Kỹ thuật di truyền trong nuôi trồng thủy sản

KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢNI- NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT CHUYỂN GENII- BỘ CÔNG CỤIII- CÁC BƯỚC CỦA KỸ THUẬT CHUYÊN GENIV- ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GENI-NGUYÊN TẮCSV CHO genVECTORDNA TÁI TỔ HỢPCHUYỂN VÀO TB ĐÍCHBIỂU HIỆN GEN MONG MUỐNSƠ ĐỒ CHUYỂN GENMột số thuật ngữ: DNA tái tổ hợp = DNA lai in vitro từ 2 DNA khác nhau (đoạn DNA người “ghép” trên DNA virus hay plasmid vi khuẩn).  Tạo dòng gene: quá trình cô lập và thu nhận nhiều bản sao của một gene hay một đoạn gene.  Dòng: một số lớn tế bào hay phân tử giống nhau sinh ra từ một tế bào hay phân tử ban đầu.  Ngân hàng (thư viện): bộ sưu tập của nhiều dòng khác nhau.  cDNA: bản sao bổ sung của mRNA (không intron, nhờ retrotranscriptase)II. BỘ CƠNG CỤII.1- Các loại Enzyme: enzyme giới hạn, ligase, Phosphatase alkaline, Taq polimeraseII.2- Các loại Vector: Plasmid, Phagemid, Cosmid, Nhiễm sắc thể nhân tạoII.1- CÁC LOẠI ENZYME II.1.1- RESTRICTASE ENZYME(Enzym cắt hạn chế) Enzyme giôùi haïnCaét DNA sôïi keùp ôû nhöõng vuøng 4-6 caëp-base = vò trí giôùi haïn = trình töï thuaän nghòch theo höôùng 5’ 3’ (RADAR). TÊN GỌI CÁC ENZYME GIỚI HẠNChữ đầu viết hoa: Tên giống vi khuẩn (ly trích enzyme)Hai chữ kế không viết hoa: Tên loài VKChữ số La Mã: Thứ tự RE được phát hiệnĐôi khi có thêm chữ viết hoa sau tên loài VK là tên chủngVí dụ: Eco RI (Eco: Escherichia coli , chủng Ry13), Eco RVBacterial genusspeciesstraintypeNamed (e.g., EcoRI) for bacterial genus, species, strain, and type.RESTRICTASE ENZYME (Enzym cắt hạn chế)MỘT SỐ CÁCH CẮT CỦA ENZYM GIỚI HẠN- HpaI cắt thẳng EcoRI cắt so le- HindIII cắt so le- PstI cắt so le ( restriction enzyme) digested DNA double stranded DNACÁCH CẮT CỦA ENZYM GIỚI HẠNCohesive ends (sticky ends) COHESIVE ENDSEcoRI 5’GAATTC3’ 5’G AATTC3’ 3’CTTAAG5’ 3’CTTAA G5’PstI 5’CTGCAG3’ 5’CTGCA G3’ 3’GACGTC5’ 3’G ACGTC5’Blunt ends (flush ends) BLUNT ENDSHaeIII 5’GGCC3’ 5’GG CC3’ 3’CCGG5’ 3’CC GG5’ SẢN PHẨM CỦA CÁC ENZYME GIỚI HẠNCohesive endsEnzym cắt tạo đầu dính ( restriction enzyme) digested DNA double stranded DNAII.1.2- ENZYME LIGASEXúc tác phản ứng nối hai đầu của 2 trình tự DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase)Ví dụ: T4 DNA ligaseEnzyme ligaseXúc tác phản ứng nối hai đầu của 2 trình tự DNA II.1.3- Enzyme Alkaline Phosphatase Xúc tác sự loại bỏ nhóm 5‘ phosphate của DNA, RNA và các nucleotide tự doII.1.4- Các enzyme polymerase:DNA polymerase: DNA polymerase I, T4 DNA polymerase,Taq polymerase, Reverse transcriptase- RNA polymerase DNA POLYMERASE ENZYMEXúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5' → 3 ‘- Các DNA polymerase gồm: DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase, Reverse transcriptase (RT), Terminal transferase Tổng hợp DNARNA POLYMERASE - Xúc tác sự tổng hợp RNA theo chiều 5' → 3 ‘- Các RNA polymerase như: SP6 RNA polymerase (có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm Salmonella typhymurium) , T3 và T7 RNA polymerase (có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm vi khuẩn E.coli),RIBONUCLEASE