Kĩ thuật đông lạnh tế bào động vật

Tradigrada Wood frog - Đông lạnh (ĐL) là gì? - Mục đích của ĐL? - Đối tượng được đông lạnh - Các biến đổi của tế bào trong quá trình ĐL - Những thuận, bất lợi của pp ĐL - Quá trình đông lạnh / giải đông - Kĩ thuật đông lạnh / giải đông - KĨ THUẬT ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Đặng Thị Tùng Loan dttloan@hcmus.edu.vn PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc 08/05/2015 LƯỢC SỬ 1776 : Spallanzani, bảo quản tinh trùng người ở nhiệt độ thấp. 1866 : Mantagazza, trữ tinh trùng người bằng đông lạnh. 1949 : Polge và cs, glycerol trong bảo quản tinh trùng bằng phương pháp đông lạnh. 1940 – 1950 : Chang, đông lạnh trứng và phôi thỏ 1953 : Sherman, đông lạnh TT thành đá khô  giải đông  thụ tinh bình thường. 1957 : Lin, Sherman và Willet, trứng chuột có thể sống sau khi được trữ trong môi trường chứa glycerol ở nhiệt độ -50C. 1958 : Sherman và Lin, IVF thành công từ trứng chuột sau khi được trữ trong môi trường chứa glycerol ở nhiệt độ -100C -200C, không có tế bào trứng sống sót. LƯỢC SỬ 1960 – 1970 : Mazur, tốc độ làm lạnh và làm ấm tối ưu; Mazur, Leibo, Whittingham, đông lạnh phôi chuột (chậm, DMSO) 1984 : Zeilmarker, đông lạnh phôi người 1980s : Luyet, thủy tinh hóa trong đông lạnh trứng và phôi; Rall, TTH + CPA cao ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO Trữ ở nhiệt độ ở mức nitơ lỏng (-196oC) Tế bào ở dạng huyền phù (+chất bảo quản lạnh - cryoprotectant) Tế bào dừng phân chia và các hoạt động trao đổi chất (trạng thái tiềm sinh)  Mô, tế bào soma, tế bào sinh dục, phôi, MỤC ĐÍCH Ổn định nguồn bảo quản (1) Giảm thiểu sự biến đổi KG, biểu hiện gen, đảm bảo ổn định DT (2) Ngăn ngừa sự lão hoá tế bào (TB) (3) Ngăn cản quá trình biệt hoá TB (4) Giảm rủi ro nhiễm vi khuẩn và sự chết TB (5) Giảm rủi ro biến đổi cấu trúc và sự thay đổi hình thái Hạn chế rủi ro, tốn kém do nguyên nhân kĩ thuật (1) Giảm thiểu các thao tác, nuôi cấy không cần thiết nhiều dòng TB cùng một lúc, cùng một nơi, tiết kiệm thời gian và công sức (2) Giảm chi phí nuôi cấy (3) Giảm sự nhiễm chéo giữa các dòng TB khác nhau trong in vitro Ứng dụng thực tế (1) Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng (2) Thuận lợi cho việc bảo tồn gen (3) Thuận lợi cho vận chuyển (4) Thuận lợi cho việc thương mại hoá CÁC BƯỚC BẢO QUẢN TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH Tế bào và mô tiếp xúc với chất bảo quản (bước cân bằng) Làm lạnh mẫu xuống nhiệt độ âm Trữ ở nhiệt độ -196oC Làm ấm và giải đông Pha loãng và loại bỏ các chất bảo quản lạnh trước khi tái nuôi cấy SINH HỌC ĐÔNG LẠNH CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH 1. Sự hình thành tinh thể nước đá 2. Độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh 3. Tốc độ khử nước 4. Thể tích của tế bào 5. Hoạt động của enzyme 6. Sự tủa muối và pH của dung dịch 7. Sự hình thành bọt khí 1. SỰ HÌNH THÀNH TINH THỂ NƯỚC ĐÁ 4 yếu tố quyết định kiểu hình tinh thể nước