LƯỢC SỬ
1776 : Spallanzani, bảo quản tinh trùng người ở nhiệt độ thấp.
1866 : Mantagazza, trữ tinh trùng người bằng đông lạnh.
1949 : Polge và cs, glycerol trong bảo quản tinh trùng bằng phương pháp đông lạnh.
1940 – 1950 : Chang, đông lạnh trứng và phôi thỏ
1953 : Sherman, đông lạnh TT thành đá khô giải đông thụ tinh bình
thường. 1957 : Lin, Sherman và Willet, trứng chuột có thể sống sau khi được
trữ trong môi trường chứa glycerol ở nhiệt độ -50C.
1958 : Sherman và Lin, IVF thành công từ trứng chuột sau khi được trữ
trong môi trường chứa glycerol ở nhiệt độ -100C <--> -200C, không có tế bào
trứng sống sót.
59 trang |
Chia sẻ: nguyenlinh90 | Lượt xem: 1115 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Kĩ thuật đông lạnh tế bào động vật, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Tradigrada
Wood frog
- Đông lạnh (ĐL) là gì?
- Mục đích của ĐL?
- Đối tượng được đông lạnh
- Các biến đổi của tế bào trong quá trình ĐL
- Những thuận, bất lợi của pp ĐL
- Quá trình đông lạnh / giải đông
- Kĩ thuật đông lạnh / giải đông
-
KĨ THUẬT ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO
ĐỘNG VẬT
Đặng Thị Tùng Loan
dttloan@hcmus.edu.vn
PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc
08/05/2015
LƯỢC SỬ
1776 : Spallanzani, bảo quản tinh trùng người ở nhiệt độ thấp.
1866 : Mantagazza, trữ tinh trùng người bằng đông lạnh.
1949 : Polge và cs, glycerol trong bảo quản tinh trùng bằng phương pháp
đông lạnh.
1940 – 1950 : Chang, đông lạnh trứng và phôi thỏ
1953 : Sherman, đông lạnh TT thành đá khô giải đông thụ tinh bình
thường. 1957 : Lin, Sherman và Willet, trứng chuột có thể sống sau khi được
trữ trong môi trường chứa glycerol ở nhiệt độ -50C.
1958 : Sherman và Lin, IVF thành công từ trứng chuột sau khi được trữ
trong môi trường chứa glycerol ở nhiệt độ -100C -200C, không có tế bào
trứng sống sót.
LƯỢC SỬ
1960 – 1970 : Mazur,
tốc độ làm lạnh và làm
ấm tối ưu; Mazur,
Leibo, Whittingham,
đông lạnh phôi chuột
(chậm, DMSO)
1984 : Zeilmarker, đông
lạnh phôi người
1980s : Luyet, thủy tinh
hóa trong đông lạnh
trứng và phôi; Rall, TTH
+ CPA cao
ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO
Trữ ở nhiệt độ ở mức nitơ lỏng (-196oC)
Tế bào ở dạng huyền phù (+chất bảo quản
lạnh - cryoprotectant)
Tế bào dừng phân chia và các hoạt động trao
đổi chất (trạng thái tiềm sinh)
Mô, tế bào soma, tế bào sinh dục, phôi,
MỤC ĐÍCH
Ổn định nguồn bảo quản
(1) Giảm thiểu sự biến đổi KG, biểu hiện gen, đảm bảo ổn định DT
(2) Ngăn ngừa sự lão hoá tế bào (TB)
(3) Ngăn cản quá trình biệt hoá TB
(4) Giảm rủi ro nhiễm vi khuẩn và sự chết TB
(5) Giảm rủi ro biến đổi cấu trúc và sự thay đổi hình thái
Hạn chế rủi ro, tốn kém do nguyên nhân kĩ thuật
(1) Giảm thiểu các thao tác, nuôi cấy không cần thiết nhiều dòng TB
cùng một lúc, cùng một nơi, tiết kiệm thời gian và công sức
(2) Giảm chi phí nuôi cấy
(3) Giảm sự nhiễm chéo giữa các dòng TB khác nhau trong in vitro
Ứng dụng thực tế
(1) Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng
(2) Thuận lợi cho việc bảo tồn gen
(3) Thuận lợi cho vận chuyển
(4) Thuận lợi cho việc thương mại hoá
CÁC BƯỚC BẢO QUẢN TẾ BÀO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH
Tế bào và mô tiếp xúc với chất bảo quản (bước cân bằng)
Làm lạnh mẫu xuống nhiệt độ âm
Trữ ở nhiệt độ -196oC
Làm ấm và giải đông
Pha loãng và loại bỏ các chất bảo quản lạnh trước khi tái
nuôi cấy
SINH HỌC ĐÔNG LẠNH
CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH
ĐÔNG LẠNH
1. Sự hình thành tinh thể nước đá
2. Độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh
3. Tốc độ khử nước
4. Thể tích của tế bào
5. Hoạt động của enzyme
6. Sự tủa muối và pH của dung dịch
7. Sự hình thành bọt khí
1. SỰ HÌNH THÀNH TINH THỂ NƯỚC ĐÁ
4 yếu tố quyết định kiểu hình tinh thể nước đá
Nhiệt độ ở thời điểm
biến đổi trạng thái
Tốc độ làm lạnh
Thành phần các chất
hoà tan trong dung
dịch
Nồng độ dung dịch
Bên trong và bên ngoài tế
bào
ĐỘ THẨM THẤU CỦA MÔI TRƯỜNG
ĐÔNG LẠNH
* Sự hình thành đá
* Nồng độ chất hòa tan
tăng
* Độ thẩm thấu?