ENZYME - Ribonuclesae là nhóm enzyme phân cắt RNA - Gồm các enzyme: Ribonuclease A ( RNase A), Ribonuclease H ( RNase H), VECTOR1- PLASMID2- COSMID3- PHAGEMID4- NST NHÂN TẠOVECTOR Vector chuyển gen là 1 phân tử DNA có khả năng tự nhân đôi, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được gen cần thiết. Vector cần có các đặc điểm: có các trình tự khởi đầu sự tự nhân đôi Ori, có các trình tự nhận biết (nơi cắt của RE), các trình tự điều hòa (promoter giúp phiên mã gen lạ), có các gen đánh dấu, đảm bảo sự bền vững của DNA tái tổ hợp trong TB đíchGen INSULIN của người xen vào plasmid Vi khuẩnSmall DNA molecule Circular DNA moleculeCan be considered as a minichromosome able to self-replicateAllows antibiotic resistance II.2.1- VECTOR LÀ PLASMIDPlasmid: là những đoạn DNA ngắn(2-5kb), dạng vòng, nằm ngoài NST, tim thấy đầu tiên ở VK. Đặc điểm plasmid: có khả năng tự nhân đôi, có điểm khởi đầu Ori, có mang các gen kháng kháng sinh hay gen dùng đánh dấu.Chuyên chở đoạn gen có kích thước 5-10 kbThí dụ: pPR322, pVT46, pUC 18Cấu trúc của pBR322 CẤU TRÚC CỦA PLASMID pBR322Structure of pBR322 - a common cloning vector derived from a naturally occurring plasmid has antibiotic resistance genes for selection of transformants containing the plasmid has unique restriction enzyme cleavage sites for insertion of foreign DNA has origin of DNA replication (ori) for propagation in E. coliEcoRISal I gene for ampicillinresistancegene for tetracycline resistancePst IoriPLASMID pUC18/19 VECTOR PLASMID VỚI 4 ĐOẠN DNAII.2.2 PHAGEMID Các phage là virus xâm nhiễm và làm phân giải vi khuẩn. Phase làm vector có các ưu điểm: - Hiệu quả xâm nhiễm cao ( có hệ thống giúp xâm nhiễm VK và sinh sản nhanh) - Chuyển đoạn gen có kích thước lớn(10- 20 kb) Các phage như Phage ג, Phage M13 l Phage cycle1.2.2. Phages sử dụng như vectorsl Phage cyclePHAGE LÀ VECTORBacteriophage genomeCloning with a λ insertion vectorCloning in l phage Lambda bacteriophage Viral linear DNA until ~20 kb Or lambda phage (bacteria)Cosmide Hybride de plasmide jusqu’à ~50 kb (bactérie) et de phageYAC or Yeast artificial ADN contenant ~200 à ~1000 kbChromosome telomères, (levure) et origines de réplication de levurecentromère,Vector (and host) CharacteristicsInsert lengthPlasmid Little circular DNA <5 - 10 kb (bacteria, yeast)Usual cosmidCOSMID LÀ VECTORII.2.3- COSMID Cosmid là những vector nhân tạo được ghép nối giữa plasmid và trình tự cos của phage ג. Các trình tự này giúp đóng gói DNA tái tổ hợp vào phần đầu của phage. Sau khi đóng gói phage xâm nhập vào VK. Trong tế bào VK phage hoạt động như 1 plasmid và không phá vỡ VK (tạo khuẩn lạc) Cosmid chuyển đoạn gen 20- 50kbCloning by cosmidsCosmid Hybrid plasmid until ~50 kb (bacteria) and phageYAC or Yeast artificial ADN contenant ~200 à ~1000 kbChromosome telomères, (levure) et origines de réplication de levurecentromère, Lambda bacteriophage Viral linear DNA until ~20 kb Or lambda phage (bacteria)Vector (and host) CharacteristicsInsert lengthPlasmid Little circular DNA <5 - 10 kb (bacteria, yeast)II.2.3- NHIỄM SẮC THỂ NHÂN TẠONhiễm sắc thể nhân tạo là vector mới cho