đá  Nhiệt độ ở thời điểm biến đổi trạng thái  Tốc độ làm lạnh  Thành phần các chất hoà tan trong dung dịch  Nồng độ dung dịch Bên trong và bên ngoài tế bào ĐỘ THẨM THẤU CỦA MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH * Sự hình thành đá * Nồng độ chất hòa tan tăng * Độ thẩm thấu? TỐC ĐỘ KHỬ NƯỚC * Tính thấm nước của màng tế bào (Lp) * Năng lượng hoạt hóa của tính thấm nước (E) * Tỉ lệ diện tích bề mặt (SA) / thể tích của tế bào (V) * Loại chất bảo quản lạnh * Tốc độ làm lạnh (B) SỰ GIẢM THỂ TÍCH CỦA TẾ BÀO - Tính thấm nước của màng tế bào và năng lượng hoạt hóa của tính thấm - Tốc độ làm lạnh - Thực tế và tính toán? HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME * Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa của các phân tử phản ứng. * Giảm: - Từ 37C  7C: giảm 8 lần - Từ 20C ↓: giảm 2-3 lần theo Q10 - ↓↓: Tác hại đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt động của các protein Vai trò của các polyol VD: G6PH (0C) ĐỘ pH DUNG DỊCH  Cân bằng acid-base + Chất bảo vệ lạnh Glycerol: tính base yếu DMSO: tính base mạnh Propanediol, methanol + Nồng độ chất bảo vệ lạnh  Sự phù hợp về nhiệt độ và pH SỰ HÌNH THÀNH BỌT KHÍ Khi nhiệt độ hạ, tinh thể đá tạo các lỗ rò rỉ Khi giải đông, hình thành bọt khí. Kích thước bọt khí: 25-100 µm, tỉ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh Số lượng bọt khí tỉ lệ thuận với tốc độ làm lạnh Ảnh hưởng của hệ đệm bicarbonate THUYẾT HAI YẾU TỐ Quy trình đông lạnh- giải đông tối ưu Tổn thương “dung dịch” Tổn thương đá nội bào Tốc độ làm lạnh Sức sống ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH ĐẾN TẾ BÀO Hiện tượng Phản ứng của tế bào Giảm nhiệt độ Biến đổi lipid màng Giải trùng hợp bộ xương tế bào Tăng nồng độ chất hòa tan Co thẩm thấu Tăng nồng độ ion Tác động trực tiếp lên màng tế bào, làm hòa tan protein màng Khử nước Mất ổn định lớp đôi lipid Kết tủa muối Thay đổi pH dung dịch, ảnh hưởng hoạt động của các protein Sự hình thành bọt khí Tổn thương cơ học đối màng và bộ xương tế bào Dung dịch trở nên quá nhớt Hạn chế quá trình khuếch tán, thẩm thấu Thay đổi pH Biến tính protein Tế bào bị đặc lại Tổn thương màng PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH Đông lạnh chậm chương trình (programmed slow freezing method) Đông lạnh nhanh ba bước (stepwise freezing method) Đông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa) (vitrification) ĐÔNG LẠNH CHẬM CHƯƠNG TRÌNH Sử dụng chất bảo quản với nồng độ thấp (1-2M) Tốc độ làm lạnh chậm (0,1 – 5oC/phút trong giai đoạn giảm nhiệt xuống -80C) Hạ nhiệt tự động Sự khử nước diễn ra suốt quá trình làm lạnh Cân bằng giữa tốc độ nước rời khỏi tế bào và nước chuyển sang dạng đá Chi phí cao (máy tự động), tổn thương tế bào do tác động của nồng độ chất tan. ĐÔNG LẠNH BA BƯỚC Nồng độ chất bảo quản thấp Tốc độ làm lạnh nhanh Hạ nhiệt: ba bước (4, -20, -80) Khử nước không hoàn toàn, hình thành đá nội bào Cải tiến – Đông lạnh in situ ĐÔNG LẠNH CỰC NHANH (THỦY TINH HÓA) Nồng độ chất bảo quản cao (>5M) Tốc độ làm lạnh cực nhanh (2000-25000oC/phút) Tế bào bị khử nước nhờ tiếp xúc với nồng độ chất bảo quản cao, nước ở dạng băng vô định hình Có thể ảnh hưởng đến tế bào do nồng độ chất bảo quản cao Quy trình thực hiện dễ dàng, nhanh chóng, chi phí thấp BIẾN ĐỔI CỦA TẾ BÀO KĨ THUẬT ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO CHUẨN BỊ Tế bào  Chọn phương pháp Chất bảo quản lạnh  Môi trường đông lạnh Dụng cụ - Thiết bị NGUỒN TẾ BÀO Chỉ đông lạnh những tế bào tăng sinh tốt và không nhiễm  Loại/khả năng sống, tăng trưởng/sinh lí/số lượng/phương pháp tế bào được nuôi  Tình trạng tốt nhất (log phase, mật độ 90%)  Quan sát bên ngoài và kiểm tra nhiễm + Nuôi trong MT không kháng sinh vài lần trước kiểm tra + Quan sát trực tiếp dưới KHV – Thay môi trường nuôi 24 tiếng trước khi đông lạnh CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG CỦA TẾ BÀO ĐỐI VỚI MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH 1. Thể tích (V) và diện tích bề mặt tế bào (A) 2. Tính thấm nước của tế bào (Lp) 3. Loại và nồng độ chất bảo quản lạnh 4. Tốc độ làm lạnh (B) PP ĐÔNG LẠNH TỐI ƯU (Làm lạnh cân bằng)  Tỉ lệ tế bào sống cao nhất  Phương pháp – Làm lạnh chậm để rút nước ra khỏi tế bào – Ngăn sự hình thành tinh thể – Sử dụng chất bảo quản lạnh – Nhiệt độ bảo quản dưới -130oC – Giải đông nhanh để giảm thiểu sự hình thành của tinh thể đá MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH Đệm Hepes Huyết thanh??? Kháng sinh Muối Đường Chất bảo quản lạnh CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH Khái niệm Đặc tính Phân loại + Chất bảo quản ngoại bào: BSA, FBS, saccharide, disaccharide (trehalose, lac, suc), trisaccharide (raffinose), polymer (PVP, polyethylenglycol) + Chất bảo quản nội bào: methanol, ethanol, ethylen glycol, 1,2- isopropandiol, glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO) Tác dụng CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH Hoạt động: khử nước và bù nước Nồng độ thích hợp? A. Quá trình đông lạnh B. Quá trình tan đông C. Quá trình bù nước D. Quá trình tái nuôi cấy Sự thay đổi khối lượng tế bào trong quá trình đông lạnh/giải đông QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH KHÔNG CHẤT BẢO QUẢN QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH KHÔNG CHẤT BẢO QUẢN QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH CÓ CHẤT BẢO QUẢN QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH CÓ CHẤT BẢO QUẢN CHẤT PHỤ TRỢ ĐÔNG LẠNH - Không thấm vào tế bào - Bảo vệ tế bào trong quá trình bù nước - Thường là mono-,di- hoặc tri-saccharide A. Quá trình đông lạnh B. Quá trình tan đông C. Quá trình bù nước khi có đường Sucrose D. Tái nuôi cấy Sự thay đổi khối lượng tế bào trong quá trình đông lạnh có sucrose MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH VÀ KIỂU TẾ BÀO TẾ BÀO BÁM DÍNH TẾ BÀO Ở DẠNG HUYỀN PHÙ 90% môi trường mới 10% chất bảo quản lạnh (DMSO) 45% môi trường mới 