TỐC ĐỘ KHỬ NƯỚC
* Tính thấm nước của màng tế
bào (Lp)
* Năng lượng hoạt hóa của
tính thấm nước (E)
* Tỉ lệ diện tích bề mặt (SA) /
thể tích của tế bào (V)
* Loại chất bảo quản lạnh
* Tốc độ làm lạnh (B)
SỰ GIẢM THỂ TÍCH CỦA TẾ BÀO
- Tính thấm nước của màng tế bào và năng lượng hoạt hóa của tính thấm
- Tốc độ làm lạnh
- Thực tế và tính toán?
HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME
* Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc vào năng
lượng hoạt hóa của các phân tử phản ứng.
* Giảm:
- Từ 37C 7C: giảm 8 lần
- Từ 20C ↓: giảm 2-3 lần theo Q10
- ↓↓: Tác hại đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt
động của các protein
Vai trò của các polyol
VD: G6PH (0C)
ĐỘ pH DUNG DỊCH
Cân bằng acid-base
+ Chất bảo vệ lạnh
Glycerol: tính base yếu
DMSO: tính base mạnh
Propanediol, methanol
+ Nồng độ chất bảo vệ lạnh
Sự phù hợp về nhiệt độ và pH
SỰ HÌNH THÀNH BỌT KHÍ
Khi nhiệt độ hạ, tinh thể đá tạo các lỗ rò rỉ
Khi giải đông, hình thành bọt khí.
Kích thước bọt khí: 25-100 µm, tỉ lệ nghịch với tốc
độ làm lạnh
Số lượng bọt khí tỉ lệ thuận với tốc độ làm lạnh
Ảnh hưởng của hệ đệm bicarbonate
THUYẾT HAI YẾU TỐ
Quy trình đông lạnh-
giải đông tối ưu
Tổn thương
“dung dịch”
Tổn thương
đá nội bào
Tốc độ làm lạnh
Sức sống
ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH ĐẾN
TẾ BÀO
Hiện tượng Phản ứng của tế bào
Giảm nhiệt độ Biến đổi lipid màng
Giải trùng hợp bộ xương tế bào
Tăng nồng độ chất hòa tan Co thẩm thấu
Tăng nồng độ ion Tác động trực tiếp lên màng tế bào, làm hòa
tan protein màng
Khử nước Mất ổn định lớp đôi lipid
Kết tủa muối Thay đổi pH dung dịch, ảnh hưởng hoạt
động của các protein
Sự hình thành bọt khí Tổn thương cơ học đối màng và bộ xương
tế bào
Dung dịch trở nên quá nhớt Hạn chế quá trình khuếch tán, thẩm thấu
Thay đổi pH Biến tính protein
Tế bào bị đặc lại Tổn thương màng
PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH
Đông lạnh chậm chương trình
(programmed slow freezing method)
Đông lạnh nhanh ba bước (stepwise
freezing method)
Đông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa)
(vitrification)
ĐÔNG LẠNH CHẬM CHƯƠNG TRÌNH
Sử dụng chất bảo quản với nồng độ thấp (1-2M)
Tốc độ làm lạnh chậm (0,1 – 5oC/phút trong giai đoạn
giảm nhiệt xuống -80C)
Hạ nhiệt tự động
Sự khử nước diễn ra suốt quá trình làm lạnh
Cân bằng giữa tốc độ nước rời khỏi tế bào và nước
chuyển sang dạng đá
Chi phí cao (máy tự động), tổn thương tế bào do tác
động của nồng độ chất tan.