phép chuyển đoạn gen có kích thước từ 200-1000 kb.Các NST nhân tạo gồm NST nhân tao của nấm men YAC (Yeast Artificial Chromosome), NST nhân tạo của động vật hữu nhũ MAC (Mammifere Artificial Chromosome)Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC (Yeast Artificial Chromosome) muốn nhân đôi và phân ly cần 3 trình tự: TEL (Telomeric Sequence) trình tự đầu cuối của NSTCEN (Centromeric Sequence) trình tự trung tâm của NSTARS (Autonomous Replicating Sequence) trình tự sao chép tự chủSau khi nhận gen các NST nhân tạo này sẽ được đưa vào nấm men bằng phương pháp biến nạp.1.2.4. YAC as cloning vectorsCÁC VECTOR THƯỜNG SỬ DỤNGYAC or Yeast artificial DNA chứa centromere CEN,Telomeres TEL và yeast replication origin ARS ~200 à ~1000 kbChromosome (yeast)CosmidLai plasmid until ~50 kb (bacteria) và phage Lambda bacteriophageDNA virus, thẳng until ~20 kb Or lambda phage (bacteria)Vector (và TB chủ)Đặc điểm VectorĐoạn gen chuyểnPlasmidDNA nhỏ, vòng <5 - 10 kb (bacteria, yeast)Two plasmids designed as vectors for DNA cloningIII- CÁC BƯỚC CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GENBước 1: Thu nhận genBước 2: Chọn vectorBước 3: Tạo DNA tái tổ hợpBước 4: Chuyển DNA tái tổ hợp vào TB đích Bước 5: Chọn dòng TB có DNA tái tổ hợpBước 6: Tạo dòng TB có DNA tái tổ hợpBước 7: Biểu hiện gen mong muốnBước 1: Thu nhận genCó 3 phương pháp: - Thu nhận gen từ bộ gen (genom) - Thu nhận gen bằng con đường tổng hợp hóa học - Thu nhận gen từ mRNA với enzyme phiên mã ngược Thu nhận gen từ bộ gen (genom) Thu nhận gen từ bộ gen là sử dụng các enzyme RE cắt bộ gen ra thành những gen rời và trích đoạn gen mong muốn ra khỏi genom. Thí dụ: Bộ gen người có khoảng 30.000 gen, xác suất để có 1 gen mong muốn là 1/30.000. Thu nhận gen với phương pháp này tốn thời gian, chi phí nhiều. Phương pháp này được sử dụng để lập ngân hàng DNA của bộ gen (Bank of genomic DNA) hay thư viện của DNA bộ gen (Genomic DNA libraries). Thí dụ ngân hàng bộ gen người: Cắt Genom thành các đoạn dài 300.000-400.000pb gắn vào NST nhân tạo của nấm men (YAC) để tạo dòng, từ các dòng này tạo các đoạn 30.000- 40.000pb với các vector cosmid và sau cùng tạo các đoạn trung bình 4.000pb với plasmid để giải trình tự chuỗi DNA này. Thu nhận gen bằng con đường tổng hợp hóa học Gồm các bước: - Xác định trình tự gen - Tổng hợp các đoạn oligonucleotides (3- 16 Nucleotide) - Nối các đoạn oligonucleotides với enzyme DNA ligase. Năm 1977, Itakura và Boyer tổng hợp được gen mã hóa hormone somatostatine gồm 14 amino acid và biểu hiện trong E.coli (tạo 3 triệu phân tử hormon tăng trưởng của người/TB E.coli ) Thu nhận gen từ mRNA với enzyme phiên mã ngược mRNA của các SV dễ ly trích. Từ phân tử mRNA dùng enzyme sao mã ngược Retrotranscriptase để tạo cDNA ( đoạn DNA có trình tự bổ sung với mRNA – c = comlpementary), tổng hợp DNA kép (đoạn gen mong muốn) Phương pháp này ít tốn thời gian, chi phí và thông tin nhận được chính xác mRNA → cDNA → DNA kép (DNA 2 mạch hay gen)Bước 2: Chọn vector Sau khi thu nhận gen, tùy theo kích thước gen chọn vector thích hợp. Thí dụ đoạn gen có kích thước 5- 9kb chọn vector plasmid. Chọn Nhiễm sắc