45% môi trường cũ 10% chất bảo quản lạnh (DMSO) NGUYÊN LiỆU, THIẾT BỊ ĐÔNG LẠNH Nitơ lỏng  Không màu, không mùi, không dễ cháy, không độc  Nhiệt độ -196oC (thể lỏng) và -156oC (thể hơi) Thiết bị trữ lạnh  Tủ lạnh (4oC), tủ âm (-20oC, -80oC)  Thiết bị trữ lạnh bằng Nitơ lỏng (-196oC) Không kiểm soát nhiệt độ Có kiểm soát nhiệt độ THIẾT BỊ ĐÔNG LẠNH THIẾT BỊ DÙNG TRONG ĐÔNG LẠNH Bể ổn nhiệt Nhiệt độ trong bình trữ nitơ lỏng THIẾT BỊ DÙNG TRONG ĐÔNG LẠNH Cryotube (cryovial, ampoule) THIẾT BỊ DÙNG TRONG ĐÔNG LẠNH Cryotop Straw ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO ĐÔNG LẠNH PHÔI QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 1. Kiểm tra tình trạng tế bào 2. Bảo dưỡng và thu nhận tế bào 3. Sử dụng chất bảo vệ lạnh phù hợp 4. Sử dụng dụng cụ trữ phù hợp với điều kiện đông lạnh 5. Đánh dấu 6. Điều chỉnh tốc độ làm lạnh 7. Trữ tế bào ở nhiệt độ dưới -130oC 8. Kiểm tra mức nitơ lỏng 9. Ghi nhận định kì QUY TRÌNH THU NHẬN TẾ BÀO Quy trình thu nhận tế bào bám dính Quy trình thu nhận tế bào huyền phù Loại môi trường cũ bằng cách hút bỏ Li tâm thu cặn tế bào và loại bỏ môi trường cũ Rửa đĩa tế bào bằng PBS vài lần Rửa tế bào bằng PBS vài lần Tách toàn bộ tế bào khỏi đĩa nuôi bằng dung dịch trypsin. Sau đó, bổ sung chất ức chế protease để làm ngừng hoạt động của trypsin. Li tâm thu cặn tế bào và loại bỏ trypsin, chất ức chế protease Rửa tế bào bằng PBS vài lần Xác định số lượng tế bào sống Xác định số lượng tế bào sống Huyền phù cặn tế bào vào môi trường ĐL Huyền phù cặn tế bào vào môi trường ĐL Phân phối dịch tế bào vào các ống đông lạnh Phân phối dịch tế bào vào các ống đông lạnh Chuyển các ống đông lạnh vào thiết bị làm lạnh (tùy theo phương pháp đông lạnh) Chuyển các ống đông lạnh vào thiết bị làm lạnh (tùy theo phương pháp đông lạnh) Loại môi trường cũ Huyền phù vào môi trường đông lạnh Tách tế bào Li tâm thu cặn tế bào Bổ sung vào dụng cụ đông lạnh Đưa vào nhiệt độ đông lạnh phù hợp Đếm mật độ tế bào Giải đông ở 37 C Loại môi trường bảo quản Tái nuôi cấy trong môi trường mới Đếm mật độ tế bào GIẢI ĐÔNG Rã đông nhanh - 37oC trong bể ổn nhiệt - Giảm thiểu sự hình thành tinh thể Pha loãng từ từ để ngăn sốc áp suất thẩm thấu Quá trình bù nước của tế bào Loại chất bảo quản lạnh: + Thay, ủ trong môi trường mới + Li tâm nhẹ QUY TRÌNH GIẢI ĐÔNG  Lấy các ống đông lạnh tế bào ra khỏi bình nitơ lỏng.  Kiểm tra cẩn thận các nhãn và nắp.  Giữ ống đông lạnh ngoài không khí khoảng 30 giây.  Đặt toàn bộ ống đông lạnh nhúng vào bình ổn nhiệt 37oC và lắc nhẹ cho đến khi tan hết.  Rửa tế bào bằng li tâm dịch tế bào đã giải đông trong môi trường nuôi mới.  Tái huyền phù tế bào trong môi trường mới.  Trải các tế bào vào đĩa nuôi cấy với môi trường bình thường. Mật độ tế bào ban đầu phải cao. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TẾ BÀO SAU GIẢI ĐÔNG Nhuộm xác định số lượng tế bào sống, chết Nuôi cấy sau giải đông Sức sống tế bào sau giải đông: tăng sinh CÁC VẤN ĐỀ KHI ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 1. Trong quá trình thu nhận và thao tác tế bào + Sự tiếp xúc giữa tế bào và chất bảo quản lạnh + Việc duy trì lượng lớn tế bào ở nhiệt độ phòng và pH 2. Trong quá trình làm lạnh + Làm lạnh quá nhanh, quá chậm hay bị gián đoạn + Sử dụng chất bảo quản lạnh không phù hợp hay sử dụng nồng độ chất bảo quản không thích hợp 3. Trong quá trình trữ lạnh + Quá trình chuyển tế bào vào bình trữ lạnh + Nhiệt độ đông lạnh không được duy trì ổn định 4. Trong quá trình giải đông + Giải đông chậm + Phương pháp loại chất bảo quản lạnh không phù hợp ĐÔNG LẠNH TINH TRÙNG Thành tựu trong y học và chăn nuôi Sự thay đổi của tinh trùng trong quá trình đông lạnh - Sự nguyên vẹn của cực đầu - Sự di động - Khả năng thụ tinh Dung dịch bảo quản - Đệm pH, ASTT, bảo vệ lạnh - CPA thấm, không thấm, đệm, muối, kháng sinh + DD citrate – đường + DD sữa loãng + DD dựa vào lactose + DD dựa vào saccharose + DD dựa vào raffinose + DD dựa vào Tris + ĐÔNG LẠNH TINH TRÙNG PP đông lạnh - Đông lạnh chậm - Thủy tinh hóa - Đông khô Đông khô - Đông lạnh, khử áp suất và bổ sung nhiệt - Thuận lợi: nhẹ, không cần trữ lạnh, chất lượng được duy trì - Bất lợi: chi phí cao, thời gian xử lí dài Đông khô và đông lạnh - Thời gian - Chất lượng, độ di động của TT - PP thụ tinh sau giải đông - Chi phí - Lưu trữ ĐÔNG LẠNH TRỨNG Thành tựu trong y học và chăn nuôi Trứng được sử dụng trong đông lạnh - Trứng trưởng thành, chưa trưởng thành, mô buồng trứng - Trứng ở giai đoạn metaphase II và giai đoạn túi mầm - SA/V thấp Phác đồ đông lạnh - Chậm – cân bằng - Thủy tinh hóa – không cân bằng Ứng dụng ĐÔNG LẠNH PHÔI PP đông lạnh - Đông lạnh chậm - Đông lạnh nhanh - Thủy tinh hóa Ý nghĩa Quy trình chung - Chọn phôi - Môi trường đệm và chất bảo quản lạnh - Nạp phôi vào dụng cụ đông lạnh + Cọng rạ (straw) + Cryoloop + Cryovial + Cryotop - Thiết bị làm lạnh và đông - Giải đông - Đánh giá chất lượng: hình thái, khả năng sống và phát triển ĐÔNG LẠNH PHÔI Các ảnh hưởng 3 giai đoạn: * 15oC đến -5oC : lipid và vi ống * -5oC đến -80oC : tinh thể đá và màng bào tương * -50oC đến -150oC: stress thẩm thấu và màng trong suốt Từ phôi: • Giai đoạn phát triển phôi: sự nhạy cảm của thoi vô sắc • Tỉ lệ mảnh vỡ tế bào • Kĩ thuật tạo phôi • Tuổi của phụ nữ cho trứng Đông lạnh tinh trùng trong màng Zona pellucida THAM KHẢO [1] Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2009). Bảo quản tế bào gốc. Công nghệ tế bào gốc, NXB Giáo dục. [2] Phạm Văn Phúc, Đỗ Ngọc Hân, Trương Hải Nhung, Đặng Hoàng Lâm, Trần Thị Thanh Khương (2009). Công nghệ hỗ trợ sinh sản, NXB Y học [3] Ryan JA. General guide for cryogenically storing animal cell cultures. Corning Incorporated Life Sciences. [4] Ryan JA. Cryogenic preservation and storage of animal cells. Corning Incorporated Life Sciences. [5] Özkavukcu S, Erdemli E (2002). Cryopreservation: Basic knowledge and biophysical effects. Journal of Ankara medical school, Vol. 24, No. 4.