ĐÔNG LẠNH BA BƯỚC
Nồng độ chất bảo quản thấp
Tốc độ làm lạnh nhanh
Hạ nhiệt: ba bước (4, -20, -80)
Khử nước không hoàn toàn, hình thành đá nội
bào
Cải tiến – Đông lạnh in situ
ĐÔNG LẠNH CỰC NHANH
(THỦY TINH HÓA)
Nồng độ chất bảo quản cao (>5M)
Tốc độ làm lạnh cực nhanh (2000-25000oC/phút)
Tế bào bị khử nước nhờ tiếp xúc với nồng độ chất bảo
quản cao, nước ở dạng băng vô định hình
Có thể ảnh hưởng đến tế bào do nồng độ chất bảo quản
cao
Quy trình thực hiện dễ dàng, nhanh chóng, chi phí thấp
BIẾN ĐỔI CỦA TẾ BÀO
KĨ THUẬT ĐÔNG LẠNH
TẾ BÀO
CHUẨN BỊ
Tế bào
Chọn phương pháp
Chất bảo quản lạnh
Môi trường đông lạnh
Dụng cụ - Thiết bị
NGUỒN TẾ BÀO
Chỉ đông lạnh những tế bào tăng sinh tốt và không nhiễm
Loại/khả năng sống, tăng trưởng/sinh lí/số lượng/phương pháp tế
bào được nuôi
Tình trạng tốt nhất (log phase, mật độ 90%)
Quan sát bên ngoài và kiểm tra nhiễm
+ Nuôi trong MT không kháng sinh vài lần trước kiểm tra
+ Quan sát trực tiếp dưới KHV
– Thay môi trường nuôi 24 tiếng trước khi đông lạnh
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG CỦA TẾ
BÀO ĐỐI VỚI MÔI TRƯỜNG
ĐÔNG LẠNH
1. Thể tích (V) và diện tích bề mặt tế bào (A)
2. Tính thấm nước của tế bào (Lp)
3. Loại và nồng độ chất bảo quản lạnh
4. Tốc độ làm lạnh (B)
PP ĐÔNG LẠNH TỐI ƯU
(Làm lạnh cân bằng)
Tỉ lệ tế bào sống cao nhất
Phương pháp
– Làm lạnh chậm để rút nước ra
khỏi tế bào
– Ngăn sự hình thành tinh thể
– Sử dụng chất bảo quản lạnh
– Nhiệt độ bảo quản dưới -130oC
– Giải đông nhanh để giảm thiểu
sự hình thành của tinh thể đá
MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH
Đệm Hepes
Huyết thanh???
Kháng sinh
Muối
Đường
Chất bảo quản lạnh
CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH
Khái niệm
Đặc tính
Phân loại
+ Chất bảo quản ngoại bào: BSA, FBS, saccharide, disaccharide
(trehalose, lac, suc), trisaccharide (raffinose), polymer (PVP,
polyethylenglycol)
+ Chất bảo quản nội bào: methanol, ethanol, ethylen glycol, 1,2-
isopropandiol, glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO)
Tác dụng
CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH
Hoạt động: khử nước và bù nước
Nồng độ thích hợp?
