾT TẮT ii DANH MỤC HÌNH VẼ iii DANH MỤC BẢNG iv MỤC LỤC v MỞ ĐẦU 1 Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu chung về đậu tương 4 1.1.1. Nguồn gốc 4 1.1.2. Phân loại 4 1.1.3. Vai trò của đậu tương 4 1.1.4. Sinh thái đậu tương 6 1.1.5. Đặc tính của cây đậu tương 6 1.1.5.1. Tính chịu lạnh 6 1.1.5.2. Tính chịu hạn 7 1.1.5.3. Tính chịu đựng và khả năng phục hồi 7 1.1.5.4. Biến động di truyền về phản ứng với yếu tố bất lợi 8 1.1.6. Đặc tính sinh học của giống đậu tương ĐT26 8 1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam 9 1.2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới 9 1.2.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 10 1.3. Vi khuẩn A.tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật 11 1.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumefaciens 11 1.3.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 12 1.3.3. Cấu trúc và chức năng của T-ADN 13 1.3.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens 14 1.3.5. Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid 14 1.3.6. Các gen chỉ thị chọn lọc và sàng lọc 15 1.3.7. Hệ thống vector pCAMBIA 17 1.3.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens 19 1.4. Cây trồng biến đổi gen và cây đậu tương biến đổi gen 21 1.4.1. Cây trồng biến đổi gen trên thế giới và việt nam 21 1.4.2. Cây đậu tương biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam 22 Chương II - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Vật liệu nghiên cứu 24 2.1.1. Các thiết bị thí nghiệm 24 2.1.2. Hóa chất và môi trường 24 2.1.3. Vi khuẩn 24 2.1.4. Đối tượng nghiên cứu 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng 24 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu. 24 2.2.2. Chuyển gen gus vào đậu tương 25 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26 25 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của OD dịch khuẩn đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26. 27 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen gus vào ĐT26. 29 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26. 30 Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen 32 Thí nghiệm 7: Phân tích cây chuyển gen T0 34 2.3. Các chỉ tiêu đánh giá 35 Chương III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng 36 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu 36 3.2. Chuyển gen gus vào đậu tương 38 3.2.1. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26 38 3.2.2. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của OD dịch khuẩn đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26. 40 3.2.3. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu suất chuyển gen gus vào ĐT26. 42 3.2.4. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26 44 3.2.5. Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen 47 3.2.6. Thí nghiệm 7: Tách ADN và phân tích cây chuyển gen 49 Chương IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 58 1. Môi trường MS (PH=5,6-5,8) 58 2. Môi trường LB (PH = 7) 58 3. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu 59 MỞ ĐẦU Đậu tương (Glycine max(L.) Merr) hay còn gọi là đậu nành, là cây công nghiệp ngắn ngày có hiệu quả kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao. Khó có thể tìm thấy cây trồng nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu tương. Là thức ăn có giá trị dinh dưỡng cao, rất giàu protein thực vật, chứa nhiều loại vitamin và chứa một lượng lớn axit béo chưa bão hòa rất tốt cho sức khỏe. Trong công nghiệp, đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng,…nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu. Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật. Trong nông nghiệp, đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, phân bón. Ngoài ra, đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt, 1ha trồng đậu tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60kg N [10]. Tuy nhiên, với tình hình khí hậu trên trái đất đang biến đổi không ngừng, nhiệt độ trái đất càng ngày càng tăng cao, từ đó dẫn đến các thiên tai (lũ lụt, hạn hán, bệnh dịch,…) gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng, phát triển của các loại cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng. Vì thế để tăng năng suất và chất lượng thì ngoài việc thực hiện chăm sóc, gieo trồng tốt còn phải tập trung nghiên cứu nhằm cải thiện các loại giống để chúng có thể cho năng suất cao, chống chịu được các điều kiện ngoại cảnh bất lợi tốt nhờ những ứng dụng to lớn của công nghệ sinh học hiện đại. Trong hơn một thập niên vừa qua, công nghệ sinh học nói chung và cây trồng biến đổi gen nói riêng đã có những bước phát triển vượt bậc. Từ khoảng 1 triệu ha đầu tiên năm 1996 trồng tại Châu Mỹ, đến tháng 12 năm 2009, toàn thế giới đã có 134 triệu ha cây trồng biến đổi gen [20], tăng 80 lần so với năm 1996 và tăng 9 triệu ha so với năm 2008 (125 triệu ha). Trong đó đậu tương biến đổi gen là loại cây biến đổi gen nổi bật nhất, có tới 69,7 triệu ha chiếm 52% trong tổng diện tích cây biến đổi gen toàn thế giới và chiếm tới 75% trong tổng diện tích 90 triệu ha trồng đậu tương trên thế giới [14]. Các đánh giá mới nhất về tác động của cây chuyển gen cho thấy trong khoảng thời gian từ năm 1996 đến năm 2008, lợi ích kinh tế trị giá 51,9 tỷ USD mà cây biến đổi gen mang lại được tạo ra từ 2 nguồn: thứ nhất là giảm chi phí sản xuất (50%) và tăng năng suất thu hoạch bền vững (50%). Số sản lượng tăng thêm này nếu không sử dụng các giống cây chuyển gen thì sẽ cần thêm 62,6 triệu ha để tạo ra chúng. Vì thế công nghệ sinh học giúp tiết kiệm diện tích trồng trọt, giảm được lượng thuốc trừ sâu ở mức 365 triệu kg, ứng với 8,4% tổng lượng thuốc trừ sâu sửu dụng trong nông nghiệp. Chỉ tính riêng trong năm 2008, lượng khí CO2 được cây biến đổi gen hấp thụ là 14,4 tỷ kg, tương đương với lượng khí thải mà 7 triệu chiếc oto thải ra. Nước ta là một nước nông nghiệp với đặc điểm nổi bật là mật độ dân số cao vào loại nhất thế giới, bình quân đất nông nghiệp trên đầu người chỉ đạt khoảng 765m2/người. Diện tích đang ngày càng thu nhỏ lại, nhường chỗ cho thành thị, đường giao thông, khu dịch vụ và phát triển công nghiệp. Ước tính hàng năm chúng ta mất 50000-70000 ha đất canh tác. Trong khi đó biến đổi khí hậu toàn cầu, kéo theo sự xâm mặn nghiêm trọng, mưa gió bất thường gây ra hạn hán, lũ lụt, dịch bệnh đang đe dọa an ninh lương thực của đất nước. Liên hợp quốc đã xếp Việt Nam vào một trong 8 nước có nguy cơ về an ninh lương thực ở Châu Á. Đặc biệt, trong điều kiện mất đất canh tác, với mức tăng dân số như hiện nay, ngành nông nghiệp phải cung cấp thêm cho đất nước ít nhất 1 triệu tấn lương thực hàng năm. Đậu tương là loại cây trồng được quan tâm và chú trọng nhất hiện nay, theo thống kê đến tháng 03/2010 diện tích trồng đậu tương của nước ta ở thời điểm này là 123,9 nghìn ha [12], sản lượng bình quân là 20 tạ/ha [11]. Tuy vậy nhưng hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu một số lượng lớn đậu tương 2300 nghìn tấn (2009) [11], đứng thứ hai trên toàn Châu Á sau Indonesia. Bên cạnh đó, cây trồng biến đổi gen nói chung và đậu tương biến đổi gen nói riêng đã được chính phủ Việt Nam cho phép trồng rộng rãi bắt đầu từ năm 2011. Xuất phát từ thực tế đó trong thời gian thực tập tốt nghiệp, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen gus vào giống đậu tương ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”. ♦ Mục đích và yêu cầu của đề tài: - Mục đích: Xây dựng quy trình công nghệ chuyển gen gus có hiệu quả nhất để từ đó áp dụng chuyển các gen khác như gen kháng hạn, gen kháng sâu bệnh, gen kháng thuốc diệt cỏ,…nhằm cải tạo giống đậu tương của Việt Nam. - Yêu cầu: Trong khuôn khổ một bản đồ án tốt nghiệp, chúng tôi tập trung nghiên cứu cụ thể các nội dung sau: * Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng ban đầu * Nghiên cứu quy trình biến nạp hiệu quả nhất, trong đó có: Xác định chủng vi khuẩn có khả năng chuyển gen hiệu quả nhất. Xác định mật độ quang (OD) của dung dịch khuẩn thích hợp nhất Xác định thời gian biến nạp thích hợp nhất Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm đến hiệu quả biến nạp. Xây dựng quy trình tái sinh cây đậu tương chuyển gen Phân tích cây chuyển gen T0 Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về đậu tương 1.1.1. Nguồn gốc Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh. Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu tương có nguyên sản ở Châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cây đậu tương được thuần hóa ở Trung Quốc qua nhiều triều đại tiền phong kiến và được đưa vào trồng trọt và khảo sát có thể trong triều đại Shang năm 1700-1100 trước B.Cds. 1.1.2. Phân loại Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine max(L.) Merr theo khóa phân loại của Hymowitz, T. and C.A. Newell [19] căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể, nó thuộc: Bộ đậu : Fabales Họ đậu : Fabaceae Phân họ : Leguminosae Chi : Glycine Đậu tương trồng có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40 là loại cây trồng mang lại giá trị kinh tế cũng như giá trị dinh dưỡng cao. 1.1.3. Vai trò của đậu tương Cây đậu tương là nguồn thực phẩm có giá trị kinh tế cao, giàu đạm, giàu chất béo, giàu các chất khoáng và các vitamin. Vì thế, cây đậu tương được gọi là “Ông hoàng trong các loại cây họ Đậu”, “vàng mọc trên đất”, “cây đỗ thần”,… Sở dĩ được đánh giá như vậy bởi lẽ cây đậu tương mang lại những giá trị rất toàn diện: - Giá trị thực phẩm Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng từ 35,5-40% (trong khi đó hàm lượng protein trong gạo chỉ 6,2-12%; ngô 9,8-13,2%; thịt bò 21%; thịt gà 20%; cá 17-20% và trứng 13-14,8%) , lipit từ 15-20%, lipit của đậu tương chứa một tỷ lệ cao các axit béo chưa no (khoảng 60-70%) có hệ số đồng hóa cao, mùi vì thơm như axit linoleic chiếm 52-65%, oleic từ 25-36%, linolenolic khoảng 2-3% [2] giúp hạn chế lượng cholesterol trong máu, đề phòng xơ vữa động mạch và cao huyết áp, hidratcacbon từ 15-16% và nhiều loại vitamin quan trọng cho sự sống [4]. Đậu tương cũng chứa nguồn chất xơ hòa tan trong nước nên có tác dụng kích thích như động ruột, có lợi cho việc tiêu hóa và phòng ngừa bệnh ung thư ruột già. Những người mắc bệnh tiểu đường nên sử dụng đậu tương bởi chất xơ hòa tan và protein trong đậu giúp điều chỉnh lượng đường  trong máu rất tốt. Theo bản thống kê, trên toàn thế giới có khoảng 1,2 vạn sản phẩm làm từ đậu tương. Ở Nhật Bản, hàng năm dùng tới 460-500 vạn tấn đậu tương (bình quân mỗi người ăn khoảng 37-40 kg) trong đó có khoảng 80% dùng làm dầu ăn và thức ăn chăn nuôi, 20% dùng làm thực phẩm. Ở Mỹ, người ta làm ra khoảng 2500 loại thực phẩm từ đậu tương. Các sản phẩm được tiêu thụ trên thị trường gồm bột đậu nành đóng gói, đậu phụ, sữa đậu nành, sữa chua đậu nành,… - Giá trị về mặt công nghiệp Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu. Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật. - Giá trị về mặt nông nghiệp ♦ Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc 1kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Toàn cây đậu tương (thân, lá, rễ, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc. Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao: N 6,2% ; P2O5 0,7% ; K2O 2,4% . Vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt [2]. ♦ Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt. Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón N. Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N trong thân chiếm 0,05% trong lá chiếm 0,19% [2]. 