thể nhân tạo là vector nếu chuyển đoạn gen có kích thước từ 200-1000 kb.Bước 3: Tạo DNA tái tổ hợp Từ gen và vector phù hợp người ta tạo các DNA tái tổ hợp bằng các enzyme công cụ. Thí dụ sử dụng enzyme cắt hạn chế EcoRI để cắt gen và plasmid, sau đó dùng DNA ligase nối gen và plasmid tạo DNA tái tổ hợp. Enzyme cắt hạn chế EcoRI để cắt gen và plasmid tạo 2 đầu dính tương ứng. Vì vậy sau đó người ta có thể nối chúng bằng enzyme DNA ligase tạo DNA tái tổ hợp.Xen DNA vào plasmidBước 4: Chuyển DNA tái tổ hợp vào TB đích Sau khi tạo DNA tái tổ hợp, người ta chuyển DNA tái tổ hợp này vào tế bào đích. Các phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào đích: phương pháp biến nạp, phương pháp dung hợp, phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium, phương pháp điện xoi (Electroporation), phương pháp bắn gen, phương pháp vi tiêmPhương pháp biến nạp Nếu chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn người ta sử dụng phương pháp biến nạp. Sử dụng dung dịch Clorur calcium CaCl2 cho vào môi trường nuôi cấy tế bào E. coli sau đó để vào tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC trong 12 giờ. Với phương pháp biến nạp người ta có thể chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn Phương pháp dung hợp 1960 Barski thực hiện sự dung hợp các tế bào thể hệ giữa 2 dòng chuột. Tế bào lai mang cả 2 bộ NST của cha mẹ. Sau đó hiện tượng dung hợp thực hiện với nhiều cặp tế bào, kể cả các cặp tế bào có nguồn gốc xa nhau (người và chuột). Phương pháp dung hợp gồm: phương pháp hóa dung hợp, phương pháp điện dung hợp Phương pháp hóa dung hợp Trộn 2 kiểu tế bào trần trong một dung dịch đậm đặc polyethylen glycol PEG (25-40%) và dung dịch CaCl2 0,3M. Hiệu quả phương pháp hóa dung hợp không cao khoảng 20%( nếu trộn 2 kiểu tế bào trần với tỷ lệ bằng nhau sẽ có 10% tế bào trần là các tế bào lai). 80% TB trần nằm trong chuỗi, 50% TB trần nằm trong chuỗi dung hợp nhưng chỉ có 20% là dung hợp đôi (sản phẩm có ý nghĩa)Phương pháp điện dung hợp Nguyên tắc: khi đặt các tế bào trần trong 1 điện trường cao tần, chúng sẽ xếp thành chuỗi (các TB nằm cạnh nhau như chuỗi hạt). Sau đó dùng 1 xung điện ngắn để gây các vết đứt trên màng, sự dung hợp có thể sẽ xảy ra ở những nơi các tế bào trần tiếp xúc nhau Cô lập, nuôi cấy và dung hợp tế bào trầnSản phẩm dung hợpPhương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium Trong tự nhiên hiện tượng chuyển gen xảy ra nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (chứa plasmid Ti) tạo mô bướu ở mức cổ rễ, vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes làm xuất hiện nhiều rễ con ở vị trí vết thương (chứa plasmid Ri). Trong thực nghiệm nếu đưa các VK này vào cây thích ứng sẽ dẫn tới sự xuất hiện mô bướu hay rễ. Như vậy có sự truyền, gia nhập và biểu hiện 1 phần của plasmid Ti hay Ri trong bộ gen nhân của TB thực vật. Người ta áp dụng kỹ thuật chuyển gen thiên nhiên này trong thực nghiệm (có kiểm soát) Phương pháp bắn genNguyên tắc: Cơ sở vật lý: Phân tử DNa đoực bắn với tốc độ lớn vào tế bào để vượt qua các vật cản (vách, màng) và có thể xen vào bộ gen của tế bào đích. Cơ sở sinh học: Màng