A. Quá trình đông lạnh
B. Quá trình tan đông
C. Quá trình bù nước
D. Quá trình tái nuôi cấy
Sự thay đổi khối lượng tế bào trong quá trình
đông lạnh/giải đông
QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH KHÔNG CHẤT BẢO QUẢN
QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH KHÔNG CHẤT BẢO QUẢN
QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH CÓ CHẤT BẢO QUẢN
QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH CÓ CHẤT BẢO QUẢN
CHẤT PHỤ TRỢ ĐÔNG LẠNH
- Không thấm vào tế bào
- Bảo vệ tế bào trong quá trình bù nước
- Thường là mono-,di- hoặc tri-saccharide
A. Quá trình đông lạnh
B. Quá trình tan đông
C. Quá trình bù nước khi có
đường Sucrose
D. Tái nuôi cấy
Sự thay đổi khối lượng tế bào trong
quá trình đông lạnh có sucrose
MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH
VÀ KIỂU TẾ BÀO
TẾ BÀO BÁM DÍNH TẾ BÀO Ở DẠNG HUYỀN
PHÙ
90% môi trường mới
10% chất bảo quản lạnh
(DMSO)
45% môi trường mới
45% môi trường cũ
10% chất bảo quản lạnh
(DMSO)
NGUYÊN LiỆU, THIẾT BỊ ĐÔNG LẠNH
Nitơ lỏng
Không màu, không mùi, không dễ cháy, không độc
Nhiệt độ -196oC (thể lỏng) và -156oC (thể hơi)
Thiết bị trữ lạnh
Tủ lạnh (4oC), tủ âm (-20oC, -80oC)
Thiết bị trữ lạnh bằng Nitơ lỏng (-196oC)
Không kiểm soát nhiệt độ
Có kiểm soát nhiệt độ
THIẾT BỊ ĐÔNG LẠNH
THIẾT BỊ DÙNG TRONG ĐÔNG LẠNH
Bể ổn nhiệt
Nhiệt độ trong bình trữ nitơ lỏng
THIẾT BỊ DÙNG TRONG ĐÔNG LẠNH
Cryotube (cryovial, ampoule)
THIẾT BỊ DÙNG TRONG ĐÔNG LẠNH
Cryotop
Straw
ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO
ĐÔNG LẠNH PHÔI
QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO
1. Kiểm tra tình trạng tế bào
2. Bảo dưỡng và thu nhận tế bào
3. Sử dụng chất bảo vệ lạnh phù hợp
4. Sử dụng dụng cụ trữ phù hợp với điều kiện đông
lạnh
5. Đánh dấu
6. Điều chỉnh tốc độ làm lạnh
7. Trữ tế bào ở nhiệt độ dưới -130oC
8. Kiểm tra mức nitơ lỏng
9. Ghi nhận định kì
QUY TRÌNH THU NHẬN TẾ BÀO
Quy trình thu nhận tế bào bám dính Quy trình thu nhận tế bào huyền phù
Loại môi trường cũ bằng cách hút bỏ Li tâm thu cặn tế bào và loại bỏ môi trường
cũ
Rửa đĩa tế bào bằng PBS vài lần Rửa tế bào bằng PBS vài lần
Tách toàn bộ tế bào khỏi đĩa nuôi bằng dung
dịch trypsin. Sau đó, bổ sung chất ức chế
protease để làm ngừng hoạt động của trypsin.
Li tâm thu cặn tế bào và loại bỏ trypsin, chất
ức chế protease
Rửa tế bào bằng PBS vài lần
Xác định số lượng tế bào sống Xác định số lượng tế bào sống
Huyền phù cặn tế bào vào môi trường ĐL Huyền phù cặn tế bào vào môi trường ĐL
Phân phối dịch tế bào vào các ống đông lạnh Phân phối dịch tế bào vào các ống đông lạnh
Chuyển các ống đông lạnh vào thiết bị làm
lạnh (tùy theo phương pháp đông lạnh)
Chuyển các ống đông lạnh vào thiết bị làm
lạnh (tùy theo phương pháp đông lạnh)
Loại môi trường cũ
Huyền phù vào môi trường đông lạnh
Tách tế bào
Li tâm thu cặn tế bào
Bổ sung vào dụng cụ đông lạnh
Đưa vào nhiệt độ đông lạnh phù hợp
Đếm mật độ tế bào
Giải đông ở 37 C
Loại môi trường bảo quản
Tái nuôi cấy trong môi trường mới
Đếm mật độ tế bào
GIẢI ĐÔNG
Rã đông nhanh
- 37oC trong bể ổn nhiệt
- Giảm thiểu sự hình thành tinh thể
Pha loãng từ từ để ngăn sốc áp suất thẩm thấu
Quá trình bù nước của tế bào
Loại chất bảo quản lạnh:
+ Thay, ủ trong môi trường mới
+ Li tâm nhẹ
QUY TRÌNH GIẢI ĐÔNG
Lấy các ống đông lạnh tế bào ra khỏi bình nitơ lỏng.
Kiểm tra cẩn thận các nhãn và nắp.
Giữ ống đông lạnh ngoài không khí khoảng 30 giây.
Đặt toàn bộ ống đông lạnh nhúng vào bình ổn nhiệt 37oC và lắc nhẹ cho
đến khi tan hết.
Rửa tế bào bằng li tâm dịch tế bào đã giải đông trong môi trường nuôi
mới.
Tái huyền phù tế bào trong môi trường mới.
Trải các tế bào vào đĩa nuôi cấy với môi trường bình thường. Mật độ tế
bào ban đầu phải cao.