1.1.4. Sinh thái đậu tương Đậu tương Glycine max(L.) Merr có đặc điểm: - Rễ đậu tương có rễ chính và rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 30-50cm và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ tập trung nhiều ở tầng đất 7-8cm rộng 30-40cm2 [1] Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần. - Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông nhỏ, thân trung bình có 14-15 lóng.Tùy theo giống và thời vụ mà chiều dài lóng có sự khác nhau thường biến động từ 3-10 cm. Toàn thân có 1 lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cả cuống lá. - Lá cây đậu tương có 3 loại lá: * Lá mầm (lá tử diệp): lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh * Lá nguyên (lá đơn): Lá nguyên xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3 ngày và mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối xứng nhau. * Lá kép: Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét. Lá chét mọc sole, lá kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu. - Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm. Màu sắc của hoa thay đổi tùy theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng. Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân. Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1-10 hoa và thường có 3-5 hoa. Hoa đậu tương thuốc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy. - Số quả đậu tương biến động từ 2-20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới 400 quả trên một cây. Một quả chứa từ 1-5 hạt, nhưng hầu hết các giống thường từ 2-3 hạt. Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, có chiều dàu từ 2-7cm hoặc hơn. Quả có màu sắc biến động từ vàng đến trắng tới vàng sẫm hoặc đen. - Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: hình tròn, hình bầu dục, tròn det,... Rốn hạt của các giống khác nhau thì có màu sắc và hình dạng khác nhau. 1.1.5. Đặc tính của cây đậu tương 1.1.5.1. Tính chịu lạnh Nhiệt độ dưới 150C có ảnh hưởng xấu đến nảy mầm của hạt và sự hút nước. Nhiệt độ dưới 13-150C, giảm ra hoa, đậu quả và ảnh hưởng tới quang hợp và toàn bộ máy quang hợp. Tổn thương do lạnh thường gây hại màng tế bào,do màng tế bào không có khả năng giữ cấu trúc của nó ở nhiệt độ thấp. Các mô, chẳng hạn như hạt phấn đang lớn dễ nhạy cảm với nhiệt độ thấp hơn các mô khác và dẫn đến sự bất dục ở cây đậu tương [2]. 1.1.5.2. Tính chịu hạn Tránh hạn là cơ chế một số thời kỳ sinh trưởng phát triển nhạy cảm của cây đậu tương tránh và thoát các ảnh hưởng trực tiếp của khô hạn. Việc tránh hạn đối với những vùng có khô hạn dài ngày thì rất khó thực hiện. Ta chỉ có thể chọn thời vụ mà khô hạn xẩy ra ít nhất để hạn chế ảnh hưởng của nó tới sinh trưởng và năng suất cây. Hướng chọn giống có tính giảm sự mất nước cho thấy có nhiều triển vọng. Nên chọn những cây có bộ rễ sâu phân nhánh nhiều, do đó có thể hút nước từ tầng đất sâu và rộng. Chịu hạn hoặc do giảm sự mất nước, hoặc cây chịu được sự mất nước. Sự mất nước qua khí khổng phụ thuộc chủ yếu vào độ mở của khí khổng và sau đó là hướng lá và các yếu tố khác. Khi hạn xảy ra, lỗ khí khổng lá đóng ngay lại, dẫn đến giảm sự bốc hơi nước và quang hợp, nhưng sự giảm bốc hơi nước mạnh hơn. Giữa các giống có sự khác nhau về lớp phấn và lông trên lá. Lớp phấn trên lá có tác dụng giảm sự bốc hơi [2]. 1.1.5.3. Tính chịu đựng và khả năng phục hồi Cho dù đặc tính giảm sự mất nước của cây tốt đến đâu chăng nữa, cây vẫn bị tổn thương hoặc chết do khô hạn kéo dài. Có rất ít thông tin về khả năng phục hồi của cây đậu tương sau khi bị mất nươc nặng. Cây bị lạnh trong thời gian ra hoa, thì hầu hết những hoa ra trong thời kỳ đó bị rụng và sau đó vài tuần cây có thể ra hoa và đậu quả nếu thời tiết ấm. Thiếu nước trong giai đoạn sẽ làm giảm thời gian ra hoa. Thiếu nước trong giai đoạn làm quả sẽ ảnh hưởng tới năng suất nhiều hơn so với thiếu nước trong giai đoạn ra hoa. Qua các nghiên cứu người ta có thể dự đoán được giai đoạn nào cây bị ảnh hưởng nhiều do bất lợi (khô hạn, lạnh…). Tuy nhiên, bởi vì người ta khó có thể dự đoán khi nào bất lợi xảy ra, cho nên người nông dân khó có thể ứng dụng được những kết quả nghiên cứu đó nếu như điều kiện tưới không có. Tốt nhất, nên chọn giống có thời gian ra hoa dài và có khả năng phục hồi tốt sau khi bị hạn hoặc bị lạnh [2]. 1.1.5.4. Biến động di truyền về phản ứng với yếu tố bất lợi Ở đậu tương có những biến động di truyền cho nhiều đặc tính khác nhau, chẳng hạn như độ sâu và mật độ rễ, tập tính sinh trưởng hữu hạn và vô hạn, thời gian sinh trưởng, độ nhạy cảm với quang chu kỳ, tính chịu đựng nhiệt độ thấ