tế bào có tính dẽo hoàn hão với khả năng tái cấu trúc dễ dàng sau khi bị tổn thương. Nhờ phương pháp đánh dấu người ta theo dõi được phân tử DNA trong tế bào Bộ máy và cách vận hành: * Cố định các phân tử DNA trên bề mặt các hạt vàng hay Tungsten nhờ lực hút tĩnh điện( hỗn hợp hạt Tungsten trong glycerol + dung dịch DNA). * Đặt 1 giọt 2µl chứa các vi hạt tungsten được phủ DNA vào hốc của viên đạn lớn. * Đưa viên đạn lớn vào vào thân súng bắn gen (giọt Tungsten quay xuống dưới) * Đặt ngòi nỗ vào thân súng, phía trên viên đạn lớn. * Kích hoạt ngòi nỗ bằng cách lên cò và bấm cò súng. Sự nỗ tạo một áp lực mạnh làm tung viên đạn lớn đi tới một mức chận. Mức chận được đặt xa viên đạn lớn trước khi bắn (khoảng cách này được tính toán trước). Sự cản trở này làm viên đạn xẹp xuống và tung các viên đạn nhỏ là các hạt Tungsten đi tới các TB đích với vận tốc 150-200km/giờ. Phương pháp vi tiêm Phương pháp này thường sử dụng để chuyển gen ở động vật. Ở phương pháp này DNA được bơm thẳng vào hợp tử ở giai đoạn nhân non (pronucleus) Bước 5: Chọn dòng TB có DNA tái tổ hợp Sau khi chuyển được DNA tái tổ hợp vào TB đích chúng ta phải tiến hành chọn lọc dòng tế bào có mang DNA tái tổ hợp. Nhờ vào các gen đánh dấu chúng ta có thể xác định dòng tế bào có DNA tái tổ hợp. Thí dụ: nếu sử dụng plasmid có gen kháng Amp và Tet (AmpRvà TetR), nếu xen gen lạ vào giữa gen TetR thì dùng môi trường có Ampicycline và không có Tetracycline làm môi trường chọn lọc dòng tế bào có DNA tái tổ hợp. Selection with pBR322CHỌN LỌC DNA TÁI TỔ HỢP Thí dụ: nếu sử dụng plasmid có gen kháng Amp và gen Lac Z (AmpR và Lac Z), xen gen lạ vào giữa gen Lac Z thì dùng môi trường có Ampicycline và có chất X- Gal làm môi trường chọn lọc dòng tế bào có DNA tái tổ hợp. Vi khuẩn có mang gen Lac Z có thể sử dụng đường Lactose nhờ enzyme β- galactosidase. Chất X-Gal cũng được VK này sử dụng (tạo màu xanh dương bleu).Structure of pBR322Selection with pUC18CHỌN LỌC DNA TÁI TỔ HỢPVỚI pUC18Two plasmids designed as vectors for DNA cloning Bước 6: Tạo dòng TB có DNA tái tổ hợp Sau khi chọn lọc được dòng tế bào có DNA tái tổ hợp chúng ta phải tiến hành nuôi cấy dòng tế bào này bằng các môi trường thích hợp. Nuôi cấy dòng tế bào có DNA tái tổ hợpBước 7: Biểu hiện gen mong muốn Sau khi tạo được dòng tế bào có DNA tái tổ hợp chúng ta phải biểu hiện được gen mong muốn. Thí dụ: Chuyển gen Insulin của người vào tế bào E. coli , E. coli phải sản xuất được Insulin của người. chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào thực vật thì cây con phải có tính kháng thuốc trừ cỏ.SƠ ĐỒ KỸ THUẬT CHUYỂN GEN ở TẾ BÀO VI KHUẨN E. COLIThermic shock at 42°CComplete procedureỨng dụng: Chuyển gene somatotropin bò1994, Monsanto tạo somatotropin bò (hormone) để cho vào thức ăn và làm tăng sản lượng sữa.Các nhà CNSH tin tưởng somatotropin bò không có hại, vì nó là protein bị tiêu hóa trong dạ dày (?) Sản xuất somatotropin (1) Plasmid E. coli + RE(2) Cô lập gene BST (3) Xen vào plasmid (4) Đưa plasmid trở lại vi khuẩn.(5) Vi khuẩn tăng trưởng trong bể lên men.(6) Ly trích somatotropin từ vi khuẩn(7) Cho somatotropin vào thức ăn của bò sữa.