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TẾ BÀO SAU
GIẢI ĐÔNG
Nhuộm xác định số lượng tế bào sống, chết
Nuôi cấy sau giải đông
Sức sống tế bào sau giải đông: tăng sinh
CÁC VẤN ĐỀ KHI ĐÔNG LẠNH
TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
1. Trong quá trình thu nhận và thao tác tế bào
+ Sự tiếp xúc giữa tế bào và chất bảo quản lạnh
+ Việc duy trì lượng lớn tế bào ở nhiệt độ phòng và pH
2. Trong quá trình làm lạnh
+ Làm lạnh quá nhanh, quá chậm hay bị gián đoạn
+ Sử dụng chất bảo quản lạnh không phù hợp hay sử dụng nồng độ chất bảo quản không thích
hợp
3. Trong quá trình trữ lạnh
+ Quá trình chuyển tế bào vào bình trữ lạnh
+ Nhiệt độ đông lạnh không được duy trì ổn định
4. Trong quá trình giải đông
+ Giải đông chậm
+ Phương pháp loại chất bảo quản lạnh không phù hợp
ĐÔNG LẠNH TINH TRÙNG
Thành tựu trong y học và chăn nuôi
Sự thay đổi của tinh trùng trong quá trình đông lạnh
- Sự nguyên vẹn của cực đầu
- Sự di động
- Khả năng thụ tinh
Dung dịch bảo quản
- Đệm pH, ASTT, bảo vệ lạnh
- CPA thấm, không thấm, đệm, muối, kháng sinh
+ DD citrate – đường
+ DD sữa loãng
+ DD dựa vào lactose
+ DD dựa vào saccharose
+ DD dựa vào raffinose
+ DD dựa vào Tris
+
ĐÔNG LẠNH TINH TRÙNG
PP đông lạnh
- Đông lạnh chậm
- Thủy tinh hóa
- Đông khô
Đông khô
- Đông lạnh, khử áp suất và bổ sung nhiệt
- Thuận lợi: nhẹ, không cần trữ lạnh, chất lượng được duy trì
- Bất lợi: chi phí cao, thời gian xử lí dài
Đông khô và đông lạnh
- Thời gian
- Chất lượng, độ di động của TT
- PP thụ tinh sau giải đông
- Chi phí
- Lưu trữ
ĐÔNG LẠNH TRỨNG
Thành tựu trong y học và chăn nuôi
Trứng được sử dụng trong đông lạnh
- Trứng trưởng thành, chưa trưởng thành, mô buồng trứng
- Trứng ở giai đoạn metaphase II và giai đoạn túi mầm
- SA/V thấp
Phác đồ đông lạnh
- Chậm – cân bằng
- Thủy tinh hóa – không cân bằng
Ứng dụng
ĐÔNG LẠNH PHÔI
PP đông lạnh
- Đông lạnh chậm
- Đông lạnh nhanh
- Thủy tinh hóa
Ý nghĩa
Quy trình chung
- Chọn phôi
- Môi trường đệm và chất bảo quản lạnh
- Nạp phôi vào dụng cụ đông lạnh
+ Cọng rạ (straw)
+ Cryoloop + Cryovial
+ Cryotop
- Thiết bị làm lạnh và đông
- Giải đông
- Đánh giá chất lượng: hình thái, khả năng sống và phát triển
ĐÔNG LẠNH PHÔI
Các ảnh hưởng
3 giai đoạn:
* 15oC đến -5oC : lipid và vi ống
* -5oC đến -80oC : tinh thể đá và màng bào tương
* -50oC đến -150oC: stress thẩm thấu và màng trong suốt
Từ phôi:
• Giai đoạn phát triển phôi: sự nhạy cảm của thoi vô sắc
• Tỉ lệ mảnh vỡ tế bào
• Kĩ thuật tạo phôi
• Tuổi của phụ nữ cho trứng
Đông lạnh tinh trùng trong màng Zona pellucida
THAM KHẢO
[1] Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2009). Bảo quản tế bào
gốc. Công nghệ tế bào gốc, NXB Giáo dục.
[2] Phạm Văn Phúc, Đỗ Ngọc Hân, Trương Hải Nhung, Đặng Hoàng Lâm, Trần
Thị Thanh Khương (2009). Công nghệ hỗ trợ sinh sản, NXB Y học
[3] Ryan JA. General guide for cryogenically storing animal cell cultures.
Corning Incorporated Life Sciences.
[4] Ryan JA. Cryogenic preservation and storage of animal cells. Corning
Incorporated Life Sciences.
[5] Özkavukcu S, Erdemli E (2002). Cryopreservation: Basic knowledge and
biophysical effects. Journal of Ankara medical school, Vol. 24, No. 4.